Anticorpos Recombinantes:
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- Sarah Lima Miranda
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1 Anticorpos Recombinantes:
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8 Variabilidade estrutural dos Anticorpos 8
9 Variabilidade na VH e VL
10 Joao Goncalves 2007 (MIT-IST) 10
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12 Porque é que os anticorpos necessitam de uma região Fc? O fragmento (Fab) 2 pode: Detectar o antigénio Precipitar o antigénio Bloquear os sitios activos de toxinas, mediadores imunológicos ou proteínas derivadas de agentes infecciosos. Mas não podem activar: Funções inflamatórias e efectoras associadas a células Funções inflamatórias e efectoras associadas ao complemento 12
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14 Vantagens dos anticorpos monoclonais como terapia Especificidade de reconhecimento de antigénios Elevada eficácia de ligação Farmacocinética consistente Maior rapidez na progressão do desenvolvimento dos fármacos Uma elevada gama de alvos terapêuticos Diversidade no modo de acção Antagonista Agonista Direccionamento da acção farmacológica 14
15 Desvantagens dos anticorpos monoclonais Necessária a identificação de antigénios específicos Eficácia varia conforme a expressão dos antigénios Acesso dificultado a tumores sólidos Imunogenicidade (segurança e toxicidade) Resposta celular (quando desnecessária!) 15
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19 Aplicações dos Anticorpos Monoclonais: Purificação de proteínas Identificação e isolamento de sub-populações utilizando o FACS. Detecção de tumores e imagiologia Destruição de tumores Reagentes de diagnóstico Desintoxicação de fármacos Anticorpos catalíticos
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23 Anticorpos Policlonais Anticorpos totais a partir do soro de animais imunizados Reconhece múltiplas regiões (epitopos) do antigénio utilizado Monoclonais Hibridomas individuais clonados que expressam um tipo de anticorpo. Anticorpos expressos são purificados do meio de cultura celular Reconhecem UMA única região do antigénio
24 Hybridoma medium. Only the hybridoma cells have got the ability to divide and proliferate on the HAT medium (Hypoxanthine Aminopetrin Thymidine) because genome from the B- lymphocyte makes them HGPRT positive and genome from the myeloma cells they can divide indefinitely. Thus only the hybridoma cells or fused cells are selected using selective media called as HAT medium.
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26 A resposta humoral aos Anticorpos terapêuticos pode alterar negativamente a sua eficácia e segurança. Reacções de hipersensibilidade Baert et al, J Immun,
27 The problem: Immunogenicity of monoclonal antibodies Infliximab (Remicade) 27
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29 Tecnologia de ADN recombinante: Manipulação genética de anticorpos 29
30 1. Humanização a. Clonar o CDR de anticorpos de rato nas frameworks dos anticorpos humanos. b. Produção a partir de bibliotecas de anticorpos humanos c. Obtenção de anticorpos humanos a partir de ratos transgénicos de Ig humanas.
31 Transferência das CDR do anticorpo do rato para um anticorpo humano VH rato CDR1 CDR2 CDR3 VH humano CDR de rato em humano = Humanização 31
32 Humanização de anticorpos de rato Rato Humanos Ac de rato Ac quimérico Ac Humanizado Ac Humano Colocar as CDR dos anticorpos de Rato numa estrutura de IgG humana Mouse Ab Human Ab 32
33 1. Humanização a. Clonar o CDR de anticorpos de rato nas frameworks dos anticorpos humanos. b. Produção a partir de bibliotecas de anticorpos humanos c. Obtenção de anticorpos humanos a partir de ratos transgénicos de Ig humanas.
34 Engenharia de Anticorpos Anticorpos 2ª Geração Clonagem e expressão de genes de anticorpos Bibliotecas de anticorpos - humanos, ratos, tubarões - fagos, bactérias, leveduras 34
35 Bibliotecas de genes de anticorpos Construção de bibliotecas de anticorpos - Sequências de ADN que codificam os domínios V H e V L são amplificadas por PCR - Domínios V H e V L são juntos aleatoriamente, aumentando a diversidade funcional da biblioteca - As sequências do scfv final são amplificadas por PCR utilizando primers que contêm sites de restrição. - Clonagem em vectores apropriados 35
36 Selecção Fágica Apresentação combinatória de proteínas por fusão com proteinas do revestimento do fago. Tecnologia excelente para identificar interacções entre duas proteínas. Uma das técnicas mais importantes para gerar proteínas terapêuticas precursoras. Arquitectura do Fago filamentoso 36
37 Anticorpos recombinantes feitos por apresentação por fagos V H Gene III V L Expression Plasmid - Phagemid Escherichia coli Gene III C L V L C H1 V H
38 Selecção de bibliotecas de anticorpos Washes Sequence Winner
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40 Testar afinidade e especificidade Ensaios imuno-enzimáticos (EIA) Western blot Determinar a sequência de ADN 40
41 1. Humanização a. Clonar o CDR de anticorpos de rato nas frameworks dos anticorpos humanos. b. Produção a partir de bibliotecas de anticorpos humanos c. Obtenção de anticorpos humanos a partir de ratos transgénicos de Ig humanas.
42 State of the art technology: Transgenic mice Inactivation of genes by specific deletion Antibody genes introduced by artificial chromossomes (Abgenix, Medarex) Fully human antibodies (Golimumab, Denosumab, Ustecinumab, Canecinumab) High binding affinity and stability 42
43 State of the art technology: Transgenic mice Antigen Linf B Evaluation of cellular epitopes Cloning IgG Expression in animal cells Production Formulation Shealy et al, Mab
44 Improved development of antibodies! Restore proper B- cell development and antibody production Generated antibodies also demonstrated high potency in blocking the in vitro and in vivo biological effects Transgenic Mice Favorable pharmacokinetic s mabs of high affinity as a result of the broad and diverse utilization of the variable genes and the efficient hypermutation. Low Immunogenicity High stability 44
45 Imunoglobulinas (Anticorpos) Categorização dos Anticorpos Terapêuticos Sufixo geral ( mab) Anticorpos de rato (omab) Anticorpos quiméricos (imab) Anticorpos humanizados (zumab) 45
46 Produção Industrial de Ac recombinantes 46
47 Formulação final dos Anticorpos 47
48 Vantagens dos Ac terapêuticos recombinantes A tecnologia de ADN recombinante permite: Diminuir a imunogenicidade e melhorar a farmacocinética do Anticorpo Controlar a afinidade e especificidade do Anticorpo Manipular a estrutura proteica do Anticorpo Controlar as funções imunitárias efectoras do hospedeiro (ADCC e CDC) Produção recombinante em bactéria e leveduras 48
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50 Improving biopharmaceutical benefits Bi-specific mab Glyco-Engineering mab TOX TOX Antibody Drug Conjugates Fc-Engineering mab
51 Imunotoxinas: Conjugado Anticorpo-Toxina Antibody is tumor-specific
52 Sómente as células reconhecidas são eliminadas Efeitos secundários maiores do que com Ac não conjugados
53 Anticorpos, específicos para antigénios cancerígenos, i.e. carcinoma da próstata, podem ser conjugados com isótopos radioactivos, depois de injectados no doente podem reconhecer os locais dos tumores OctreoScan num doente com carcinoma metastatico da Próstata.
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55 FIM
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