CARACTERIZAÇÃO DE scfv SELECIONADO CONTRA PROTEÍNAS DE Meloidogyne incógnita A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA DE PHAGE DISPLAY *

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1 CARACTERIZAÇÃO DE scfv SELECIONADO CONTRA PROTEÍNAS DE Meloidogyne incógnita A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA DE PHAGE DISPLAY * Liziane Maria de Lima (Embrapa Algodão / liziane@cnpa.embrapa.br), Pedro Manoel M.M. Vieira (Universidade de Brasília), Arnubio Jimenez Valencia (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Regina Maria D.G. Carneiro (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia), Andréa Querioz Maranhão (Universidade de Brasília), Marcelo de Macêdo Brígido (Universidade de Brasília), Maria Fátima Grossi de Sá (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia/ fatimasa@cenargen.embrapa.br) RESUMO - O algodão (Gossypium hirsutum) sofre perdas significativas na sua produção, devido ao ataque de fitonematóides, especialmente o Meloidogyne incognita. Os nematóides pertencentes ao gênero Meloidogyne são responsáveis por cerca de 95% das infecções causadas por nematóides das galhas, provocando perdas que podem atingir mais de $125 bilhões/ano na agricultura mundial. O estabelecimento do parasitismo se deve principalmente às proteínas secretadas a partir das glândulas esofágicas dos nematóides J2, acompanhado de extensiva sinalização entre o nematóide e a planta hospedeira. Com o objetivo de identificar proteínas de nematóides envolvidas no processo do parasitismo, foi construída uma biblioteca phage display de anticorpos. A biblioteca gerou 1,4 x 10 7 genes, clonados no vetor pcomb3x, que foram submetidos a cinco ciclos de seleção contra extrato total de proteínas e proteínas secretadas de nematóides. Após o processo de seleção, os clones reativos foram detectados em um ELISA policlonal. Os experimentos de seleção de clones individuais também foram realizados. Após o seqüenciamento de DNA e análise das seqüências, seis clones foram identificados. O clone scfv C5 foi expresso em sistema heterólogo de bactérias, biotinilado e utilizado em western blot com proteínas de nematóides, no qual revelou três bandas protéicas com 30, 19 e 13 kda. Palavras-chave: algodão, nematóides J2 e anticorpos. INTRODUÇÃO O algodoeiro (Gossypium sp.) é uma das principais culturas mundiais e coloca o Brasil entre os maiores produtores de algodão do mundo, tanto pela produção de fibras vegetais como de sementes, estando inserido entre os mais importantes produtos do grupo das fibras (RICHETTI e MELO FILHO, 2001). A planta de algodão é susceptível ao ataque de diversas pragas e patógenos que podem causar danos a diferentes partes da planta. Além disso, o algodão sofre perdas significativas na sua produção, devido ao ataque de fitonematóides, especialmente o Meloidogyne incognita. Os nematóides são patógenos cosmopolitas capazes de infectar as raízes de mais de 3000 espécies de plantas, em diferentes graus (BIRD, 2004; LEDGER et al., 2006). As estratégias de alimentação dos nematóides se estende desde a simples herbivoria até a formação de sítios de alimentação permanente nos tecidos do hospedeiro (BIRD, 2004). Para isso, eles têm desenvolvido uma complexa relação com seus hospedeiros, na qual envolvem proteínas expressas a partir de genes relacionados ao parasitismo, principalmente as proteínas secretadas pelas glândulas esofágicas * Suporte financeiro:capes, CNPq, FIALGO, FACUAL e EMBRAPA.

