UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos Área de Bromatologia

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos Área de Bromatologia Microencapsulação de Bifidobacterium lactis para aplicação em leites fermentados Alcina Maria Liserre Tese para obtenção do grau de DOUTOR Orientadora: Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco São Paulo, 2005

2 Alcina Maria Liserre Microencapsulação de Bifidobacterium lactis para aplicação em leites fermentados Comissão Julgadora da Tese para obtenção do grau de Doutor Profa. Dra. Bernadette Dora G. Melo Franco orientador/presidente Profa. Dra. Mariza Landgraf Profa. Dra. Maria Inês Ré Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferreira Grosso Prof. Dr. Salvador Massaguer Roig São Paulo, 19 de agosto de 2005.

3 Aos meus pais, Geraldo (in memoriam) e Júlia, e ao meu companheiro, Elizeu, pelo amor e dedicação em todos os momentos.

4 Agradecimentos À minha orientadora, Prof a Bernadette D. G. M. Franco, pela orientação, confiança e por todo o apoio e dedicação. À Dra. Maria Inês Ré, pelo apoio, orientação, amizade e fundamental colaboração na realização deste trabalho. Às Prof as Dras. Mariza Landgraf e Maria Teresa Destro, pelo apoio e pelos momentos agradáveis de convívio durante todos esses anos. À Kátia e Lúcia, funcionárias do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, pelo apoio, colaboração e amizade. À Maria Helena, Shirley, Marisa, Letícia, Juliana, Bergson e toda a equipe do Laboratório de Tecnologia de Partículas do IPT que me acolheram de forma calorosa, com muita amizade e contribuição para a realização do meu trabalho. Aos amigos do laboratório de microbiologia de alimentos: Ângela, Antônio, Cecília, Cíntia, Cristina Cruz, Cristina Garcia, Cristiano, Eb, Gabriela, Gunnar, Hans, Jane, Janine, João, Kátia, Lina, Paulo, Patrícia Bettini, Patrícia Kary, Ricardo, Susana, Tatiana, Vanessa Tsu, Vanessa Vieira e Vinícius, que tornaram a ida ao laboratório muito mais prazerosa. À Prof a Susana Saad, pelo auxílio e colaboração. Ao Jorge e Elaine, funcionários da Secretaria de Pós- Graduação, pela paciência e disposição. Às secretárias Tânia e Mônica, pela colaboração e ajuda nos momentos necessários. Aos meus amigos do Laboratório de Controle de Alimentos da Prefeitura de São Paulo, Selma, Eliana, Sônia, Yara, Cecília, Neuza, Vera, Mauro, Ida, Sandra, Maria, Vanda, Celeste, Roberta, Isabel, Margarida, Luzia e muitos outros, principalmente pela amizade e apoio.

5 Aos meus amigos pessoais, Patrícia, Sá, Magda, Marcos, Paulo Sakanaka, Dulce, Áurea, Simone, Sônia, Galdino e Oscar, que mesmo com o passar dos anos nunca me esquecem e continuam me proporcionando momentos maravilhosos. À minha família, pelo carinho, amor e incentivo durante todas as etapas de minha vida. À FAPESP, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pela bolsa de estudo através do processo 01/ Ao CNPq pelo auxílio financeiro ao projeto através do processo /

6 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS...ix LISTA DE TABELAS...xi Resumo... xii Abstract... xiv 1 Introdução Teórica Bactérias probióticas Técnicas de microencapsulação Aplicação de polímeros entéricos e liberação controlada Microencapsulação de bactérias probióticas Objetivos Materiais e Métodos Reagentes Culturas microbianas Métodos microbiológicos Seleção de meio de cultura para cultivo de B. lactis Preparo do inóculo de B. lactis para a encapsulação Enumeração de B. lactis Avaliação de atividade antimicrobiana da quitosana Preparo de micropartículas por atomização e gelificação Caracterização das micropartículas Microscopia óptica Análise granulométrica Determinação da concentração de cálcio Avaliação da estabilidade das micropartículas e da liberação de Bifidobacterium lactis em tampão fosfato Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais sem a adição de enzimas Avaliação da sobrevivência de Bifidobacterium lactis microencapsulado após ação de suco gástrico e entérico formulados com pepsina, pancreatina e bile Sobrevivência de células de Bifidobacterium lactis livres e microencapsuladas em leite fermentado Preparo do leite fermentado Avaliação da população de Bifidobacterium lactis, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus em leite fermentado Avaliação da sobrevivência de B. lactis em leite fermentado após passagem por teste de simulação de fluidos gastrintestinais com e sem a adição de enzimas... 27

7 viii Determinação do ph Análise estatística Resultados e Discussão Reativação e cultivo da cultura de Bifidobacterium lactis Avaliação de atividade antimicrobiana da quitosana Caracterização de micropartículas obtidas por atomização e geleificação Resultados obtidos com a microscopia óptica, análise de tamanho de partícula e análise da concentração de cálcio Avaliação da liberação de Bifidobacterium lactis das micropartículas em soluções tampão Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais sem a adição de enzimas Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais com a adição de enzimas Efeito da microencapsulação na sobrevivência de Bifidobacterium lactis em leite fermentado e em leite fermentado submetido a condições simuladas do trato gastrintestinal Sobrevivência de células de Bifidobacterium lactis livres e microencapsuladas em leite fermentado Sobrevivência de células de Bifidobacterium lactis livres e microencapsuladas em leite fermentado submetido a condições simuladas de suco gástrico com e sem a adição de enzimas Conclusões Referências... 71

8 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química do Eudragit (Vandamme et al., 2002) Figura 2. Fotomicrografias das partículas de alginato secas e após 1, 5, 10, 15 e 30 min em tampão fosfato ph 7, Figura 3. Fotomicrografias de partículas de alginato-quitosana secas e após 1, 5, 10, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7, Figura 4. Fotomicrografias de partículas do tipo alginato-quitosana 2 etapas secas e após 1, 5, 10, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7, Figura 5. Fotomicrografias de partículas de alginato-quitosana-sureteric 1% secas e após 1, 5, 15, 20, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7, Figura 6. Fotomicrografias de partículas de alginato-quitosana-sureteric 0,1% secas e após 1, 10, 30, 45 e 60 min em tampão fosfato ph 7, Figura 7. Fotomicrografias de partículas de alginato-quitosana-acryl-eze 0,1% secas e após 1, 15, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7, Figura 8. Populações de B. lactis (log UFC/g) liberadas de partículas de alginato, alginatoquitosana, alginato-quitosana-sureteric 0,1% e alginato-quitosana-acryl-eze 0,1% após 60 min a 37 o C em soluções tampão ph 4,5, 6,0 e 7,5 a 37 o C Figura 9. Populações de B. lactis (log UFC/g) liberadas das partículas e de microrganismos não encapsulados (log UFC/ml), expostos a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C Figura 10. Populações de B. lactis (log UFC/g) liberadas das partículas e de microrganismos não encapsulados (log UFC/ml), expostos a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C, com adição de pepsina e lípase no tampão ph 1,5 e de pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7, Figura 11. População de células de B. lactis (logufc/ml) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginato-quitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosanaacryl-eze (D) em leite fermentado após 0, 1, 2, 3 e 4 semanas de estocagem em refrigeração Figura 12. População de células de B. lactis (log UFC/mL) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginato-quitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosanaacryl-eze (D) em leite fermentado estocado por 0, 1, 2, 3 e 4 semanas sob refrigeração, após tratamento com fluidos gastrintestinais simulados (ph 1,5-5,6-7,5, 37 o C, 150rpm, 360 min) com adição de pepsina na solução ph 1,5 e de pancreatina e bile nas soluções ph 5,6 e ph 7,

9 x Figura 13. População de células liofilizadas de B. lactis (log UFC/mL) em leite fermentado estocado por 0, 1, 2, 3 e 4 semanas sob refrigeração, após exposição a ph 1,5 com 30 e 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min (37 o C, 150 rpm), simulando um tratamento com fluidos gastrintestinais com adição de enzimas e bile (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5) Figura 14. População de células desidratadas de B. lactis (log UFC/mL) em leite fermentado estocado por 0, 1, 2, 3 e 4 semanas sob refrigeração, após exposição a ph 1,5 com 30 e 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min (37 o C, 150 rpm), simulando um tratamento com fluidos gastrintestinais com adição de enzimas e bile (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5) Figura 15. População de células de B. lactis (log UFC/mL) encapsuladas com alginatoquitosana em leite fermentado estocado por 0, 1, 2, 3 e 4 semanas sob refrigeração, após exposição a ph 1,5 com 30 e 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min (37 o C, 150 rpm), simulando um tratamento com fluidos gastrintestinais com adição de enzimas e bile (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5) Figura 16. População de células de B. lactis (log UFC/mL) encapsuladas com alginatoquitosana-acryl-eze em leite fermentado estocado por 0, 1, 2, 3 e 4 semanas sob refrigeração, após exposição a ph 1,5 com 30 e 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min (37 o C, 150 rpm), simulando um tratamento com fluidos gastrintestinais com adição de enzimas e bile (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5)

10 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1. Valores de ph no trato gastrintestinal humano Tabela 2. Identificação e descrição dos ensaios de microencapsulação por atomização realizados Tabela 3. Diâmetro médio das partículas obtidas por diferentes procedimentos de encapsulação Tabela 4. Populações de Bifidobacterium lactis (log UFC/g) em partículas tratadas com tampão fosfato ph 4,5, 6,0 e 7, Tabela 5. População de B. lactis encapsulado e não encapsulado após exposição a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C Tabela 6. Populações de B. lactis encapsulado e não encapsulado após exposição a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C com adição de enzimas do trato gastrintestinal (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5) Tabela 7. População de Bifidobacterium lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e Streptococcus salivarius ssp. thermophilus em leite fermentado (log UFC/ml) durante 4 semanas de armazenamento sob refrigeração Tabela 8. População de células de B. lactis (log UFC/mL) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginato-quitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosanaacryl-eze (D) em leite fermentado antes e após exposição a suco gástrico simulado (37 o C, 150rpm) sem adição de enzimas gástricas e entéricas com 0, 1, 2, 3 e 4 semanas de estocagem em refrigeração Tabela 9. População de células de B. lactis (log UFC/mL) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginato-quitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosanaacryl-eze (D) em leite fermentado antes e após exposição a suco gástrico simulado (37 o C, 150rpm) com adição de pepsina e lipase no tampão ph1,5 e de pancreatina e bile nos tampões ph5,6 e 7,5 com 0, 1, 2, 3 e 4 semanas de estocagem em refrigeração... 64

11 xii Resumo Bifidobacterium spp. são microrganismos probióticos que podem ser incorporados em produtos alimentícios. Entretanto, para que seus efeitos benéficos à saúde humana ocorram, é necessário que o número de células viáveis na hora do consumo seja, no mínimo, 10 6 UFC/g. As bifidobactérias são sensíveis à elevada acidez e, por isso, torna-se necessária a busca por métodos que possam proteger a integridade da célula, sendo um deles a microencapsulação. Em uma primeira etapa do trabalho, Bifidobacterium lactis foi encapsulado em micropartículas de alginato e alginato modificado (alginatoquitosana, alginato-quitosana-sureteric e alginato-quitosana-acryl-eze) e sua sobrevivência e liberação das micropartículas em fluidos simulados do trato gastrintestinal foram mensuradas utilizando-se soluções tampão com ph 1,5, 5,6 e 7,5, na presença e na ausência de pepsina (3g/L), pancreatina (1g/L) e bile (10g/L). A liberação de células das micropartículas teve uma relação direta com o ph do tampão. A microencapsulação aumentou a taxa de sobrevivência de B. lactis, em comparação com células não encapsuladas, em soluções tampão com ph 1,5 sem a presença de enzimas. Em suco gástrico simulado com enzimas digestivas, por outro lado, foi observado que a pepsina proporcionou um efeito protetor sobre as células de B. lactis, e nesse caso, as taxas de sobrevivência do microrganismo estavam diretamente relacionadas com o grau de injúria das células. Em uma segunda etapa do trabalho, leites fermentados com Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus foram enriquecidos com culturas de Bifidobacterium lactis submetidas a quatro tratamentos diferentes: desidratação em temperatura ambiente, liofilização/congelamento, encapsulação em alginatoquitosana e encapsulação em alginato-quitosana-acryl-eze. A população sobrevivente de B. lactis foi determinada semanalmente no leite fermentado e também após tratamento simulando condições do trato gastrintestinal. Os

12 xiii resultados indicaram que na ausência de pepsina, as populações de B. lactis foram reduzidas drasticamente após o contato com tampão ph 1,5, não sendo possível a detecção de células viáveis livres ou encapsuladas após 120 minutos de teste. A presença de pepsina influenciou positivamente a recuperação de células viáveis de B. lactis em todas as condições testadas, mas as culturas na forma desidratada apresentaram melhores resultados que as culturas microencapsuladas ou liofilizadas. No caso do leite fermentado contendo as células desidratadas, a população de B. lactis, após o tratamento em suco gástrico com enzimas, foi superior à detectada no produto antes desse tratamento. Conclui-se que a microencapsulação não foi eficiente para proteger B. lactis em leite fermentado contra injúrias causadas pelo trato gastrintestinal simulado. Palavras-chave: Bifidobacterium lactis, microencapsulação, leite fermentado, suco gástrico

13 xiv Abstract Bifidobacterium spp. are microorganisms that can be added to foods. However, the benefits for the human health occur when the numbers of viable cells in the moment of the consumption is at least 10 6 CFU/g. Bifidobacteria are acid sensitive, and methods to protect cell integrity, such as microencapsulation, are needed. In the first part of the present study, Bifidobacterium lactis was encapsulated in microparticles of alginate and modified alginate (alginate-chitosan, alginate-chitosan-sureteric and alginate-chitosan-acryl-eze) and the survival and release from microparticles in simulated gastrointestinal conditions were measured, using buffers (ph 1.5, 5.6 and 7.5), in the absence and presence of pepsin (3g/L), pancreatin (1g/L) and bile. The release from microparticles presented a direct relationship with ph. When the ph was 1.5 and no enzyme was present, encapsulation improved the survival of B. lactis, when compared to free cells. However, pepsin had a protective effect on B. lactis, and the survival rate was directly related to the cells injury degree. In the second part of the study, fermented milk samples containing Streptococcus salivarius ssp. thermophilus and Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus were supplemented with B. lactis submitted to four different treatments: dehydration at room temperature, freeze drying, encapsulation in alginate-chitosan and encapsulation in alginate-chitosaacryl-eze. The number of viable B. lactis cells in the fermented milk was determined weekly and also after treatment with simulated gastrointestinal conditions. Results indicated that in the absence of pepsin, the number of viable cells decreased significantly after contact with buffers (ph 1.5), and no viable cell was detected after 120 minutes. Pepsin improved the recovery of viable cells in the assayed gastric conditions, being the dehydrated cultures more resistant than other cultures. In fermented milk containing the dehydrated cells, the number of viable cells increased after treatment with simulated gastrointestinal fluids.

14 xv Microencapsulation was not an effective procedure to protect B. lactis in fermented milk against injury caused by the simulated gastrointestinal tract. Keywords: Bifidobacterium lactis, microencapsulation, fermented milk, gastrointestinal tract

15 1 1 Introdução 1.1 Bactérias probióticas O consumo de produtos probióticos no Brasil intensificou-se consideravelmente nos últimos anos. Esse fato pode ser confirmado pelo desenvolvimento de novas marcas por diferentes indústrias alimentícias. A estratégia de marketing dessas empresas envolve o apelo pela manutenção da saúde e a necessidade da ingestão de uma pequena dose diária do alimento funcional (Oliveira et al., 2002). Na Europa, alimentos funcionais que visam a saúde intestinal também se tornaram uma tendência de mercado. O mercado para iogurtes probióticos já está bem estabelecido, mas recentemente, o setor de maior crescimento é o das bebidas lácteas probióticas. A popularidade das bebidas probióticas com pequenas doses diárias tem também resultado em novas pesquisas para desenvolver outros tipos de alimentos com probióticos (Mattila-Sandholm et al., 2002). No Japão e na Coréia, o uso de probióticos é comum em produtos alimentícios que são formulados especialmente para resistir ao processo de digestão. Nos Estados Unidos, os probióticos são geralmente encontrados em suplementos e iogurtes. Fabricantes que desejam expandir o uso de probióticos precisam garantir a estabilidade do produto e melhorar a taxa de sobrevivência para garantir o benefício à saúde do consumidor (Siuta-Cruce e Goulet, 2001). O conceito de probióticos foi desenvolvido no início do século XX pelo cientista russo Elie Metchnikoff, ganhador do Prêmio Nobel em 1908, que sugeriu que a vida saudável e longa de camponeses búlgaros resultava do consumo de produtos lácteos fermentados. Ele acreditava que os bacilos fermentadores (Lactobacillus) ingeridos influenciavam positivamente a microbiota do intestino. De acordo com Metchnikoff, bactérias benéficas vivas precisavam ser ingeridas de forma regular através de leites fermentados para manter um bom equilíbrio da microbiota intestinal e minimizar fermentações putrefativas.

16 2 Probióticos são microrganismos vivos, que após a ingestão em determinado número, desempenham um efeito benéfico adicional para a saúde além da nutrição básica (Guarner e Schaafsma, 1998, Sanders, 1999, Siuta-Cruce e Goulet, 2001). Várias outras definições têm sido propostas, mas não há um consenso para uma definição final. Efeitos benéficos à saúde têm sido associados a células microbianas vivas, mas freqüentemente é difícil diferenciar os efeitos das próprias células dos efeitos de seus metabólitos (Siuta-Cruce e Goulet, 2001). Segundo Krasaekoopt et al. (2003), as culturas de Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, normalmente utilizadas na produção de iogurtes, produzem β-galactosidase, beneficiando o metabolismo da lactose do iogurte ou leite fermentado, mas não podem ser consideradas probióticas porque são incapazes de sobreviver e se multiplicar no trato intestinal devido a sua baixa tolerância aos sais biliares. Por outro lado, bactérias probióticas como L. acidophilus e B. bifidum podem sobreviver e multiplicar-se no trato gastrintestinal, produzindo β-galactosidase mesmo na presença de bile. Para uma bactéria ser considerada probiótica, deve-se considerar não apenas as suas características benéficas, mas também a ausência de patogenicidade. Além disso, bactérias probióticas não devem conferir sabor e textura indesejáveis no produto. Vários aspectos, como segurança, funcionalidade e características tecnológicas devem ser levados em consideração no processo de seleção de microrganismos probióticos. Aspectos de segurança incluem as especificações de origem (trato gastrintestinal humano e saudável), nãopatogenicidade e características de resistência a antibióticos. Aspectos funcionais incluem a viabilidade e a persistência no trato gastrintestinal, propriedades de antagonismo e antimutagenicidade. Características tecnológicas incluem a facilidade de aplicação no alimento e do processo de fermentação, e também características sensoriais aceitáveis pelo consumidor. Entretanto, até mesmo o melhor probiótico é limitado na imensa amplitude de possíveis aplicações. Muitas bactérias com propriedades funcionais excepcionais são descartadas devido a limitações tecnológicas (Mattila-Sandholm et al., 2002). Uma dificuldade para a aplicação de bactérias probióticas em leites fermentados é a lenta taxa de

17 3 multiplicação dessas bactérias em leite, principalmente devido à sua baixa atividade proteolítica. Outro problema é a possível inibição das bactérias probióticas pelas culturas tradicionais do iogurte (Mccomas e Gilliland, 2003). As bactérias probióticas mais estudadas incluem espécies do gênero Lactobacillus e Bifidobacterium (Sanders, 1999). Como exemplo, pode-se citar L. acidophilus, L. casei, L. reuteri, L. brevis, L. cellobiosus, L. curvatus, L. plantarum, B. bifidum, B. adolescentis, B. animalis, B. infantis, B. longum, e B. lactis, entre outros. Em termos gerais, microrganismos probióticos devem apresentar algumas propriedades importantes no intestino humano, como: (i) aderir às células do intestino; (ii) excluir ou reduzir a aderência de microrganismos patogênicos; (iii) sobreviver e multiplicar-se; (iv) produzir ácidos, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas contra microrganismos patogênicos; (v) não ser invasivos, carcinogênicos ou patogênicos; (vii) manter um equilíbrio com a microbiota normal (Reid, 1999). Entre os benefícios gerados pelos probióticos, pode-se citar controle de infecções intestinais, controle do nível de colesterol, melhoramento da digestão da lactose e, possivelmente, atividade anticarcinogênica. Bactérias probióticas podem inibir o desenvolvimento de microrganismos patogênicos que podem ser encontrados no trato gastrintestinal, devido à produção de ácido e/ou de bacteriocinas, à competição por nutrientes com possíveis microrganismos patogênicos e ao melhoramento do sistema imune. Por produzirem β- galactosidase, bactérias probióticas são benéficas para pessoas com intolerância à lactose. A atividade anticarcinogênica ou antimutagênica dos probióticos pode resultar de um ou mais fatores, como inibição de carcinógenos e/ou prócarcinógenos, ativação do sistema imunológico do hospedeiro e redução do ph intestinal, tendo como conseqüência redução da atividade microbiana. Além disso, outros efeitos, como a redução do colesterol sanguíneo, têm sido relatados, especialmente por cepas de L. acidophilus (Krasaekoopt et al., 2003). Sabendo-se que microrganismos probióticos desempenham um papel importante promovendo e mantendo a saúde, muitos pesquisadores e empresas têm demonstrado interesse em incorporá-los a produtos alimentícios e farmacêuticos (Gardner et al., 2000). Recomenda-se que produtos adicionados de

18 4 probióticos contenham, no mínimo, uma contagem de 10 7 bactérias probióticas por grama ou mililitro (Ishibashi e Shimamura, 1993). Em muitos países, existem padrões para contagem mínima de bactérias probióticas em produtos fermentados. Nos países pertencentes ao MERCOSUL (Brasil, Paraguai, Uruguai e Argentina), a regulamentação estabelece que a concentração mínima para probióticos em leites fermentados deve ser de 10 6 UFC/g. No Brasil, uma resolução da Agência Nacional de Vigilância Sanitária estabelece que leites fermentados à base de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis devem conter um mínimo de 10 6 UFC/grama de produto durante o prazo de validade (BRASIL, 1999). No Japão, a Associação de Leites Fermentados e Bactérias Láticas estabeleceu uma norma que requer um mínimo de 10 7 células por mililitro em produtos lácteos frescos (Krasaekoopt et al., 2003). A capacidade dos microrganismos de sobreviver e multiplicar-se em hospedeiros influencia diretamente os seus benefícios probióticos. As bactérias devem se manter metabolicamente estáveis e ativas no produto, sobreviver à passagem através do trato digestivo, e ainda, causar os efeitos benéficos esperados no intestino do hospedeiro (Gilliland, 1989). Entretanto, estudos indicam que as bactérias láticas não sobrevivem adequadamente quando incorporadas em produtos lácteos fermentados, devido à própria acidez do produto (Dave e Shah, 1996; Kailasapathy e Rybka, 1997, Shah e Lankaputhra, 1997; Oliveira et al., 2002). Em uma pesquisa realizada por Fantazzini et al. (2000), empregando-se leites fermentados de quatro marcas comerciais diferentes adquiridos no comércio de São Paulo dentro do prazo de validade, observou-se uma variação média de 2,7 ciclos logarítmicos (log) nas populações de bactérias láticas (UFC/ml), verificando-se amostras com 8,4 log UFC/ml até amostras com 5,7 log UFC/ml. Resultados obtidos por Trindade (2001), que inocularam Bifidobacterium lactis em iogurte com ph inicial de 4,2, indicaram uma redução de 7 ciclos logarítmicos após 28 dias de estocagem a 7 o C. A viabilidade e a estabilidade de culturas probióticas têm sido um desafio tecnológico para as indústrias processadoras. Alimentos probióticos devem conter linhagens específicas de microrganismos probióticos e manter um nível apropriado

19 5 de células viáveis durante a vida-de-prateleira do produto, sem interferir no sabor e textura, e preferencialmente, não se multiplicar (Mattila-Sandholm et al., 2002). Se a atividade de bactérias probióticas no trato digestivo depende de sua sobrevivência nesse ambiente, então essas bactérias devem ser resistentes aos mecanismos de defesa do hospedeiro, incluindo os processos dinâmicos fisiológicos e fisicoquímicos do trato gastrintestinal (GI). Os parâmetros fisiológicos compreendem ph, concentração de enzimas gástricas e do intestino delgado, bile, e a cinética da passagem do quimo através do estômago e do intestino. Embora essas bactérias tenham sido isoladas de vários pontos do trato GI humano, o íleo e o cólon parecem ser os locais preferenciais de sua colonização no intestino. Infelizmente, a maior parte dos estudos sobre ação dos probióticos ignora esses fatos e, como resultado, dados sobre a tolerância de bactérias probióticas às secreções do intestino delgado, além da bile, não são avaliados (Kos et al., 2000). Muitas propostas tecnológicas e soluções inovadoras têm sido investigadas para resolver os problemas de estabilidade e viabilidade em novos desenvolvimentos de alimentos. Novas formulações e tecnologias de microencapsulação têm aumentado a resistência dos microrganismos com resultados promissores. A manutenção de baixos custos ainda é um desafio para o processamento de probióticos e para as tecnologias de formulação (Mattila- Sandholm et al., 2002). 1.2 Técnicas de microencapsulação Microencapsulação é a tecnologia de empacotamento que, com finas camadas poliméricas aplicáveis a sólidos, gotículas de líquido ou materiais gasosos forma partículas denominadas microcápsulas, que podem liberar seu conteúdo com velocidade e condições específicas (Santos et al., 2000). Essa técnica é muito útil na fabricação de medicamentos, principalmente quando se deseja que uma substância não seja afetada pelo suco gástrico, sendo absorvida apenas no intestino. A microencapsulação também pode ser utilizada para a proteção de células microbianas com dois propósitos: aumentar a porcentagem de

20 6 células íntegras após determinado tempo de vida-de-prateleira em alimentos e proteger a célula bacteriana da ação de sucos gástrico e entérico. A tecnologia de imobilização de células tem sido amplamente utilizada em várias pesquisas e aplicações industriais. O uso de bactérias láticas imobilizadas como culturas starter na indústria de laticínios é uma das mais promissoras aplicações. A encapsulação com polímeros sintéticos ou naturais é uma das técnicas mais utilizadas devido a sua facilidade e simplicidade de aplicação, baixo custo, e condições de retenção de altas contagens de células viáveis (Zhou et al., 1998). As técnicas de encapsulação aplicadas aos probióticos para uso em leites fermentados podem ser classificadas em dois grupos: extrusão (método de gotejamento) e emulsificação ou sistema de duas fases (Krasaekoopt et al., 2003). A extrusão é a forma mais antiga e comum de se fazer cápsulas com hidrocolóides. O polímero mais utilizado para o método de extrusão é o alginato, que é um heteropolissacarídeo linear de ácidos D-manurônico e L-gulurônico extraído de várias espécies de algas (Yang e Wright, 1999). Dependendo da alga, o teor e a seqüência dos ácidos D-manurônico e L-gulurônico nos polímeros podem variar consideravelmente. As propriedades funcionais do alginato como um polímero protetor correlacionam-se fortemente com a seqüência de ácido D- manurônico e ácido L-gulurônico. Cátions divalentes como Ca 2+ ligam-se preferencialmente ao polímero de ácido L-gulurônico. O comprimento do polímero de ácido D-manurônico é a característica mais importante para a formação do hidrocolóide (Yang e Wright, 1999, Krasaekoopt et al., 2003). Para a formação de partículas pelo método de extrusão, uma suspensão de células é misturada com uma solução de alginato de sódio, e a mistura é gotejada ou atomizada, através de uma seringa ou bico injetor, em uma solução com cátions multivalentes (geralmente Ca 2+ na forma de CaCl 2 ). As gotas formam esferas de gel instantaneamente, encapsulando as células em uma estrutura tridimensional no alginato com ligações cruzadas através de íons. Portanto, formase uma partícula multinucleada, com o agente ativo disperso em seu interior. O sucesso da técnica de encapsulação em gel de alginato é devido ao pouco ou nenhum grau de injúria proporcionado ao material recoberto, ao baixo custo, à

21 7 simplicidade do processo e à biocompatibilidade entre os polímeros e os microrganismos. As concentrações de alginato e cloreto de cálcio utilizadas variam de 0,6% a 2% e 0,05 a 1,5M, respectivamente (Curt, 1995, Yang e Wright, 1999, Krasaekoopt et al., 2003). O tamanho e o formato das partículas dependem da viscosidade da solução de alginato, da agitação do meio de cura (solução com cátions multivalentes) e da distância entre o bico atomizador e a solução de cloreto de cálcio. O gotejamento pode resultar em partículas de 1 a 4 mm, enquanto a atomização, em gotas de 100 a 600µm (Sugawara et al., 1994). A composição do alginato também influencia no tamanho das partículas, o uso de alginato com baixa concentração de ácido gulurônico resulta em partículas menores (Krasaekoopt et al., 2003). A técnica de emulsificação consiste na adição de um pequeno volume de suspensão célula-polímero (fase descontínua) a um grande volume de óleo vegetal (fase contínua), como óleo de soja, canola, girassol ou de milho. A mistura é homogeneizada para a formação de uma emulsão água-em-óleo. Logo que a emulsão é formada, o polímero precisa ser insolubilizado para a formação de ligações cruzadas e de pequenas partículas na fase óleo. Quanto menor o tamanho das partículas durante a emulsificação, menor o tamanho das partículas formadas no final do processo, ou seja, após a quebra da emulsão. O tamanho das partículas também pode ser controlado com a velocidade de agitação, e pode variar entre 25µm e 2mm. O método de insolubilização depende do tipo de material usado. As partículas são retiradas do óleo por filtração. Embora sejam usadas com sucesso para a encapsulação de bactérias láticas para fermentação contínua ou em batelada (Krasaekoopt et al., 2003), técnicas de emulsão não são muito adequadas para aplicação industrial, pois geralmente resultam na formação de partículas de tamanhos muito variáveis. Além disso, são de difícil execução, devido à dificuldade da dissolução do Ca 2+ na fase oleosa e da eliminação do óleo da superfície das partículas (Poncelet et al., 1995, Stormo e Crawford, 1992). Enquanto altas concentrações de células podem ser encontradas em partículas de alginato ( UFC/g), a quantidade de células fora do gel pode ser também elevada (até 10 8 UFC/ml). Em algumas aplicações, como cremes fermentados para produção de manteiga com certas culturas ou queijo cottage, a