2 (HUSSEY et al., 2002). Essas proteínas são secretadas durante a migração do nematóide através da raíz e incluem várias enzimas que são responsáveis pela degradação ou modificação das células do hospedeiro, além de outros produtos secretados cujas funções ainda não foram definidas (SEMBLAT et al., 2001). Diante da importância das proteínas secretadas pelas glândulas esofágicas no estabelecimento do parasitismo dos fitonematóides, estratégias podem ser empregadas utilizando essas proteínas como alvo para impedir ou diminuir o desenvolvimento desses parasitas nas raízes das plantas. Algumas técnicas biológicas vêm sendo desenvolvidas utilizando anticorpos, produzidos contra proteínas secretadas pelos nematóides, capazes de interferir na infecção do nematode e/ou no desenvolvimento do parasitismo. A metodologia de phage display foi utilizada neste trabalho com o objetivo de desenvolver variantes de anticorpos scfv (Single Chain Fragment Antibody), a partir de galinhas, específicos às proteínas envolvidas no parasitismo de nematóides. MATERIAL E MÉTODOS Nematóides - Juvenis no segundo estádio (J2) de M. incognita raça 3 foram obtidos a partir de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv.) infectadas. As massas de ovos foram coletadas como descrito por Hussey e Barker (1973). Os J2 foram estimulados a secreção com 5-methoxy-N,N-dimethyl tryptamine (DMT, Sigma) 0,2 mg/ml por 12 h a temperatura ambiente. Em seguida os nematóides foram centrifugados a x g 5 min e as secreções protéicas coletadas no sobrenadante e armazenadas a -20ºC. As larvas foram homogeneizadas na presença de PBS ph 7,2, centrifugadas a x g 10 min 4ºC, os sobrenadantes coletados e armazenados a -20 C (Curtis, 1996). Imunização das galinhas - Três galinhas da raça white leghorn foram imunizadas com 200 µg de extrato protéico total e proteínas de secreção de J2 misturado ao reagente de Freud s (Sigma), foram administradas um total de cinco injeções. Construção da biblioteca de scfv O RNA foi extraído a partir dos baços das galinhas imunizadas utilizando o reagente TRIZOL (Invitrogen) e utilizado para a síntese de cdna com o Access Quick RT- PCR system kit (Promega). A primeira fita de cdna foi usada como molde para a síntese dos genes das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de acordo com a metodologia descrita por Andris-Widhopf e colaboradores (2000) e, em seguida, foi realizada a construção da biblioteca combinatória de scfv do tipo phage display (Barbas III et al., 2001). Seleção dos fagos - Foram realizados cinco ciclos de seleção contra proteínas totais e proteínas de secreção de J2, e em seguida foi realizado um ensaio de ELISA policlonal com o pool de fagos a partir de cada ciclo. Os fagos apresentando na sua superfície moléculas scfv, com capacidade de reconhecimento às proteínas de J2, foram selecionados e as seqüências nucleotídicas reveladas por sequenciamento. Expressão do scfv recombinante e biotinilação Após a seleção, o scfv C5 foi escolhido entre os anticorpos selecionados e induzido a expressão em sistema heterólogo de bactérias XL1-Blue com isoporpyl-β-d-thio-galactopiranoside 2,5 mm (IPTG Promega) (Scott e Barbas III, 2000). O scfv solúvel foi marcado com biotina utilizando EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (Pierce). SDS-PAGE e Western blot As amostras de antígenos de J2 de M. incognita foram preparadas como descrito por Fioretti e colaboradores (2001) e separadas em gel unidimensional de SDS-PAGE 12% de acordo com a metologia descrita por Laemmli (1970). Em seguida, foi realizado o experimento de

3 Western blotting seguindo o protocolo padrão (Sambrook et al., 1989), utilizando o scfv C5 como anticorpo primário e a fosfatase alcalina conjugada a estreptavidina (Pierce) como ligante secundário, e o ensaio revelado com substrato apropriado. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os scfvs gerados foram clonados no vetor fagomídeo pcomb3x, resultando em uma biblioteca de 1,4 x 10 7 scfvs, um número considerável de formas variantes para reconhecer um número equivalente de epítopos. O processo de seleção foi realizado com cinco ciclos. No terceiro ciclo observou-se um enriquecimento da biblioteca de 10 4 no título de saída, sugerindo um enriquecimento dos fagos expressando scfvs específicos aos antígenos alvo (Tab. 1). Esse enriquecimento foi confirmado por ELISA (Fig. 1). A maior resposta foi observada no terceiro ciclo, exatamente, quando foram utilizadas as proteínas de secreção para a seleção. A biblioteca do tipo phage-display permite selecionar, rapidamente, ligantes específicos com afinidade alta e definida, imitando a seleção de células B in vitro (Barbas III et al., 1991). Tabela 1. Seleção dos fragmentos de anticorpos scfv de galinha contra proteínas de nematóide M. incognita. Ciclo Sensibilização Lavagem TE* TS* TE/TS 1 PT: 254 mg PT: 254 mg SE: 49 mg SE: 49 mg SE: 49 mg PT: proteínas totais; SE: proteínas secretadas e excretadas; TE: título de entrada; TS: título de saída; *os títulos de entrada e de saída foram calculados em ufc (unidade formadora de colônia/ml). Abs (405 nm) 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 SN PT HSA 0 S/S 1º 2º 3º 4º Ciclos de s e le ção Figura 1. ELISA policlonal com os fagos selecionados de cada ciclo. Reatividade dos fagos antes da seleção (S/S) e até o 4º ciclo da seleção. Foi usado como controle negativo uma proteína não relacionada (albumina de soro humano). SN - proteínas de secreção de nematóides; PT - extrato total de proteínas e HSA - albumina de soro humano.