22 8 liberação de células é indesejável, uma vez que as células livres podem provocar uma acidificação continuada durante a estocagem (Champagne et al., 1993, Zhou et al., 1998). Com a finalidade de aumentar a retenção do material encapsulado e a estabilidade das partículas feitas com alginato de cálcio, pode-se recobrir estas partículas com polímeros policatiônicos que formam uma membrana na superfície das gotas, complexando-se com os agrupamentos do alginato (Huguet e Dellacherie, 1996). O alginato forma complexos estáveis com policátions como a quitosana e a polilisina. A quitosana, um policátion com grupos amina, pode sofrer ligações cruzadas com o poliânion alginato, reforçando a camada exterior da partícula. A polilisina é um produto muito mais caro que a quitosana e a sua ligação com o alginato é mais fraca do que a ligação entre alginato e quitosana (Lee et al., 1997). A quitosana é um polissacarídeo positivamente carregado formado pela deacetilação da quitina extraída de crustáceos. A quitina é o segundo mais abundante biopolímero natural existente no planeta, ficando atrás apenas da celulose. A estrutura química da quitina é parecida com a celulose, sendo formada com monômeros 2-acetamido-2-deoxi-β-D-glicose (NAG) com ligações β(1 4). Quitosana é a forma deacetilada (em vários graus) da quitina, a qual, ao contrário da quitina, é solúvel em soluções ácidas (ph <6,0). Quitina e quitosana têm sido alvo de pesquisas para uma série de aplicações industriais. Entre suas possíveis aplicações, pode-se citar preservação de alimentos da deterioração microbiana, formação de filmes biodegradáveis, recobrimento de resíduos da indústria de alimentos, purificação de água e clarificação e acidificação de sucos de frutas (Shahidi et al., 1999). Zhou et al. (1998) descobriram que, suspendendo partículas de alginato em uma solução de quitosana de baixo peso molecular, houve a formação de uma membrana capaz de reduzir a liberação de células na ordem de 100 vezes. Foi observado que a quitosana de baixo peso molecular difunde-se melhor no gel de alginato, resultando em uma membrana mais densa do que aquelas formadas com quitosana de alto peso molecular.

23 9 As partículas de alginato-quitosana podem ser produzidas por diferentes procedimentos. O processo pode ser feito em uma única etapa, com o gotejamento de uma solução de alginato de sódio em uma solução de CaCl 2 contendo quitosana, ou em duas etapas, onde uma solução de alginato de sódio é gotejada em uma solução de CaCl 2, sendo posteriormente transferida para uma solução de quitosana (0,1 a 0,8%) onde ocorrerá a formação da membrana na superfície das gotas. Uma outra forma consiste no gotejamento da solução de alginato de sódio em uma solução de quitosana com posterior adição de CaCl 2. Esses procedimentos resultam em partículas com resistência mecânica, porosidade, tamanho, intumescimento, permeabilidade e taxas de liberação característicos (Gaser d et al., 1999, Zimmermann, 2001). 1.3 Aplicação de polímeros entéricos e liberação controlada Para que um sistema de liberação controlada no organismo humano seja eficiente, primeiramente deve-se conhecer as características dos fluidos que irão entrar em contato com as partículas e avaliar a sua resistência em função do ph do meio, atuação de enzimas, temperatura e tempo de reação. O trato gastrintestinal (TGI) começa na abertura da boca e termina com o ânus. O trato gastrintestinal pode ser dividido em boca, esôfago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, cólon e reto. Quando o objetivo é a absorção através do trato gastrintestinal, há uma quantidade de pontos anatômicos, fisiológicos e bioquímicos que devem ser considerados. Há algumas regiões do TGI com papéis únicos no processo seqüencial de assimilação de nutrientes: mastigação, salivação, deglutição, digestão, absorção e eliminação de alimentos (Mrsny, 1997). O suco gástrico é, normalmente, um líquido amarelo pálido de elevada acidez (0,2 a 0,5% de HCl) e ph em torno de 1,5 a 3,5. Além do ácido clorídrico, contém: mucina, proteína com capacidade de se combinar com o ácido exercendo uma ação protetora da mucosa; fator intrínseco, essencial para a absorção de vitamina B 12 ; enzimas (pepsinogênio, pepsina); hormônio gastrina; e água, 97 a 99% em peso (Guyton, 1993).

24 10 Com o desenvolvimento de probióticos microencapsulados a serem liberados no intestino, torna-se necessário que as micropartículas cheguem intactas até o duodeno. As partículas devem primeiro passar pelo estômago, e quando em contato com os fluidos intestinais sofrer solubilização ou desintegração parcial para propiciar a liberação das células. Os métodos para melhorar a liberação controlada no intestino são baseados na modificação química ou tecnológica do recobrimento da partícula. A aplicação de polímeros com solubilidade ph-dependente, ou aqueles degradados especificamente pela microbiota colonizadora, torna possível essa liberação controlada. Polímeros que possibilitam uma liberação controlada no intestino após a passagem pelo suco gástrico podem ser denominados como polímeros entéricos. As várias estratégias desenvolvidas para atingir este objetivo têm aproveitado as características específicas do organismo humano, como por exemplo, ph (Tabela 1), microbiota, enzimas, potencial redox e tempo de trânsito. Entretanto, esses parâmetros podem variar entre diferentes indivíduos. O trânsito gastrintestinal envolve a passagem através do estômago (ph 1,5 a 3,5) e do intestino (ph 4,0 a 7,5). A maior parte dos polímeros com funcionalidade entérica são desenvolvidos para que sejam especificamente dissolvidos em função do ph intestinal. Esses polímeros entéricos, em geral, são insolúveis em valores de ph abaixo de 5,5 e solúveis em valores de ph acima de 6,0. Como exemplo, pode-se citar o Eudragit, composto por polímeros de ácido metacrílico, metilmetacrilato e etilacrilato (Figura 1) e o Sureteric, composto por polivinilacetatoftalato (Zak, 1997, Vandamme et al., 2002). Neste trabalho utilizou-se o Sureteric, insolúvel em valores de ph inferiores a 4,5, e o Acryl eze, um produto a base de Eudragit L e insolúvel em valores de ph inferiores a 5,5.

25 11 Tabela 1. Valores de ph no trato gastrintestinal humano. Trato Comprimento Tempo de ph Atividades gastrintestinal residência aproximado Cavidade oral ---- segundos 6,5 Polissacaridases a minutos Esôfago cm segundos ---- Estômago 0,25 m (variável) 90 min (variável) 1,5-3,5 Proteases, lípases Duodeno 0,35 m min 4,0-5,5 Polisacaridases, oligosacaridases, proteases, peptidases, lipases Jejuno 2,8 m 1,5 a 2,0 h 5,5-7,0 Oligosacaridases, peptidase, lipases Íleo 4,2 m 5-7 h 7,0-7,5 Oligosacaridases, peptidase, lipases Cólon e Reto 1,5 m 1 60 h (média de 35-36h) 7,0-7,5 Várias enzimas bacterianas Fonte: Mrsny, 1997.

26 12 R 1 R 1 R 1 CH 2 C CH 2 C CH 2 C C O R 3 C O OR 2 OR 2 R 1 = -CH 3, R 2 =-CH 3 e R 3 =-COOH (Eudragit L e S) R 1 = -CH 3, R 2 =-CH 2 -CH 3 e R 3 =-COOH (Eudragit L e L30D-55) R 1 = -CH 3, R 2 =-CH 3 e R 3 =-COOCH 3 (Eudragit NE30D) R 1 = -CH 3, R 2 =-CH 3 e R 3 =-COOCH 2 CH 2 N + (CH 3 ) 3 Cl - (Eudragit RL e RS) Figura 1. Estrutura química do Eudragit (Vandamme et al., 2002) Para melhorar a liberação ph-dependente, esses polímeros entéricos podem ser utilizados para o recobrimento de partículas ou simplesmente associados com polissacarídeos, como alginato e quitosana, para constituir sistemas de liberação controlada. 1.4 Microencapsulação de bactérias probióticas A proteção de probióticos pela microencapsulação em partículas de hidrocolóides tem sido estudada para melhorar a viabilidade das células nos produtos alimentícios e no trato intestinal. Benefícios adicionais incluem: proteção de células nas partículas contra bacteriófagos; aumento da sobrevivência no caso de liofilização e congelamento e aumento da estabilidade durante a estocagem. Bactérias probióticas encapsuladas podem ser utilizadas em muitos tipos de produtos fermentados, como iogurte, queijo, cremes fermentados e doces lácteos gelados (Krasaekoopt et al., 2003). Vários pesquisadores têm avaliado a microencapsulação com o objetivo de reduzir a injúria ou morte celular de bactérias probióticas em leites fermentados ou em soluções de suco gástrico. Todavia, os resultados obtidos têm sido

27 13 contraditórios e o elevado número de parâmetros avaliados dificulta a identificação do método de microencapsulação mais eficiente. Sheu e Marshall (1993) observaram que bactérias láticas encapsuladas com alginato de cálcio foram totalmente liberadas através de agitação em solução de tampão fosfato 0,1M (ph 7,5) por 10 min. A taxa de sobrevivência de lactobacilos congelados em leite aumentou 40% quando foram utilizados microrganismos encapsulados. Sultana et al. (2000) encapsularam Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium spp. com uma mistura de alginato 2% preparada com 2% de amido de milho (Hi-maize, um prebiótico). As bactérias encapsuladas, no entanto, não mostraram um aumento significativo na sobrevivência quando sujeitas à alta acidez e sais de bile. Lee e Heo (2000) imobilizaram Bifidobacterium longum KCTC 3128 e HLC 3742 independentemente em microcápsulas obtidas com 2, 3 e 4% de alginato de sódio. Quando as bactérias encapsuladas foram expostas a suco gástrico e solução de sais de bile in vitro, a taxa de morte nas células encapsuladas decresceu proporcionalmente ao aumento da concentração de alginato de sódio e do tamanho da partícula formada. Shah e Ravula (2000) encapsularam bactérias probióticas (Lactobacillus acidophilus MJLA1 e Bifidobacterium spp. BDBB2) em alginato de cálcio por um sistema de duas fases (emulsão água/óleo). Os efeitos do lauril sulfato de sódio e Tween 80 sobre o tamanho das cápsulas e sobre a liberação dos microrganismos das cápsulas na presença de ácido e bile foram investigados. As bactérias encapsuladas foram liberadas com agitação em tampão fosfato 0,1 M por 5 min e na presença de bile, mas não na presença de ácido lático. Em geral, a sobrevivência de bactérias probióticas em produtos lácteos fermentados congelados foi melhorada com a encapsulação. Favaro-Trindade e Grosso (2000, 2001, 2002) encapsularam Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis em alginato de cálcio e em acetatoftalato de celulose. Nesse trabalho, concluiu-se que a imobilização em alginato de sódio não foi eficaz na proteção às células de L. acidophilus e B. lactis em soluções ácidas (ph 1,0 e ph 2,0) e em iogurte. No entanto, a microencapsulação em

28 14 acetatoftalato de celulose foi efetiva na proteção desses microrganismos em soluções ácidas, embora não tenha sido eficiente quando B. lactis microencapsulado foi inoculado em iogurte. Sun e Griffiths (2000) imobilizaram bifidobactérias em cápsulas com gomas gelana e xantana. As partículas (0,75% gelana e 1% xantana) apresentaram diâmetro de 3 mm. A sobrevivência de B. infantis ATCC foi avaliada em água peptonada, tampão ph 4, iogurte pasteurizado e suco gástrico simulado. Em água peptonada e tampão ph 4, a redução na contagem de células imobilizadas não foi significativamente diferente da contagem de células livres durante 6 semanas de estocagem a 4 o C. Entretanto, contagens das populações de B. infantis imobilizadas foram significativamente superiores às de células livres em suco gástrico simulado com ph1,5, 2,0 e 2,5. Em ph 2,5, a contagem de células livres decresceu de aproximadamente 9 log UFC/ml a um nível indetectável (<10 UFC/ml) em 30 min, enquanto para células imobilizadas houve um decréscimo de apenas 0,67 ciclos logarítimicos no mesmo período. Células imobilizadas também sobreviveram significativamente melhor em iogurte pasteurizado do que células livres. O Riordan et al. (2001) encapsularam células de Bifidobacterium PL1 em amido modificado utilizando um processo de secagem em spray dryer. Os autores concluiram que o processo de encapsulação utilizado não foi eficiente para preservar a viabilidade celular. Guerin et al. (2003) encapsularam bifidobactérias em um gel composto de alginato, pectina e proteínas do soro. Após 1h em solução ácida (ph 2,5) com pepsina (10U/mL), as contagens de células livres decresceram 4,75 ciclos logarítmicos, enquanto para células encapsuladas houve uma redução inferior a 1 log. As células livres não sobreviveram após 2h de incubação em ph 2,5, enquanto para células imobilizadas houve um decréscimo de aproximadamente 2 ciclos logarítmicos na população. Os autores concluíram que a encapsulação é um método eficiente para proteger células em solução ácida (ph 2,5) com pepsina (10U/mL). Entretanto, após incubação (1 a 3h) em soluções com sais biliares (2 e 4%), a mortalidade de bifidobactérias foi superior para células encapsuladas (4 a 7 log) em comparação com células livres (2 a 3 log).

29 15 Adhikari et al. (2003) adicionaram células vivas de Bifidobacterium longum microencapsuladas em κ-caragena em iogurte após o processo de fermentação e estocaram o produto a 4,4 o C por 30 dias. Os resultados do estudo mostraram que não houve declíneo no número de bactérias encapsuladas, porém a redução no número de células livres foi significativa no iogurte (89,3% para B. longum B6 e 91,8% para B. longum ATCC 15708), portanto, a microencapsulação protegeu as bifidobactérias do baixo ph do produto, aumentando a sua viabilidade durante o período de estocagem. A análise sensorial do produto revelou que a presença de micropartículas, com 235,8 ± 25,6µm, causou uma alteração na textura do produto, perceptível durante o consumo. Lian et al. (2003) encapsularam Bifidobacterium longum B6 e Bifidobacterium infantis CCRC com gelatina, amido solúvel, leite desnatado e goma arábica utilizando spray dryer. A sobrevivência das células encapsuladas e livres foi investigada em suco gástrico simulado (ph2,0 e 3,0) e em solução de bile (0,5% e 2,0%). A população de culturas microencapsuladas manteve-se mais estável que a população de células livres durante exposição a suco gástrico simulado e soluções de bile. Este fenômeno foi mais aparente em ph 2,0 e 2% de bile, entretanto, este efeito pode variar dependendo da cêpa utilizada e do material de recobrimento. Iyer e Kailasapathy (2005) estudaram os efeitos da microencapsulação com Hi-maize (um amido modifcado), quitosana e alginato sobre a sobrevivência de Lactobacillus acidophilus CSCC2400 e CSCC2409 em soluções ácidas (ph2,0), com sais de bile e iogurte. A adição de Hi-maize (1%p/v) nas partículas com Lactobacillus spp. e posterior recobrimento com quitosana aumentaram significativamente a sobrevivência de bactérias encapsuladas em soluções ácidas (ph 2,0), com sais de bile e também em iogurte estocado por 6 semanas, em comparação com células encapsuladas em alginato. Hansen et al. (2002) avaliaram a tolerância de nove espécies de bifidobactérias a condições simuladas do trato gastrintestinal a 37 o C. A resistência ao suco gástrico simulado e bile variou entre as espécies testadas. Bifidobacterium lactis Bb-12 foi significativamente mais resistente ao baixo ph e bile do que as outras espécies testadas. Em suco gástrico simulado com ph 1,0, a

30 16 população inicial de aproximadamente UFC/ml para todas as espécies testadas decresceu para menos de 10 UFC/ml (limite de detecção do teste) após 30 min de contato. Após 2 horas em ph 2,0, a população de B. lactis Bb12 decresceu de 9,5 log UFC/ml para 8,2 log UFC/ml. As cepas menos resistentes foram B. bifidum Bb-11 e B. infantis Bb-02, cujas populações decresceram a menos que 10UFC/ml após exposição em ph 2,0. A microencapsulação em alginato de cálcio não melhorou significativamente a sobrevivência de bifidobactérias em condições simuladas do trato gastrintestinal com ph 2,0 e 3,0. Pelos estudos citados, pode-se notar que o alginato de cálcio tem sido amplamente utilizado para a imobilização de bactérias láticas, principalmente devido a facilidade de manuseio, baixo custo e sua natureza não tóxica. Entretanto, sua efetividade quanto ao aumento da proteção de células expostas à ação do suco gástrico isolado ou em combinação com outras substâncias ainda deve ser estudada com o intuito de se estabelecer melhores condições de microencapsulação.

31 17 2 Objetivos Este trabalho teve como objetivos: 1) Estudar a viabilidade tecnológica da microencapsulação de Bifidobacterium lactis em alginato e alginato-quitosana; 2) Verificar a viabilidade tecnológica da aplicação de dois polímeros com funcionalidade entérica (sureteric e acryl-eze), nas formulações das partículas de alginato-quitosana, com o intuito de promover liberação controlada de Bifidobacterium lactis em fluidos intestinais simulados; 3) avaliar a liberação e sobrevivência desta bactéria microencapsulada quando exposta a ph 4.5, 6,0 e 7.5, em soluções tampão que simulam as condições do trato gastrintestinal (ph 1.5, 5.6 e 7.5) e em leites fermentados; 4) Verificar se a presença de enzimas do trato gastrintestinal (pepsina e pancreatina) capazes de hidrolizar nutrientes do leite influenciam a taxa de sobrevivência de B. lactis encapsulado ou não em testes de simulação da passagem desta bactéria pelos sucos gástrico e entérico; 5) e avaliar o efeito da microencapsulação na sobrevivência de B. lactis em leite fermentado submetido a condições simuladas do trato gastrintestinal.

32 18 3 Materiais e Métodos 3.1 Reagentes Os reagentes utilizados para o processo de microencapsulação foram: quitosana (baixo peso molecular, grau de deacetilação de 75-85%, Aldrich Chemical Company, Inc.), alginato de sódio (Degussa Texturant Systems), sureteric (Blanver Farmoquímica Ltda.), acryl-eze (Colorcon do Brasil Ltda.) e cloreto de cálcio dihidratado (Anidrol Produtos Químicos Ltda.). Para os testes de simulação de fluidos do trato gastrintestinal utilizou-se: pancreatina (Sigma Chemical CO), amano lipase F-AP15 (Aldrich Chemical Company, Inc.), pepsina (Sigma Chemical CO) e bile (Ox Gall Powder, Sigma Chemical CO). 3.2 Culturas microbianas Como cultura probiótica, foi utilizada uma cepa liofilizada de Bifidobacterium lactis (Bb12) tipo DVS (Direct Vat Set) da Christian Hansen Ind. e Com. Ltda. (Valinhos, SP). 3.3 Métodos microbiológicos Seleção de meio de cultura para cultivo de B. lactis Com o objetivo de identificar o melhor meio de cultura para a reativação e cultivo de B. lactis a 37 o C por 20 horas, as seguintes formulações (Lima, 2005) foram testadas: a) Caldo MRS com 0,1% de cloreto de lítio e 0,3% de propionato de sódio b) Leite integral tipo UHT com 2% de glicose e 1% de extrato de levedura c) Leite integral tipo UHT com 2% de glicose, 1% de extrato de levedura e 0,05% de cisteína-hcl d) Leite desnatado reconstituído com 2% de glicose, 1% de extrato de levedura e 0,05% de cisteína-hcl e) Leite desnatado reconstituído com 1% de glicose, 1% de extrato de levedura e 0,05% de cisteína-hcl

33 Preparo do inóculo de B. lactis para a encapsulação Os inóculos utilizados nos processos de encapsulação foram preparados através do cultivo do microrganismo (0,15%) em leite desnatado reconstituído suplementado com extrato de levedura (1%), glicose (1%) e L-cisteína (0,05%) por 20 horas a 37 o C. O caldo fermentado foi centrifugado a 2360Xg por 8 min e lavado com salina 0,85% por duas vezes. Então, as células foram suspensas em salina 0,85% para a obtenção de uma suspensão com aproximadamente UFC/ml. A suspensão foi adicionada à solução de alginato de sódio de modo que se obtivesse uma concentração de aproximadamente UFC/ml. A mistura resultante de alginato de sódio com B. lactis foi submetida ao processo de microencapsulação. Com o objetivo de se preparar um controle de células livres para os testes de avaliação da liberação de células das partículas e sobrevivência em diferentes soluções tampão, parte do inóculo preparado foi armazenado em refrigeração sendo ressuspenso em salina ou desidratado. Para a desidratação, após processo de lavagem e centrifugação, as células foram espalhadas cuidadosamente em placas de petri estéreis e desidratadas em temperatura ambiente por 24 horas em câmara de fluxo laminar (mesmo procedimento aplicado às células encapsuladas). Esse procedimento visou a obtenção de um controle de células com tratamento similar ao do processo de encapsulação, o qual causa um certo nível de injúria à célula Enumeração de B. lactis As análises microbiológicas foram realizadas em ágar MRS (Oxoid) suplementado com cloreto de lítio (0,1%), propionato de sódio (0,3%) e L-cisteína (0,05%), com incubação a 37 o C por 72 horas em anaerobiose (Anaerogen, Oxoid).

34 Avaliação de atividade antimicrobiana da quitosana O teste de difusão em poços descrito por Harris et al. (1989), com modificações, foi usado para a verificação de possível efeito bactericida ou bacteriostático da quitosana sobre as células de B. lactis. Aproximadamente 20 ml de MRS fundido contendo 1% de ágar e 0,05% de cisteína-hcl foram inoculados com uma cultura fresca de B. lactis de forma a atingir uma concentração de UFC/ml e transferidos para uma placa de petri estéril. Após a solidificação, foram perfurados poços com 3 a 4 mm de diâmetro. Em diferentes poços foram adicionadas soluções de quitosana 0,5%, 1% e 2,5%. As placas foram incubadas em anaerobiose por 72 h a 37 o C e, após a multiplicação microbiana, observou-se a possível formação de halos ao redor dos poços. 3.4 Preparo de micropartículas por atomização e gelificação Para a realização da microencapsulação, foram utilizadas as instalações e equipamentos do Laboratório de Tecnologia de Partículas do Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT), de acordo com a metodologia estabelecida por Zimmermann (2001), com modificações. Utilizou-se o método de atomização e geleificação, sendo o processo realizado em um reator de 4 litros, encamisado, onde as soluções foram adicionadas e agitadas (175rpm) com o auxílio de um agitador mecânico a 20 C. A atomização foi realizada utilizando-se um bico de duplo fluido, de mistura externa, com diâmetro de 1mm (dispositivo acessório de um spray dryer Büchi 190). O ar de atomização foi mantido a um fluxo de 600NI/h. A vazão de alimentação foi regulada em 6,7 ml/min, aproximadamente. A distância entre o bico de atomização e a superfície da solução gelificante no reator foi fixada em 18cm, e o tempo de cura estabelecido foi de 30 minutos com agitação. Para o processo de encapsulação foram utilizados os polímeros alginato de sódio (Degussa Texturant Systems), quitosana (baixo PM, Aldrich Chemical Company, Inc.), sureteric (Blanver Farmoquímica Ltda.) e acryl-eze (Colorcon do Brasil Ltda.). Também utilizou-se como reagente o cloreto de cálcio dihidratado (Anidrol Produtos Químicos Ltda.). Os procedimentos de encapsulação testados estão listados na Tabela 2.

35 21 Tabela 2. Identificação e descrição dos ensaios de microencapsulação por atomização realizados. Procedimento de encapsulação * Solução atomizada 1 o Etapa 2 o Etapa 1) Alginato Alginato de sódio 2% CaCl 2 0,1M ) Alginato-quitosana Alginato de sódio 2% Solução de quitosana 0,5% ---- em solução de HCl (ph 4,0) com CaCl 2 0,1M 3) Alginato-quitosana 2 etapas Alginato de sódio 2% CaCl 2 0,1M Sol. de quitosana 0,5% em solução HCl (ph 4,0) 4) Alginato-quitosana-sureteric 1% Alginato de sódio 2% com Solução de quitosana 0,5% ---- sureteric 1% em solução de HCl (ph 4,0) com CaCl 2 0,1M 5) Alginato-quitosana-sureteric Alginato de sódio 2% com Solução de quitosana 0,5% ---- sureteric 0,1% em solução de HCl (ph 4,0) com CaCl 2 0,1M 6) Alginato-quitosana-acryl-eze Alginato de sódio 2% com acryl-eze 0,1% Solução de quitosana 0,5% em solução HCl (ph 4,0) com CaCl 2 0,1M ---- * Nesta coluna encontra-se a nomenclatura estabelecida para os vários processos de microencapsulação e utilizada na discussão dos resultados.

36 22 A solução de alginato de sódio foi atomizada nas soluções descritas de acordo com a primeira etapa da Tabela 2, utilizando-se um bico de duplo fluido. Nos processos que envolveram 2 etapas, as partículas de alginato foram filtradas, lavadas com água Milli Q, e ressuspensas no mesmo reator em solução de quitosana 0,5%. As micropartículas formadas foram mantidas sob agitação por 30 min após o final dos processos listados na Tabela 2. De acordo com a Tabela 2, o procedimento 1 consiste na atomização da solução de alginato diretamente na solução de cloreto de cálcio 0,1M, sem posterior adição de quitosana. Os procedimentos 2, 4, 5 e 6, desenvolvidos em uma única etapa, foram realizados através da atomização da solução de alginato de sódio, com ou sem sureteric ou acryl-eze, diretamente em uma solução de quitosana 0,5%, contendo CaCl 2 0,1M. A quitosana foi dissolvida em solução de HCl com ph 4,0. O procedimento 3 foi desenvolvido em duas etapas. Na primeira etapa, fezse a atomização da solução de alginato de sódio em uma solução de CaCl 2 0,1 M e, na segunda etapa, micropartículas formadas foram recobertas com quitosana, adicionando-se uma solução de quitosana 0,5% dissolvida em solução de HCl (ph4,0). As micropartículas geleificadas foram filtradas a vácuo, lavadas com água por duas vezes e espalhadas cuidadosamente em uma placa de Petri para secagem à temperatura ambiente por 24 horas. Depois de secas, as micropartículas foram mantidas em dessecador para serem posteriormente caracterizadas e submetidas a testes de estabilidade. As partículas com B. lactis foram armazenadas em ambiente refrigerado.

37 Caracterização das micropartículas Microscopia óptica As fotomicrografias foram obtidas com um microscópio óptico modelo Eclipse E 400POL, munido de uma câmara fotográfica NIKON. Foram observadas partículas desidratadas, retiradas na etapa final do processo de encapsulação, acondicionadas em solução de CaCl 2 0,07M e/ou submetidas a tratamento com tampão ph 7,5 com aumento de 40, 100 e/ou 200 vezes Análise granulométrica O diâmetro médio das micropartículas obtidas por atomização e geleificação foi determinado por difração de raio laser, utilizando-se analisador MASTERSIZER 2000 (Malvern Instruments). Através deste equipamento, determinou-se também os valores do diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada, e do diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada Determinação da concentração de cálcio A concentração de cálcio nas soluções resultantes dos processos de atomização foi determinada por potenciometria, com o uso de um eletrodo tipo INGOLD (Mettler Toledo). Para a determinação da concentração de cálcio foi preparada uma curva padrão com cloreto de cálcio para a calibração do equipamento.