4 A partir dos anticorpos seqüenciados foram selecionados seis anticorpos. A composição de aminoácidos de cada gene foi predita e as CDRs (Região Determinante de Complementariedade), segundo Kabat, foram determinadas para as cadeias leve e pesada (Tab. 2). Tabela 2. Predição das seqüências de aminoácidos que compõem as CDRs das cadeias leves e pesadas dos clones scfv selecionados. CLO CDR L1 CDR L2 CDR L3 CDR H1 CDR H2 CDR H3 C2 SGGSGSYG SNNQRPSN GSFDRTGGNVSI GFTFSDRGMC SNTGRHTKYG GTSGYSNSVGEIDV C5 SGGYSGYG DNTNRPSD GSYDSSAGYVAI GFTFSDRGMY SNTGRHTKYG GTSGYSNSVGEIDV C11 SGGYNY NNDKRPSD GAYDNTEAYAGI GFTFSDRGMY SGSSGRTHKYG GTSGYSNSVGEIDV F5 SGTSGNYG YNDKRPSN GSFDRTGGNVGI GFTFSDRGMY SNTGRHTKYG GTSGYSNSVGEINV B1 SGSNVYGYG ANTNRPSN GGYDDSTGGNVGI GFTFSDRGMY SNTGRHTKYG GTSGYSNSVGEIDV G12 SGGSGSYG SNNQRPSN GSFDRTGGNVGI GFTFSDRGMY SNTGRHTKYG GTSGYSNSVGEIDV CLO Clones; L cadeia leve; H cadeia pesada. Dentre os anticorpos selecionados, o scfv C5 foi expresso em sistema heterólogo de bactéria. A expressão foi confirmada por western blot (Fig. 2A), submetido a biotinilação (Fig. 2B) e utilizado no ensaio de western blot usando uma mistura de proteínas totais e proteínas de secreção de J2 de M. Incognita. Esse ensaio revelou três bandas protéicas com 13, 19 e 30 kda, aproximadamente, reconhecidas pelo anticorpo scfv C5 (Fig. 2C). O gene que codifica para a molécula de scfv, com afinidade para proteínas de nematóides, tem potencial para aplicação na agricultura com efeito antinematóides. A M C5 C- B C 30 kda - M C5-30 kda - 19 kda - 13 kda Figura 2. (A) Western blotting com scfv C5 expresso em sistema heterólogo de bactéria usando antihis conjugado a fosfatase alcalina; (B) Dot blot com scfv C5 biotinilado; (C) Western blot com uma mistura de proteínas total e proteínas de secreção de J2 usando scfv C5 biotinilado. M Marcador de peso molecular; C5 scfv C5; C- Controle negativo. CONCLUSÃO A partir da biblioteca de phage display foram selecionados seis anticorpos específicos às proteínas de secreção de nematóides. O scfv C5 foi eficientemente expresso em bactéria e apresentou afinidade por proteínas presentes nos nematóides.

5 CONTRIBUIÇÃO PRÁTICA E CIENTÍFICA DO TRABALHO A metodologia empregada neste trabalho mostrou-se eficiente e pode ser utilizada para a seleção de outros tipos de moléculas como: inibidores e enzimas. Este trabalho identificou genes que codificam para fragmentos de anticorpos com capacidade de reconhecer proteínas presentes em nematóides parasitas de plantas. Esses genes podem ser utilizados como ferramentas no controle desses parasitas em diversas culturas, por meio da transformação genética de plantas. Alguns trabalhos de transformação de plantas vêm utilizando genes que codificam anticorpos para torná-las resistentes a patógenos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRIS-WIDHOPF, J.; RADER, C.; STEINBERGER, P.; FÜLLER, R.; BARBAS III, C.F. Methods for preparation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. Journal Immunological Methods, v. 242, p , BARBAS III, C.F.; BURTON, D.R.; SCOTT, J.R.; SILVERMAN, G.J. Phage display: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor laboratory Press, BIRD, D.M. Signaling between nematodes and plants. Current Opinion in Plant Biology, v. 7, p , CURTIS, R.H.C. Identification and in situ and in vitro characterization of secreted proteins produced by plant-parasite nematodes. Journal of Parasitology, v. 113, p , FIORETTI, A.; AMIOT, C.; DION, C.M.; DULIEU, O.; MAZZONI, M.; SMIRNE, G.; GABBANINI, C. Cold rubidium molecule formation through photoassociation: A spectroscopic study of the long-range state of Rb. Eur. Phys. Journal, v. 15, p , HUSSEY, R.S.; BARKER, A.A. Comparation methods of colleting inocula of Meloidogyne spp. incluind a new technique. Plant Disease Reporter, v.57, p , HUSSEY, R.S.; DAVIS, E.L.; BAUM, T.J. Secrets in secretions: genes that control nematode parasitism of plants. Brazilian Journal Plant Physiology, v. 14, p , LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p , LEDGER, T.N.; JAUBERT, S.; BOSSELUT, N.; ABAD, P.; ROSSO, M.N. Characterization of a new β- 1,4-endoglucanase gene from the root-knot nematode Meloidogyne incognita and evolutionary scheme for phytonematode family 5 glycosyl hydrolases. Gene, v. 382, p , RICHETTI, A.; MELO FILHO, G.A. Aspectos econômicos do algodoeiro. In: EMBRAPA AGROPECUÁRIA OESTE (Dourados,MS). Algodão: tecnologia de produção. Campo Grande: Embrapa Agropecuária Oeste; Campina Grande: Embrapa Algodão, p SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. SCOTT, J.K.; BARBAS III, C.F. Phage display vectors. In: Phage display laboratory mannual. New York: Cold. Spring Harbor Laboratory Press, p SEMBLAT, J.P.; ROSSO, M.N.; HUSSEY, R.S.; ABAD, P.; Castagnone-Sereno, P. Molecular cloning of a cdna encoding an amphid-secreted putative avirulence protein from the root-knot nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant Microbe Interaction, v. 14, p , 2001.