38 Avaliação da estabilidade das micropartículas e da liberação de Bifidobacterium lactis em tampão fosfato Para a avaliação do efeito do ph sobre a liberação de células das partículas, foram utilizadas soluções tampões ajustadas em ph 4,5, 6,0 e 7,5 em testes de dissolução com partículas obtidas pelos processos 1, 2, 4, 5 e 6 (conforme Tabela 2). As partículas foram adicionadas na proporção de 0,001g/ml e as soluções resultantes foram submetidas à agitação de 150 rpm (Innova 4000, New Brunswick Scientific), 37 o C, sendo alíquotas retiradas após 5, 30 e 60 minutos para determinação da população de Bifidobacterium lactis liberada das micropartículas. A população bacteriana liberada foi enumerada através da técnica de semeadura em profundidade, conforme descrito no item Sempre que necessário foram efetuadas diluições decimais seriadas em água peptonada 0,1% antes da enumeração por semeadura em profundidade. A integridade das partículas submetidas a ph 7,5 foi monitorada por microscopia óptica. Partículas desidratadas foram adicionadas em tampão fosfato ph 7,5 em uma lâmina onde foi feita a observação do intumescimento e liberação de células das partículas, utilizando-se um microscópio óptico modelo Eclipse E 400POL, munido de uma câmara fotográfica NIKON. As fotomicrografias foram tiradas em intervalos de tempo regulares que demonstrassem as alterações sofridas pelas partículas. 3.7 Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais sem a adição de enzimas A sobrevivência e liberação de células das micropartículas em função do ph foram avaliadas através da simulação de fluidos do trato gastrintestinal sem a adição de enzimas, de acordo com procedimento proposto por Sallans et al. (1988) com modificações. As partículas foram adicionadas em tampão ph 1,5 e incubadas a 37 C por 120 min com agitação de 150 rpm (Innova 4000, New Brunswick Scientific). Em seguida, o ph do meio foi alterado para 5,6 por mais 120

39 25 minutos e, finalmente, alterado para ph 7,5 pelos últimos 120 minutos, totalizando 6 horas de ensaio. A amostragem foi realizada em intervalos pré-definidos de tempo em ph 1,5, 5,6 e 7,5. A sobrevivência de células livres também foi determinada, como uma referência, utilizando-se o mesmo inóculo do processo de microencapsulação acondicionado em salina 0,85% e também como células desidratadas. Também foi realizado um controle com células liofilizadas. Para esse experimento foram preparadas duas soluções tampão com ph 12,0 e 1,5, empregando-se soluções de HCl 1N, NaOH 1N, e os sais NaCl e NaH 2 PO 4.2H 2 O. A mistura desses tampões na proporção adequada resultou nos valores de ph 5,6 e 7, Avaliação da sobrevivência de Bifidobacterium lactis microencapsulado após ação de suco gástrico e entérico formulados com pepsina, pancreatina e bile A sobrevivência e liberação de células das micropartículas foram avaliadas em sucos gástrico e entérico simulados, utilizando-se enzimas do trato gastrintestinal (Gänzle et al., 1999, com alterações). As partículas foram adicionadas ao tampão ph 1,5, contendo pepsina (3g/L) e lipase (0,9mg/L), e incubadas a 37 C por 120 min com agitação de 150 rpm (Innova 4000, New Brunswick Scientific). Em seguida, o ph foi alterado para 5,6 por mais 120 minutos e, finalmente, alterado para ph 7,5 pelos últimos 120 minutos. Nas etapas de simulação dos fluidos entéricos, adicionou-se pancreatina (1g/L) e bile (10g/L) simultaneamente. O experimento totalizou 6 horas de ensaio, sendo a amostragem realizada em intervalos pré-definidos de tempo em ph 1,5, 5,6 e 7,5. A sobrevivência de células livres também foi determinada, como uma referência, utilizando-se o mesmo inóculo do processo de microencapsulação, acondicionado em salina 0,85% e também como células desidratadas, e células liofilizadas tipo DVS (Direct Vat Set).

40 Sobrevivência de células de Bifidobacterium lactis livres e microencapsuladas em leite fermentado Preparo do leite fermentado O leite fermentado foi preparado com leite UHT integral, sendo a fermentação realizada com a cultura Rich (Christian Hansen), composta por uma mistura de Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. A incubação foi realizada a 42 o C por aproximadamente 5 horas, de acordo com as instruções do rótulo do produto. Ao leite fermentado pronto foram adicionadas culturas de Bifidobacterium lactis submetidas a quatro tratamentos diferentes: desidratação em temperatura ambiente, liofilização/congelamento (Bb12, Christian Hansen), encapsulação em alginatoquitosana e encapsulação em alginato-quitosana-acryl-eze. Após a homogeneização, o produto foi acondicionado em tubos Falcon (50ml) que foram armazenados a 8 o C durante 4 semanas. A população sobrevivente de B. lactis foi determinada semanalmente no leite fermentado e também após tratamento simulando condições do trato gastrintestinal com presença e ausência de enzimas gástricas. Em cada amostragem semanal utilizou-se um tubo Falcon para cada tratamento. Foram realizadas três repetições do preparo dos iogurtes Avaliação da população de Bifidobacterium lactis, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus em leite fermentado As populações de Bifidobacterium lactis, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus em leite fermentado foram determinadas após 0, 1, 2, 3 e 4 semanas. As micropartículas foram previamente submetidas a tratamento em tampão fosfato ph 7,5 por 120 min para liberação das células encapsuladas, através da solubilização de 1 ml de leite fermentado em 9 ml de tampão. Outras diluições decimais foram efetuadas em água peptonada 0,1%.

41 27 A contagem das bactérias foi realizada de acordo com a metodologia estabelecida por Adhikari et al. (2000) com modificações. Bifidobacterium sp. foi enumerado em ágar MRS (Oxoid) contendo cloreto de lítio (0,4%), propionato de sódio (0,6%) e L-cisteína (0,05%) pela técnica de semeadura em profundidade e incubação a 37 o C por 72 horas em anaerobiose (Anaerogen, Oxoid). Streptococcus salivarius ssp. thermophilus foram enumerados em ágar ST e ágar M17 (Oxoid) e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus foram enumerados em ágar MRS ph 5,4 com sobrecamada. A incubação foi realizada em aerobiose, a 37 o C para S. thermophilus e a 42 o C para L. bulgaricus por 72 horas Avaliação da sobrevivência de B. lactis em leite fermentado após passagem por teste de simulação de fluidos gastrintestinais com e sem a adição de enzimas Uma alíquota de cada leite fermentado produzido (1mL) foi misturada com tampão ph 1,5, contendo pepsina (3g/L) e lipase (0,9mg/L), e incubada a 37 C por 120 min com agitação de 150 rpm (Innova 4000, New Brunswick Scientific). Em seguida, o ph foi alterado para 5,6 por mais 120 minutos e, finalmente, alterado para ph 7,5 pelos últimos 120 minutos. Nas etapas de simulação dos fluidos entéricos, pancreatina (1g/L) e bile (10g/L) foram adicionados simultaneamente. Cada experimento totalizou 6 horas de ensaio, sendo a retirada de alíquotas realizada em intervalos pré-definidos de 30 e 120 min para ph 1,5 e 120 min para ph 5,6 e 7,5. O mesmo teste também foi realizado sem a adição das enzimas digestivas. Foram realizadas três repetições para cada tratamento Determinação do ph O ph do iogurte foi determinado diretamente nas amostras com o auxílio de um aparelho medidor de ph da marca Digimed-Mod. DMPH-2.

42 Análise estatística Para análise estatística, utilizou-se o planejamento experimental em parcelas subdivididas (Gomes, 1987), recomendável para casos em que se pretende estudar dois ou mais tipos diferentes de tratamentos. Utilizou-se o programa SAS 8.12 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA , Release 8.12, TS2MO) para a execução dos cálculos. A interação tratamento versus tempo também foi desdobrada para a verificação do melhor tratamento dentro de cada tempo. Neste caso, utilizou-se para a comparação múltipla o teste de Tukey.

43 29 4 Resultados e Discussão 4.1 Reativação e cultivo da cultura de Bifidobacterium lactis A reativação e o cultivo de B. lactis foram testados em vários meios de cultura. Notou-se que a adição de L-cisteína (0,05%) foi fundamental para a multiplicação de B. lactis, fato que se justifica pela natureza anaeróbica da bactéria. Dentre os meios testados, optou-se pelo uso de leite desnatado reconstituído com 1% de glicose, 1% de extrato de levedura e L-cisteína (0,05%) para o preparo do inóculo, pois se supõe que uma menor concentração de açúcar resulta em uma menor produção de ácidos, fato benéfico para a manutenção da viabilidade celular por um tempo mais prolongado. Os inóculos preparados para os processos de encapsulação apresentaram uma população de aproximadamente 9,5 log UFC/ml. 4.2 Avaliação de atividade antimicrobiana da quitosana Para a avaliação da atividade antimicrobiana da quitosana, foi utilizado o teste de difusão em poços (Harris et al., 1989) e observada a formação de halos no meio de cultura. Como não houve a presença de halos de inibição da multiplicação do microrganismo ao redor dos poços, conclui-se que a quitosana não apresentou atividade antimicrobiana contra B. lactis nas concentrações testadas de 0,5%, 1,0% e 2,5%.

44 Caracterização de micropartículas obtidas por atomização e geleificação Resultados obtidos com a microscopia óptica, análise de tamanho de partícula e análise da concentração de cálcio Micropartículas com Bifidobacterium lactis foram obtidas pelos processos de atomização com alginato, alginato-quitosana 1 etapa, alginato-quitosana 2 etapas, alginato-quitosana-sureteric 1%, alginato-quitosana-sureteric 0,1% e alginatoquitosana-acryl-eze 0,1% (Tabela 2). De acordo com a microscopia óptica, verificou-se que as partículas produzidas somente com alginato solubilizaram-se totalmente em solução de tampão fosfato ph 7,5 (Figura 2). Por outro lado, partículas produzidas com alginato e quitosana não se solubilizaram completamente quando adicionadas a essa solução por até 60 min (Figuras 3, 4, 5, 6 e 7). Supõe-se que a porosidade das partículas seja um parâmetro fundamental para aumentar ou diminuir a liberação do material encapsulado, e essa porosidade pode variar em função do meio de dissolução e de seu efeito na solubilidade do encapsulante. O alginato é solúvel em ph alcalino, enquanto a quitosana é solúvel em ph ácido, porém com a interação entre esses dois polímeros e o cloreto de cálcio como agente de "crosslinking", forma-se uma matriz complexa, cuja solubilidade pode variar de acordo com as variáveis do processo (concentração dos reagentes, tipo de quitosana, tipo de alginato, interação com outros polímeros, tempo de reação, etc.). Também é importante ressaltar que os polímeros entéricos sureteric e acryl eze foram adicionados à formulação das partículas com o intuito de aumentar a porosidade do material de recobrimento e, consequentemente, aumentar a liberação de células em ph 7,5, mas não em ph ácido. Como não havia referências na literatura sobre a aplicação desses polímeros como aditivo em partículas de alginato-quitosana, foram feitos testes com porcentagens de 0,1% e 1% de sureteric e de 0,1% de acryl eze. Pelas fotomicrografias obtidas com a

45 31 formulações alginato-quitosana-sureteric 0,1% e alginato-quitosana-acryl-eze 0,1% (Figuras 6 e 7), pode-se observar que mesmo após 60 minutos de exposição em ph 7,5 as partículas mantiveram uma estrutura bem definida, porém com uma certa porosidade caracterizada pelo acúmulo de células liberadas e dispersas ao redor das partículas. A formulação com alginato-quitosana-sureteric 1% resultou em partículas que se aglomeraram de forma excessiva e não apresentaram estabilidade em ph 7,5 (Figura 5). O diâmetro médio das partículas, como pode ser observado na Tabela 3, variou de 57,5 a 111,9 µm, dentro de uma faixa granulométrica de 11,0 a 266,9 µm. Como mostram esses resultados, as micropartículas produzidas com quitosana possuem diâmetro médio maior que as partículas de alginato, com exceção das partículas com 1% de sureteric. A determinação do diâmetro médio e as fotomicrografias mostradas na Tabela 3 foram feitas antes da etapa de secagem, quando as partículas tendem a se aglomerar, dificultando a medida do tamanho médio das microesferas. A concentração de cálcio nas soluções utilizadas nos processos de encapsulação variou de 4007 mg/l (solução 0,1M de CaCl 2.2H 2 O) a 2980 mg/l (solução 0,07M de CaCl 2.2H 2 O), após o processo de atomização, o que significa que parte do cálcio adicionado reagiu com o alginato, ou com o complexo alginatoquitosana, participando do processo de formação das partículas.

46 32 Tabela 3. Diâmetro médio das partículas obtidas por diferentes procedimentos de encapsulação. Processo de Fotomicrografias D(4,3)* D(0,1)** D(0,9)*** Span**** encapsulação (200X) µm µm µm 1) Alginato 57, ,6 3,9 2) Alginatoquitosana 103,3 14,1 266,9 4,7 3) Alginatoquitosana 2 etapas 82,5 11,2 200,7 4,1 4) Alginatoquitosanasureteric 1,0% 58,2 11,0 110,8 2,4 5) Alginatoquitosanasureteric 0,1% 108,0 19,2 228,0 2,4 6) Alginatoquitosanaacryl-eze 0,1% 111,9 19,2 218,3 2,4 * D(4,3) = diâmetro médio das partículas em volume. ** D(0,1) = diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada. *** D(0,9) = diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada. **** Span = medida indireta da dispersão ou da largura da distribuição granulométrica. Igual a [d(0,9)-d(0,1)]/d(0,5).

47 33 Partícula seca (100X) 1 min (100X) 5 min (200X) 10 min (200X) 15 min (200X) 30 min (200X) Figura 2. Fotomicrografias das partículas de alginato secas e após 1, 5, 10, 15 e 30 min em tampão fosfato ph 7,5.

48 34 Partícula seca (100X) 1 min (100X) 5 min (100X) 10 min (100X) 30 min (100X) 60 min (200X) Figura 3. Fotomicrografias de partículas de alginato-quitosana secas e após 1, 5, 10, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7,5.

49 35 ' Partícula seca (100X) 1 min (100X) 5 min (100X) 10 min (100X) 30 min (100X) 60 min (200X) Figura 4. Fotomicrografias de partículas do tipo alginato-quitosana 2 etapas secas e após 1, 5, 10, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7,5.

50 36 Partículas secas (40X) 1 min (40X) 5 min (40X) 15 min (40X) 20 min (40X) 30 min (40X) 60 min (40X) 60 min (100X) Figura 5. Fotomicrografias de partículas de alginato-quitosana-sureteric 1% secas e após 1, 5, 15, 20, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7,5.

51 37 Partículas secas (100X) 1 min (100X) 10 min (100X) 30 min (100X) 45 min (100X) 60 min (200X) Figura 6. Fotomicrografias de partículas de alginato-quitosana-sureteric 0,1% secas e após 1, 10, 30, 45 e 60 min em tampão fosfato ph 7,5.

52 38 Partículas secas (100X) 1 min (100X) 15 min (100X) 30 min (100X) 60 min (100X) 60 min (200X) Figura 7. Fotomicrografias de partículas tipo alginato-quitosana-acryl-eze 0,1% secas e após 1, 15, 30 e 60 min em tampão fosfato ph 7,5.

53 Avaliação da liberação de Bifidobacterium lactis das micropartículas em soluções tampão Após a obtenção de diferentes tipos de partículas, alginato, alginatoquitosana 1 etapa, alginato-quitosana 2 etapas, alginato-quitosana-sureteric 1%, alginato-quitosana-sureteric 0,1% e alginato-quitosana-acryl-eze 0,1%, iniciou-se um estudo para a escolha da formulação mais adequada para a manutenção da viabilidade das células de B. lactis e possível aplicação em leites fermentados. Esse estudo consistiu na avaliação da liberação de células das micropartículas em soluções tampão. Assim, com a realização dos primeiros ensaios em tampão, as formulações foram sendo descartadas ou escolhidas para a continuidade dos testes (resistência em fluidos gastrintestinais e aplicação em leites fermentados). Essas formulações foram criadas com o intuito de se utilizar polímeros naturais e atóxicos, o alginato e a quitosana, e ao mesmo tempo polímeros que pudessem aumentar a porosidade da partícula especificamente nas condições do trato intestinal, ou seja, em meios com ph 7,5. Os polímeros escolhidos para aumentar a porosidade foram o acryl eze (polímero a base de ácido metacrílico copolímero tipo C) e o sureteric (polímero a base de polivinilacetatoftalato), que são polímeros com funcionalidade entérica, ou seja, insolúveis em valores de ph abaixo de 5,5 e 4,5, respectivamente, e totalmente solúveis em valores de ph acima de 6,0. Para análise dos resultados, considerou-se que a liberação de B. lactis das partículas de alginato em tampão ph 7,5 foi máxima, o que significa que a população do microrganismo nessas partículas pode ser considerada como um controle, correspondente à população efetivamente imobilizada nos processos testados. Essa afirmação pode ser comprovada com a análise das fotomicrocrafias obtidas após a dissolução das partículas de alginato em tampão ph7,5, uma vez que as partículas de alginato são completamente desintegradas (Figura 2). As partículas tipo alginato-quitosana 2 etapas liberaram uma população de B. lactis 2,7 ciclos logarítmicos menor que as partículas de alginato em ph 7,5,

54 40 após 30 min de reação (dados não tabelados). Por este motivo essa formulação foi descartada para a continuidade dos testes, pois um dos objetivos da encapsulação é promover liberação controlada de células em ph 7,5. Esta diferença pode ter duas explicações: ou as partículas não liberaram 100% das células que foram imobilizadas devido à insolubilidade da sua formulação em ph 7,5, ou as células imobilizadas morreram durante ou após o processo de microencapsulação. Por outro lado, partículas tipo alginato-quitosana-sureteric 1% liberaram uma população de B. lactis de 8,8 log UFC/g após 60 min em tampão com ph 4,5 e de 9,4 log UFC/g após o mesmo período em tampão com ph 6,0 (dados não tabelados). Por esse motivo, essas partículas também foram descartadas para a continuidade do teste, pois, como já foi citado, o objetivo da encapsulação é promover a máxima retenção possível de células em ph 4,5 e a máxima liberação em ph 7,5, e esses valores estão muito próximos da população total de células encapsuladas (aproximadamente 9,5 log UFC/g). Neste caso, a concentração aplicada de sureteric foi muito alta e, provavelmente, desestabilizou a estrutura da partícula. Os resultados dos testes de dissolução das partículas de alginato, alginatoquitosana 1 etapa, alginato-quitosana-acryl-eze e alginato-quitosana-sureteric em soluções tampão ph 4,5, 6,0 e 7,5 estão relatados na Figura 8 e na Tabela 4.

55 41 Tabela 4. Populações de Bifidobacterium lactis (log UFC/g) em partículas tratadas com tampão fosfato ph 4,5, 6,0 e 7,5. ph Tempo de tratamento (min) Alginato Procedimento de encapsulação Alginato quitosana Alginato quitosana sureteric 0,1% Alginato quitosana acryl eze 0,1% 4,5 5 8,5 Aa 7,3 Ba 7,1 Ba 8,1 Aa 30 8,6 Aac 7,7 BCab 7,3 BCae 8,0 ACa 60 8,3 Aa 7,4 Aa 7,4 Aae 7,9 Aa 6,0 5 8,5 Aac 7,0 Ba 6,8 Ba 8,2 Aa 30 8,7 Aac 8,0 Babc 7,6 Bab 8,9 Aab 60 9,8 Ab 8,8 Bbcd 8,2 Bbce 8,8 Bab 7,5 5 8,7 Aac 8,1 Aabc 8,4 Ac 8,2 Aa 30 9,4 Abc 9,1 Ade 9,2 Acd 9,2 Aab 60 9,8 Ab 9,5 Ae 9,6 Ad 9,6 Ab Obs: Para cada linha, valores relacionados com letras maiúsculas iguais não são significativamente diferentes (P 0,05) e para cada coluna, valores relacionados com letras minúsculas iguais não são significativamente diferentes (P 0,05) Log CFU/g ph 4,5 ph 6,0 ph 7,5 Alginato Alginato-quitosana Alginato-quitosana-sureteric 0,1% Alginato-quitosana-acryl-eze 0,1% Figura 8. Populações de B. lactis (log UFC/g) liberadas de partículas de alginato, alginato-quitosana, alginato-quitosana-sureteric 0,1% e alginato-quitosana-acryleze 0,1% após 60 min a 37 o C em soluções tampão ph 4,5, 6,0 e 7,5 a 37 o C.

56 42 Pela Figura 8, pode-se notar que a liberação de células variou em função do ph, sendo a formulação com alginato a que menos reteve as células em ph 4,5 e 6,0. A alta taxa de liberação de células observada em ph 4,5 provavelmente deve-se à porosidade da partícula e erosão do gel. A Figura 8 indica ainda que a simples adição de quitosana, sureteric e acryl-eze, em concentrações adequadas, aumenta a retenção do material encapsulado em ph 4,5 e ph 6,0. Os resultados confirmaram que partículas com quitosana e polímeros entéricos (sureteric e acryleze) retêm os probióticos nas condições de ph ácido em comparação com as partículas tipo alginato, enquanto em ph 7,5 promovem a liberação das células encapsuladas devido à dissolução desses polímeros sensíveis a valores de ph superiores a 4,5. Com a análise estatística, utilizando-se o método de Tukey para comparação múltipla, observou-se que não houve diferença significativa (P 0,05) entre as populações de células liberadas em ph 7,5, considerando-se as formulações alginato, alginato-quitosana, alginato-quitosana-sureteric 0,1% e alginato-quitosana-acryl-eze 0,1%. Por outro lado, houve diferença significativa (P 0,05) entre as populações de células liberadas em ph 4,5 das partículas tipo alginato-quitosana, alginato-quitosana-sureteric 0,1% e alginato-quitosana-acryleze 0,1%, em comparação com as liberadas em ph 7,5. Como o objetivo do trabalho foi o desenvolvimento de partículas para uso em leites fermentados, buscava-se partículas que fossem insolúveis em ph 4,5 e que liberassem as células em ph 7,5, correspondente ao ph intestinal. Assim sendo, analisando a Figura 8, verifica-se que as formulações mais adequadas para atingir o objetivo do trabalho são aquelas que empregam alginato-quitosana e alginato-quitosana com sureteric 0,1% ou com acryl eze 0,1%. Essas formulações foram escolhidas para a realização de testes em fluidos gastrintestinais simulados com e sem a adição de enzimas. A formulação com alginato também continuou a ser utilizada como um controle.

57 Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais Nos últimos anos, muitas pesquisas relacionadas com a sobrevivência de microrganismos em fluidos gastrintestinais têm sido realizadas em soluções tampão que simulam o ph fisiológico do estômago e do intestino, porém sem a utilização de enzimas digestivas, tais como pancreatina e pepsina. Entretanto, é importante a investigação sobre a alteração da taxa de sobrevivência de bactérias em decorrência da aplicação dessas enzimas, pois simulações com a adição de enzimas refletem de forma mais fiel a realidade. Além disso, na presença de nutrientes, como proteínas e lipídeos, a ação da enzima irá originar outras substâncias, como peptídeos, aminoácidos e ácidos graxos, que podem ou não exercer algum efeito protetor sobre células bacterianas. Neste trabalho, foi realizada a avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em fluidos gastrintestinais formulados com e sem a adição de enzimas e os resultados foram diferentes do esperado, já que a pepsina apresentou um efeito protetor sobre as células de B. lactis (Itens e ), e não inibidor como seria esperado. As micropartículas utilizadas para este teste foram previamente desidratadas em temperatura ambiente para facilitar a manipulação, o armazenamento e evitar possíveis contaminações. Como controle de células livres, foram utilizadas células de Bifidobacterium lactis acondicionadas em salina 0,85%, liofilizadas e desidratadas em temperatura ambiente (mesmo processo de secagem aplicado nas micropartículas). Os três tipos de controle de células livres foram submetidos a diferentes níveis de injúria celular devido aos tratamentos previamente estabelecidos e, por isso, também apresentaram resultados distintos nos ensaios de simulação do trato gastrintestinal.

58 Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais sem a adição de enzimas O fluxo gastrintestinal foi caracterizado com a utilização de soluções tampões ph 1,5, ph 5,6 e ph 7,5. As populações de células sobreviventes e/ou liberadas das micropartículas após os testes de simulação podem ser observadas na Tabela 5 e na Figura 9. Pode-se notar que as populações de B. lactis foram reduzidas rapidamente em ph 1,5, chegando ao limite de detecção do teste ( 100 UFC/g) após 60 min, considerando-se todas as formulações e também as células não encapsuladas. Surpreendentemente, quando o ph foi aumentado de 1,5 para 5,6, e depois para 7,5, a população de células viáveis aumentou novamente mostrando que as células encapsuladas puderam sobreviver mesmo após terem sido expostas a um meio extremamente ácido por 120 min. As células não encapsuladas, acondicionadas em salina 0,85% e na forma desidratada, foram adicionadas ao meio em uma concentração inicial de aproximadamente 10 9 UFC/ml e não foram mais recuperadas após os primeiros 60 minutos de ensaio. Isso significa que células livres e células presentes na superfície das partículas não resistem à incubação em meio ácido com ph 1,5 por mais de 60 min. Entretanto, células encapsuladas foram protegidas contra a acidez do meio, sofrendo um grau de injúria menor, e puderam sobreviver após dissolução ou erosão das micropartículas, quando o ph do meio foi alterado para ph 5,6 e 7,5. A recuperação de células manteve-se na faixa de 3,83 a 5,07 log UFC/g em ph 5,6 e entre 5,21 e 6,02 log UFC/g em ph 7,5 após 120 min de ensaio, sendo sempre as maiores contagens obtidas com a formulação alginato-quitosana-acryleze e as menores com a formulação alginato-quitosana. Durante o tratamento com a solução gástrica, as células encapsuladas sofreram uma redução mínima e máxima de 3,58 a 4,29 log UFC/g para as

59 45 formulações alginato-quitosana-acryl-eze e alginato-quitosana, respectivamente, em comparação com as contagens iniciais nas partículas. A sobrevivência de células livres variou de acordo com o grau de injúria celular, pois células desidratadas ou liofilizadas não foram recuperadas após 15 minutos em tampão ph 1,5 (considerando o limite de detecção do teste de 100UFC/g), enquanto células acondicionadas em salina 0,85% foram recuperadas em até 30 min de teste com uma população de 3,07 log UFC/mL. Cui et al. (2000) chegaram a resultados semelhantes encapsulando bífidobactérias em alginato por um método de atomização. A sobrevivência de bifidobactérias encapsuladas (8 logufc/ml) foi superior à de células livres (3logUFC/ml) em simulação de suco gástrico (ph1,5 sem pepsina). Favaro-Trindade e Grosso (2000, 2001, 2002), por outro lado, encapsularam Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis e concluíram que a imobilização em alginato de sódio não foi eficaz na proteção dessas bactérias em soluções ácidas (ph 1,0 e ph 2,0). Esses resultados sugerem que a resistência de Bifidobacterium lactis à acidez pode ser aumentada através da encapsulação em diferentes tipos de micropartículas. Entretanto, fatores como a ação das enzimas digestivas, substâncias protetoras (proteínas do leite) e o grau de injúria das células também devem ser avaliados.

60 46 Tabela 5. População de B. lactis encapsulado e não encapsulado após exposição a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C. ph Tempo (min) Alginato log UFC/g Células encapsuladas Células livres 1 etapa log UFC/g Alginatoquitosana Alginato- quitosana- sureteric 0,1% log UFC/g Alginatoquitosana-acryl- eze 0,1% log UFC/g Células não encapsuladas desidratadas log UFC/g Células liofilizadas tipo DVS log UFC/g Células não encapsuladas em salina 0,85% log UFC/mL 1,5 5,6 7,5 0 9,80 ±0,16 9,50 ±0,29 9,60 ±0,45 9,60 ±0,36 9,00 ±0,39 10,57 ±0,05 9,25 ±0,18 5 5,09 ±0,66 4,70 ±0,35 4,33 ±0,28 5,57 ±0, ±0,48 6,49 ±0,06 6,68 ±0, ,06 ±0,11 5,19 ±0,16 5,41 ±0,14 5,72 ±0,17 2, , ,90 ±0, ,57 ±0,07 4,37 ±0,21 4,72 ±0,01 5,35 ±0,00 2, , ,07 ±0, , , , , , , , , , , , , , , ,18 ±0,37 3,25 ±0,34 3,84 ±0,52 4,73 ±0,10 2, , , ,59 ±0,41 3,59 ±0,25 4,30 ±0,86 5,05 ±0,37 2, , , ,80 ±0,40 3,83 ±0,12 4,18 ±0,54 5,07 ±0,13 2, , , ,74 ±0,92 4,36 ±1,02 4,59 ±0,38 4,77 ±0,12 2, , , ,34 ±0,55 4,91 ±0,84 5,33 ±0,62 5,56 ±0,47 2, , , ,69 ±0,30 5,21 ±0,53 5,59 ±0,59 6,02 ±0,54 2, , ,

61 47 Log UFC/g 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 ph 1,5 ph 5,6 ph 7, Tempo (min) Alginato Alginato-quitosana-sureteric Células não encapsuladas Alginato-quitosana Alginato-quitosana-acryl-eze Células livres desidratadas Figura 9. Populações de B. lactis (log UFC/g) liberadas das partículas e de microrganismos não encapsulados (log UFC/mL), expostos a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C.

62 Avaliação da liberação e sobrevivência de B. lactis em teste de simulação de fluidos gastrintestinais com a adição de enzimas O fluxo gastrintestinal foi caracterizado com a utilização de soluções tampões ph 1,5, ph 5,6 e ph 7,5, com adição de pepsina (3g/L) e lipase (0,9mg/L) ao tampão ph 1,5 e de pancreatina (1g/L) e bile (10g/L) aos tampões ph 5,6 e 7,5. As populações de células sobreviventes e/ou liberadas das micropartículas após simulação de fluidos gastrintestinais com enzimas podem ser observadas na Tabela 6 e na Figura 10. As populações de células liberadas em suco gástrico com enzimas (ph 1,5) mantiveram-se entre 4,23 e 4,96 log UFC/g após 2 horas, o que demonstra que células superficiais foram liberadas e resistiram parcialmente à extrema acidez do meio. Após a alteração do ph do meio, com simultânea adição de bile e pancreatina, as populações liberadas das partículas ficaram entre 5,13 e 6,69 log UFC/g após 120 min em ph 5,6, sendo os valores mínimo e máximo obtidos com as formulações alginato-quitosana e alginato, e entre 6,35 e 7,17 log UFC/g após 120 min em ph 7,5, com as formulações alginato-quitosana e alginato-quitosanaacryl-eze, respectivamente. Com uma análise qualitativa dos resultados, chegou-se a conclusão que as partículas de alginato e alginato-quitosana-acryl-eze foram as que protegeram ou liberaram de forma mais efetiva as células nas condições testadas. Todavia, as diferenças entre as contagens obtidas com todas as formulações testadas foram muito pequenas, menores que 0,8 ciclos logarítmicos após 120 min em ph 7,5. Além disso, pode-se notar que em ph 5,6 as células encapsuladas em alginato foram totalmente liberadas, o que pode ser um fator negativo para a sua aplicação em bebidas lácteas que possuem ph em torno de 4,0 a 5,0. Durante o tratamento com a solução gástrica, as células encapsuladas sofreram uma redução de 2,43 a 3,15 log UFC/g para as formulações alginatoquitosana-acryl-eze e alginato-quitosana, respectivamente, o que demonstra que a adição de enzimas de alguma forma contribuiu para aumentar o fator de proteção

63 49 das células, pois a redução da população de células encapsuladas nas mesmas condições sem a adição de enzimas foi de 3,58 a 4,29 log UFC/g (vide item 4.5.1). A sobrevivência de microrganismos não encapsulados variou de acordo com o grau de injúria celular. Células acondicionadas em salina 0,85% apresentaram maior resistência à solução gástrica do que células encapsuladas, situação que não ocorreu quando o teste foi realizado em soluções tampão sem enzimas. As populações de B. lactis na forma de células livres acondicionadas em salina sofreram apenas uma pequena redução de 9,2 para 8,8 log UFC/ml quando expostas às soluções gástricas. Células desidratadas, as quais passaram pelo mesmo processo de secagem utilizado para células encapsuladas, sofreram redução de 3,45 logufc/g após terem sido expostas a ph 1,5, 5,6 e 7,5 durante as 6 horas de tratamento. Por outro lado, células liofilizadas do tipo DVS (Direct Vat Set) com contagem inicial de 10,57 log UFC/ml foram reduzidas a menos que 2 log UFC/ml (limite de detecção do teste) após 120 minutos de exposição à solução gástrica (Tabela 6). Pode-se afirmar que proteínas do leite ficaram aderidas às células mesmo após a lavagem com salina 0,85% por duas vezes após o cultivo, pois, durante a fermentação, o leite coagulou com a acidificação. Esses resultados demonstram que a tolerância das bactérias às soluções ácidas está diretamente relacionada ao grau de injúria celular, à presença de substâncias protetoras no leite e principalmente à ação da pepsina no suco gástrico. Sem a presença de pepsina, as populações de células livres cultivadas em leite foram reduzidas rapidamente a valores inferiores ao limite de detecção do teste ( 100 UFC/ml) em soluções com ph 1,5. Esses resultados são coerentes com a observação de Conway et al. (1987) que mostraram que bactérias sobrevivem melhor em suco gástrico humano do que em tampões a um mesmo ph, indicando que estudos que utilizam tampões subestimam o potencial de sobrevivência das bactérias in vivo. Mccomas e Gilliland (2003) notaram que as proteínas hidrolisadas do soro causaram aumento significativo na multiplicação de Bifidobacterium longum S9, L. acidophilus O16 e L. acidophilus L-1 em iogurte, o que demonstra que essas bactérias apresentam baixa atividade proteolítica.

64 50 Charteris et al. (1998) afirmaram que as proteínas do leite e a mucina podem atuar como agentes protetores de bactérias probióticas em suco gástrico. Esses pesquisadores observaram que L. casei 2123 e Bifidobacterium infantis apresentaram 100% de resistência aos fluidos simulados do trato gastrintestinal em presença de proteínas do leite. Kos et al. (2000) estudaram a influência da mucina e constituintes do leite, como caseína, proteínas concentradas do soro e leite desnatado, sobre a sobrevivência de L. acidophilus M92 em condições simuladas do trato gastrintestinal com a adição de pepsina, pancreatina e oxgall. Uma maior tolerância aos fluidos gástricos e intestinais foi observada na presença de mucina e proteínas do leite. Os resultados desses pesquisadores mostraram que em suco gástrico simulado com ph 2,0 a população de L. acidophilus M92 sofreu redução de aproximadamente 4,0 log UFC/ml após 2 horas de incubação, e com a adição de caseína e proteínas concentradas do soro, a redução da população desse microrganismo foi de no máximo 1,0 log UFC/ml. Guerin et al. (2003), por outro lado, chegaram a resultados diferentes com a adição de pepsina. Eles pesquisaram a sobrevivência de células de Bifidobacterium bifidum encapsuladas em um gel composto por alginato, pectina e proteínas do soro, após permanência em suco gástrico simulado (ph 1,5 e ph 2,5) com adição de pepsina (10U/ml). Após 1h em ph 1,5, células livres e encapsuladas não foram mais recuperadas, enquanto em ph 2,5 células imobilizadas decresceram aproximadamente 2 ciclos logarítmicos, mas as células livres não sobreviveram após 2h de incubação. Nesse caso, portanto, a pepsina não proporcionou nenhum efeito protetor sobre a bactéria, porém a espécie utilizada foi outra. Comparando os resultados obtidos com células encapsuladas e células livres, nota-se que a encapsulação não aumentou a resistência de B. lactis nas condições testadas considerando-se células acondicionadas em salina. Por outro lado, células encapsuladas também sofreram injúrias com o processo de desidratação e, quando os resultados são comparados com os obtidos com células livres liofilizadas ou desidratadas, verifica-se que nesse caso a encapsulação aumentou a resistência das células. Células livres desidratadas

65 51 foram recuperadas com uma população de 5,35 log UFC/mL após o teste completo de simulação do trato gastrintestinal, enquanto com as micropartículas foram recuperadas populações de 6,35, 6,59, 6,83 e 7,17 log UFC/mL após o ensaio, considerando-se as formulações alginato-quitosana, alginato-quitosanasureteric 0,1%, alginato e alginato-quitosana-acryl-eze 0,1%, respectivamente.

66 52 Tabela 6. Populações de B. lactis encapsulado e não encapsulado após exposição a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C com adição de enzimas do trato gastrintestinal (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5). ph Tempo (min) Alginato log UFC/g Células encapsuladas Células livres 1 etapa log UFC/g Alginatoquitosana Alginato- quitosana- sureteric 0,1% log UFC/g Alginatoquitosana-acryl- eze 0,1% log UFC/g Células não encapsuladas desidratadas log UFC/g Células liofilizadas tipo DVS log UFC/g Células não encapsuladas em salina log UFC/ml 1,5 5,6 7,5 0 9,8 ±0,16 9,5 ±0,29 9,6 ±0,45 9,6 ±0,36 9,0 ±0,39 10,57 ±0,05 9,25 ±0,18 5 4,93 ±0,21 4,61 ±0,11 4,83 ±0,25 5,23 ±0, ±0.18 6,62 ±0,27 8,95 ±0, ,37 ±0,10 4,41 ±0,13 4,71 ±0,02 4,96 ±0, ±0.41 4,30 ±0,15 8,97 ±0, ,35 ±0,20 4,14 ±0,84 4,56 ±0,76 4,89 ±0, ±0.27 3,04 ±0,29 9,00 ±0, ,16 ±0,71 4,62 ±0,49 4,61 ±0,89 5,04 ±0, ±0.14 2,63 ±0,06 9,03 ±0, ,28 ±0,47 4,23 ±0,70 4,59 ±0,67 4,96 ±0, ±0.06 < 2, ,83 ±0, ,44 ±0,52 4,91 ±0,20 5,37 ±0,13 5,45 ±0, ±0.40 < 2, ,79 ±0,56 5,11 ±0,02 5,37 ±0,29 5,51 ±0, ±0.73 < 2, ,69 ±0,64 5,13 ±0,36 5,40 ±0,22 5,41 ±0, ±0.84 < 2, ,81 ±0, ,60 ±0,66 6,19 ±0,33 6,15 ±0,43 7,06 ±0, ±0.44 < 2, ,78 ±0,40 6,29 ±0,38 6,53 ±0,76 6,94 ±0, ±0.78 < 2, ,83 ±0,26 6,35 ±0,58 6,59 ±0,66 7,17 ±0, ±1.05 < 2, ,80 ±0,25

67 53 10,0 9,0 8,0 7,0 Log UFC/g 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 ph 1,5 ph 5,6 ph 7, Tempo (min) Alginato Alginato-quitosana-sureteric Células não encapsuladas Alginato-quitosana Alginato-quitosana-acryl-eze Células desidratadas não encapsuladas Figura 10. Populações de B. lactis (log UFC/g) liberadas das partículas e de microrganismos não encapsulados (log UFC/mL), expostos a ph 1,5 de 0 a 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min, 37 o C, com adição de pepsina no tampão ph 1,5 e de pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5.

68 Efeito da microencapsulação na sobrevivência de Bifidobacterium lactis em leite fermentado e em leite fermentado submetido a condições simuladas do trato gastrintestinal Os resultados obtidos com os testes de simulação do trato gastrintestinal demonstraram que as técnicas de microencapsulação utilizadas podem aumentar a resistência de B. lactis em soluções tampão com ph 1,5 sem a adição de enzimas, e que a adição de pepsina aumenta a tolerância dessa bactéria em soluções simuladas de suco gástrico. Entretanto, o grau de injúria celular deve ser considerado no momento do consumo, e portanto, está diretamente relacionado ao produto em que a bactéria será adicionada. Por esse motivo foi feita uma avaliação da aplicação tecnológica de células de B. lactis encapsuladas em leite fermentado, e da resistência destas bactérias adicionadas ao leite fermentado em condições simuladas do suco gástrico humano. Células livres e encapsuladas foram adicionadas ao leite fermentado e alíquotas foram retiradas semanalmente deste produto para análise da população microbiana e simulação da passagem do produto pelo trato gastrintestinal. Os resultados indicaram que na ausência de pepsina, as populações de B. lactis nos leites fermentados foram reduzidas drasticamente após o contato com tampão ph 1,5, não sendo possível a detecção de células viáveis após 120 minutos. A presença de pepsina influenciou positivamente a recuperação de células viáveis de B. lactis em todas as condições testadas, e as culturas desidratadas apresentaram melhores resultados que as culturas microencapsuladas ou liofilizadas. No caso do leite fermentado contendo as células desidratadas, a população de B. lactis, após o tratamento em suco gástrico com enzimas, foi superior à detectada no produto antes desse tratamento (itens e )

69 Sobrevivência de células de Bifidobacterium lactis livres e microencapsuladas em leite fermentado As populações de Bifidobacterium lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e Streptococcus salivarius ssp. thermophilus presentes no leite fermentado durante 4 semanas de armazenagem sob refrigeração estão apresentadas na Tabela 7. Pode-se notar que no primeiro dia de estocagem, os leites fermentados apresentaram populações de B. lactis de 8,50, 6,18, 6,17 e 5,49 log UFC/ml para as formulações com células liofilizadas, células desidratadas, células encapsuladas em alginato-quitosana-acryl-eze e células encapsuladas em alginato-quitosana, respectivamente. Essas populações foram reduzidas gradativamente, principalmente após a segunda semana de estocagem, chegando a 5,02, 5,78, 5,15 e 4,97 log UFC/ml após 14 dias e a 3,21, 5,35, 4,28 e 2,98 log UFC/ml após 28 dias, respectivamente. Também é importante ressaltar que na formulação com células liofilizadas ocorreu redução de 8,5 a 3,21 ciclos logarítmicos após 4 semanas de estocagem, uma diferença de 5,29 log UFC/ml, enquanto na formulação com células desidratadas houve uma redução de 6,18 a 5,35, diferença de 0,83 log UFC/ml (Tabela 7 e Figura 11), no mesmo período. Com esses resultados, nota-se que as populações de células desidratadas mantiveram-se mais estáveis que as populações de células liofilizadas no leite fermentado. Fazendo a mesma comparação anterior com as formulações com células encapsuladas em alginato-quitosana e alginato-quitosana-acryl-eze, no primeiro caso houve redução de 5,49 a 2,98 log UFC/ml (2,51 log de diferença) e no segundo caso redução de 6,17 a 4,28 (1,89 log de diferença). Observa-se que a encapsulação com alginato-quitosana-acryl-eze foi mais eficiente que a encapsulação com alginato-quitosana na proteção às células de B. lactis em leite fermentado. Entretanto, células desidratadas, em comparação com as células encapsuladas, apresentaram contagens mais altas de B. lactis durante o período de armazenamento (Tabela 7 e Figura 11). Com relação ao L. bulgaricus, notou-se que as populações deste microrganismo mantiveram-se praticamente estáveis na ordem de 8 logufc/ml

70 56 para as formulações com células encapsuladas, mas por outro lado, nas formulações com células livres, as populações deste microrganismo foram reduzidas de 8,5 logufc/ml a aproximadamente 6 logufc/ml após 4 semanas de estocagem (Tabela 7). Este fato mostra que as células livres de B. lactis devem ter influenciado negativamente a sobrevivência de L. bulgaricus no leite fermentado. Com relação às populações de Streptococcus lactis, considerando as análises em ágar ST, obteve-se contagens na ordem de 8 a 9 logufc/ml, e apenas na formulação com células liofilizadas, ocorreu uma redução a 6,5 logufc/ml após 4 semanas de estocagem (Tabela 7). O ph dos leites fermentados variou de 4,2 na primeira semana a 3,9 na quarta semana de armazenamento. Na literatura encontram-se resultados contraditórios em relação à sobrevivência de bifidobactérias encapsuladas em iogurte. Adhikari et al. (2000, 2003) adicionaram células vivas de Bifidobacterium longum microencapsuladas em κ-caragena em iogurte após o processo de fermentação e estocaram o produto a 4,4 o C por 30 dias. Os resultados do estudo mostraram que não houve declínio no número de bactérias encapsuladas, porém a redução no número de células livres foi significativa no iogurte (89,3% para B. longum B6 e 91,8% para B. longum ATCC 15708). Esses pesquisadores concluíram que a microencapsulação protegeu as bifidobactérias do baixo ph do produto, aumentando a sua viabilidade durante o período de estocagem, mas a análise sensorial do produto revelou que a presença de micropartículas, com 235,8 ± 25,6µm, causou uma alteração na textura do produto, perceptível durante o consumo. Sun e Griffiths (2000) relataram que contagens de células livres e imobilizadas (gomas xantana e gelana) não apresentaram diferenças significativas em iogurte durante as primeiras 4 semanas de estocagem, mas houve uma diferença significativa em favor das células encapsuladas observada ao final da quinta, sexta e sétima semana. Favaro-Trindade (2000, 2001), por outro lado, encapsulou Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis em alginato de cálcio e em acetatoftalato de celulose e concluiu que a microencapsulação em acetatoftalato de celulose foi

71 57 efetiva na proteção desses microrganismos em soluções ácidas, embora não tenha sido eficiente quando B. lactis microencapsulado foi inoculado em iogurte. Sultana et al. (2000) encapsularam Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium spp. com uma mistura de alginato 2% preparada com 2% de amido de milho (Hi-maize, um prebiótico) para aplicação em iogurte. Esse estudo mostrou um declínio nas células viáveis de 0,5 log para células encapsuladas e de 1 log para células livres em iogurte após 8 semanas de armazenamento sob refrigeração. Também não houve um aumento significativo na sobrevivência quando as células encapsuladas foram sujeitas à alta acidez e sais de bile. Iyer e Kailasapathy (2005) relataram que a microencapsulação de Lactobacillus spp. com Hi-maize (1%p/v) nas partículas e posterior recobrimento com quitosana aumentaram significativamente a sobrevivência de bactérias encapsuladas em iogurte estocado por 6 semanas, em comparação com células encapsuladas em alginato. No atual estudo, nota-se que a microencapsulação não foi uma técnica efetiva para aumentar a taxa de sobrevivência de B. lactis em leites fermentados.

72 58 Tabela 7. População de Bifidobacterium lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus e Streptococcus salivarius ssp. thermophilus em leite fermentado (log UFC/ml) durante 4 semanas de armazenamento sob refrigeração. Tempo de tratamento (semanas) Microrganismo Tratamento* Bifidobacterium lactis A 8,50 ±0,04 7,76 ±0,06 5,02 ±0,11 4,30 ±0,23 3,21 ±0,38 B 6,18 ±0,09 6,03 ±0,25 5,78 ±0,14 5,59 ±0,03 5,35 ±0,01 C 5,49 ±0,15 5,29 ±0,08 4,97 ±0,11 3,67 ±0,16 2,98 ±0,26 D 6,17 ±0,27 5,64 ±0,11 5,15 ±0,02 4,33 ±0,18 4,28 ±0,21 Lactobacillus bulgaricus A 8,48 ±0,05 8,54 ±0,05 8,31 ±0,02 6,95 ±0,05 5,61 ±0,11 B 8,63 ±0,09 8,53 ±0,04 8,42 ±0,02 7,91 ±0,11 6,58 ±0,08 C 8,53 ±0,04 8,50 ±0,01 8,46 ±0,06 8,41 ±0,03 8,06 ±0,11 D 8,32 ±0,11 8,29 ±0,19 8,41 ±0,17 8,33 ±0,04 8,22 ±0,04 Streptococcus thermophilus A 8,86 ±0,06 8,94 ±0,10 8,60 ±0,11 7,98 ±0,26 6,50 ±0,16 (contagem em ágar ST) B 8,90 ±0,08 8,86 ±0,02 8,83 ±0,01 8,70 ±0,04 8,51 ±0,09 C 8,41 ±0,70 8,98 ±0,03 8,77 ±0,06 8,24 ±0,16 7,88 ±0,31 D 8,40 ±0,42 9,01 ±0,02 8,91 ±0,05 8,65 ±0,22 8,13 ±0,26 Streptococcus thermophilus A 8,70 ±0,03 8,93 ±0,09 7,40 ±0,33 7,68 ±0,30 5,56 ±0,26 (contagem em ágar M17) B 8,78 ±0,11 8,84 ±0,05 8,09 ±0,29 8,74 ±0,07 6,44 ±0,29 C 8,93 ±0,04 7,27 ±0,13 6,91 ±0,21 6,35 ±0,32 7,09 ±0,37 D 9,01 ±0,03 7,61 ±0,14 6,83 ±0,32 7,37 ±0,88 7,21 ±0,48 *Leites fermentados com Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus foram enriquecidos com culturas de Bifidobacterium lactis submetidas a quatro tratamentos diferentes: liofilização (A), desidratação em temperatura ambiente (B), encapsulação em alginato-quitosana (C) e encapsulação em alginato-quitosana-acryl-eze (D).

73 Log UFC/g Tempo (semanas) A B C D Figura 11. População de células de B. lactis (logufc/ml) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginatoquitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosana-acryl-eze (D) em leite fermentado após 0, 1, 2, 3 e 4 semanas de estocagem em refrigeração.

74 Sobrevivência de células de Bifidobacterium lactis livres e microencapsuladas em leite fermentado submetido a condições simuladas de suco gástrico com e sem a adição de enzimas A sobrevivência de B. lactis em leite fermentado foi avaliada em condições simuladas de suco gástrico com e sem a adição de enzimas. Em relação ao teste de simulação de suco gástrico sem a adição de enzimas (Tabela 8), as populações de B. lactis foram reduzidas drasticamente após o contato com o tampão ph 1,5, e não houve recuperação de células após 120 min de exposição a esse meio em todas as amostras testadas, com exceção do leite fermentado com células encapsuladas em alginato-quitosana-acryl-eze, para o qual recuperou-se apenas 1,42 log UFC/ml após mudança de ph a 7,5, valor muito baixo. Considerando-se os dados obtidos após 30 min de reação em ph 1,5, a melhor taxa de recuperação ocorreu no iogurte produzido com células desidratadas não encapsuladas, chegando a 5,26 log UFC/mL no primeiro dia de estocagem, porém notou-se uma queda acentuada na recuperação de células em ph 1,5 ao longo da vida-de-prateleira do produto (Tabela 8). Em relação ao teste de simulação de suco gástrico com a adição de enzimas (Tabela 9 e Figura 12), nota-se que a presença da pepsina (3g/L) e do leite influenciaram de forma significativa a recuperação de células de B. lactis. O melhor resultado foi obtido com as células desidratadas não encapsuladas, as quais foram recuperadas com uma população de até 7 log UFC/ml no primeiro dia de estocagem e de 5,8 logufc/ml após 4 semanas de estocagem (Figura 14). Utilizando-se a formulação com alginato-quitosana-acryl-eze após 1 dia de estocagem foram recuperados 6,13 log UFC/ml após o teste em suco gástrico com enzimas, porém a população recuperada de B. lactis decresceu durante o tempo de estocagem chegando a 2,9 logufc/ml após 4 semanas, nas mesmas condições (Figura 16). Considerando a formulação com alginato-quitosana, a qual foi menos eficaz ainda na proteção às células de B. lactis, foram recuperados 5,27 log UFC/ml após 1 dia e 1,2 log UFC/ml após 4 semanas de estocagem (Figura

75 61 15). No leite fermentado suplementado com células liofilizadas, recuperou-se 4,25 log UFC/mL de B. lactis após 1 dia e <1 log UFC/mL (limite de detecção do teste) após 3 semanas de estocagem (Figura 13). Esse fato indica que, apesar da obtenção de uma população de B. lactis de aproximadamente 8 log UFC/mL no leite fermentado por até 1 semana de estocagem, as células de B. lactis liofilizadas não apresentaram resistência ao suco gástrico. Notou-se também o perfil de liberação controlada para células encapsuladas, que partiram de uma população baixa em ph 1,5 a uma população mais alta em ph 7,5, o que comprova que as células não foram liberadas totalmente em ph 1,5 e 5,6 (Figura 15 e Figura 16). Porém a mortalidade de células devido à injúria já agregada no processo de encapsulação, à ação da acidez do próprio iogurte e à ação da acidez do suco gástrico tornaram esse efeito menos percepitível com o decorrer da vida-de-prateleira do produto. Esse perfil de liberação só é bem delineado em até 1 semana de estocagem (tabela 9, figura 15 e 16). Outro fato relevante é que, no leite fermentado suplementado com células desidratadas, a população de B. lactis, após o tratamento em suco gástrico com enzimas, foi superior à detectada no produto antes desse tratamento. Esse fato indica que a presença de substâncias protetoras e/ou nutrientes na mistura suco gástrico-leite promovem a multiplicação de B. lactis. A pepsina, provavelmente, atuou sobre as moléculas de proteínas formando peptídeos e/ou aminoácidos, tornando estes nutrientes mais biodisponíveis para as bactérias. Neste caso, pode-se levantar também a hipótese que a microencapsulação pode inibir o contato da bactéria com os nutrientes tão necessários para a sua multiplicação e, consequentemente, prejudicar a sua sobrevivência causando um efeito inverso ao esperado. Na literatura alguns trabalhos evidenciam a natureza não proteolítica de algumas bactérias probióticas, o que torna a sua multiplicação lenta e dependente da utilização de suplementos. Dave e Shah (1998) afirmaram que a adição de cisteína, concentrado de proteínas do soro, hidrolisado ácido de caseína ou triptona aumentaram a viabilidade de bifidobactérias durante o processo de fermentação. Mccomas e

76 62 Gilliland (2003), como já foi citado, também notaram que as proteínas hidrolisadas do soro causaram aumento significativo na multiplicação de Bifidobacterium longum S9, L. acidophilus O16 e L. acidophilus L-1 em iogurte, o que demonstra que essas bactérias apresentam baixa atividade proteolítica. Sihata e Shah (2000) relataram que Bifidobacterium spp. podem ser classificadas como culturas não proteolíticas e este fato pode explicar porque a multiplicação de bifidobactérias requer suplementação de peptídeos e de aminoácidos. Segundo esses autores, ainda, as bactérias do iogurte (Streptococcus salivarius ssp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) são altamente proteolíticas quando comparadas com bactérias probióticas (especificmente Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium ssp.), pois elas liberam altas concentrações de aminoácidos livres e demonstram maior atividade de aminopeptidases e de dipeptídases. Como resultado, bactérias de iogurte multiplicam-se mais rápido em leite do que bactérias probióticas que requerem um suplemento de peptídeos e aminoácidos para aumentar a sua taxa de crescimento. Lima (2005) estudou a resistência de bactérias probióticas à passagem pelo trato gastrintestinal empregando modelos simulados constituídos por solução de NaCl (0,5%p/v) contendo pepsina no suco gástrico (ph1,5, 2,0, 2,5 e 3,0) e pancreatina e bile no suco entérico (ph 8,0). Os resultados de sua pesquisa revelaram que a transferência das células para o suco entérico resultou na reversão parcial da injúria causada pelo suco gástrico e, além disso, foi demonstrado que o leite pode proteger as bactérias do estresse decorrente da passagem pelo trato gastrintestinal simulado. Pode-se, então, sugerir que com a atuação da pepsina sobre o leite fermentado houve a liberação de peptídeos e/ou aminoácidos que intensificaram a multiplicação de B. lactis causando a recuperação de células injuriadas e promovendo a sua multiplicação.

77 63 Tabela 8. População de células de B. lactis (log UFC/mL) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginato-quitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosana-acryl-eze (D) em leite fermentado antes e após exposição a suco gástrico simulado (37 o C, 150rpm) sem adição de enzimas gástricas e entéricas com 0, 1, 2, 3 e 4 semanas de estocagem em refrigeração. Tratamento Tempo ph Tempo (semanas) (min) A 0 8,50 7,76 5,02 4,30 3, ,5 4,78 3,34 1,58 1,00 1, ,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,6 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 B 0 6,18 6,03 5,78 5,59 5, ,5 5,26 4,25 3,34 3,09 3, ,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,6 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 C 0 5,49 5,29 4,97 3,67 2, ,5 3,21 2,58 1,62 2,02 1, ,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,6 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 D 0 6,17 5,64 5,15 4,33 4, ,5 3,65 3,2 2,36 2,12 1, ,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,6 1,00 1,00 1,00 1,00 1, ,5 1,42 1,00 1,00 1,00 1,00

78 64 Tabela 9. População de células de B. lactis (log UFC/mL) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginato-quitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosana-acryl-eze (D) em leite fermentado antes e após exposição a suco gástrico simulado (37 o C, 150rpm) com adição de pepsina e lipase no tampão ph1,5 e de pancreatina e bile nos tampões ph5,6 e 7,5 com 0, 1, 2, 3 e 4 semanas de estocagem em refrigeração. Tratamento Tempo ph Tempo (semanas) (min) A 0 8,50 Ai 7,76 Bg 5,02 Cg 4,30 Di 3,21 Ef 30 1,5 5,86 Aak 4,59 Ba 3,50 Cab 2,44 Da 1,50 Eai 120 1,5 4,74 Abh 3,12 Bb 1,80 Cc 1,00 Db 1,00 Db 240 5,6 4,24 Ach 3,04 Bb 1,77 Cc 1,00 Db 1,00 Db 360 7,5 4,25 Ach 3,09 Bb 1,80 Cc 1,00 Db 1,00 Db B 0 6,18 Aj 6,03 ABh 5,78 BCh 5,59 CDd 5,35 D 30 1,5 6,93 Ad 7,10 Ac 6,93 Ad 6,36 Bc 5,76 Cc 120 1,5 6,98 Ad 7,04 Ac 6,89 ABd 6,56 Bc 5,79 Cc 240 5,6 7,02 Ad 6,99 Ac 6,60 Bd 5,70 Cd 5,47 Cd 360 7,5 7,08 Ad 7,10 Ac 7,01 Ad 6,42 Bc 5,80 Cc C 0 5,49 Agk 5,29 ABf 4,97 Bg 3,67 Cg 2,98 Df 30 1,5 3,87 Aef 3,46 Bce 2,82 Ce 2,26 Da 1,78 Eea 120 1,5 3,58 Ae 3,20 Abc 2,53 Bef 2,51 Bae 1,85 Ce 240 5,6 3,96 Af 3,25 Bbc 2,21 Cf 2,10 Ca 1,19 Dbi 360 7,5 5,27 Ag 4,58 Ba 2,85 Ce 2,67 Ce 1,20 Dbi D 0 6,17 Aj 5,64 Bf 5,15 Cg 4,33 Di 4,28 Dh 30 1,5 4,57 Abch 3,86 Bd 3,33 Ca 3,33 Cfg 3,02 Df 120 1,5 4,19 Ac 3,79 Bde 3,25 Ca 2,92 Deh 2,48 Eg 240 5,6 4,58 Abch 4,15 Bd 3,19 Ca 3,00 Cfh 1,81 Dae 360 7,5 6,13 Aaj 5,43 Bf 3,76 Cb 3,51 Cg 2,90 Df Obs: Para cada linha, valores relacionados com letras maiúsculas iguais não são significativamente diferentes (P 0,05) e para cada coluna, valores relacionados com letras minúsculas iguais não são significativamente diferentes (P 0,05).

79 log UFC/mL Tempo (semanas) A B C D Figura 12. População de células de B. lactis (log UFC/mL) liofilizadas (A), desidratadas (B), encapsuladas em alginatoquitosana (C) e encapsuladas em alginato-quitosana-acryl-eze (D) em leite fermentado estocado por 0, 1, 2, 3 e 4 semanas sob refrigeração, após tratamento com fluidos gastrintestinais simulados (ph 1,5-5,6-7,5, 37 o C, 150rpm, 360 min) com adição de pepsina na solução ph 1,5 e de pancreatina e bile nas soluções ph 5,6 e ph 7,5.

80 Log UFC/mL ph 1,5 30 ph 1,5 120 ph 5,6 240 ph 7,5 360 Tempo (min) 0 semanas 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas Figura 13. População de células liofilizadas de B. lactis (log UFC/mL) em leite fermentado estocado por 0, 1, 2, 3 e 4 semanas sob refrigeração, após exposição a ph 1,5 com 30 e 120 min, posteriormente a ph 5,6 de 121 a 240 min e finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min (37 o C, 150 rpm), simulando um tratamento com fluidos gastrintestinais com adição de enzimas e bile (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões ph 5,6 e 7,5).

81 8 i 7 6..J 5 E Õ LL 4 => C) o, i, I 240 osemanas.1 semana O 2 semanas O3 semana Figura 14. População de células desidratadas de B. lactis (Iog UFC/mL) em leite f semanas sob refrigeração, após exposição a ph 1,5 com 30 e 120 min, posterio finalmente a ph 7,5 de 241 a 360 min (37 C, 150 rpm), simulando um tratamento com enzimas e bile (pepsina e lipase no tampão ph 1,5 e pancreatina e bile nos tampões p