São substâncias que, quando injetadas em pacientes causam elevação da temperatura corporal (pirexia ou febre), podendo ser:
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- Marisa da Rocha Lage
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1 CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO UNIFRA CURSO DE FARMÁCIA CONTROLE BIOLÓGICO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS São substâncias que, quando injetadas em pacientes causam elevação da temperatura corporal (pirexia ou febre), podendo ser: EXÓGENOS: Se originam fora do corpo e induzem elevação térmica quando injetados em animais e no homem. Prof. Marcos R. dos Santos Exemplos: Origem bacteriana (e seus componentes Gram (+) e Gram(-), fungos, vírus e não-microbiana (alguns fármacos, esteróides, frações do plasma). ENDÓGENOS: É produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao pirogênio exógeno (considerado o mediador primário da febre). Exemplos: diferentes substâncias sintetizadas por diferentes células do hospedeiro. Quando purificadas são denominadas de lipopolissacarídeos (LPS) para enfatizar a sua natureza química, quando não purificadas podem conter lípides, carboidratos e proteínas. IMPORTANTE: São termoestáveis, porém inativadas por ciclos de calor seco, condições alcalinas ou ácidas, capazes de provocar profundas alterações fisiológicas quando administradas via parenteral. Constituem uma classe de PIROGÊNIO, são complexos de alto peso molecular associados à membrana externa de bactérias Gram(-) negativas e representam a mais significativa fonte de contaminantes pirogênicos de produtos estéreis para a indústria farmacêutica. Devido a estas propriedades, fica evidente a necessidade de sua detecção e eliminação por parte de fabricantes de produtos parenterais. 1
2 A estrutura química das endotoxinas consiste de um polissacarídio, ou longas cadeias de açúcares, e uma gordura, lipídio A. O polissacarídio, que varia de uma espécie bacteriana para outra, é composto da cadeia 0-específica (construída por unidades que se repetem, de três a oito açúcares) e os núcleos interno e externo. O lipídio A contém duas glicosaminas modificadas por fosfato (PO 4 ) e número variável de ácidos graxos. Quimicamente as ENDOTOXINAS são LIPOPOLISSACARÍDIOS LPS CADEIA LATERAL O- ESPECÍFICA NÚCLEO OLIGOSSACARÍDIO UNIDADE LIPÍDICA POLISSACARÍDIO LIPÍDIO A (Caráter hidrofílico aumenta a potência) (Função principal na endotoxicidade) 2
3 PRODUÇÃO DE MEDIADORES POR ESTIMULAÇÃO DOS MACRÓFAGOS POR ENDOTOXINAS LIPOPOLISSACARÍDIO (LPS) Proteína de ligaçãolipopolissacarídica (PLL) Receptor CD14 para complexo LPS-PLL Mediadores da febre Mensagem estimulatória Lipopolissacarídio (LPS) (laranja), liga-se à proteína de ligaçãolipopolissacarídica (PLL) (verde) no sangue. Então o complexo ativa o receptor conhecido como CD14, estimulando os macrófagos a produzirem mediadores (esferas vermelhas). MACRÓFAGO NÚCLEO Muitas atividades biológicas são atribuídas à unidade lipídeo A da endotoxina, a exemplo: - pirogenicidade; - toxicidade letal; - leucopenia seguida de leucocitose; - necrose da medula óssea; - queda da pressão sanguínea; - agregação plaquetária. - outros fatores. NÍVEIS DE CONTAMINANTES PIROGÊNICOS EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS Os limites máximos de endotoxinas (K) em produtos farmacêuticos, atualmente considerados aceitáveis pelo FDA, USP, Farmacopéia Européia e WHO são: Classe de produto Rota de administração Limite máximo de endotoxina (K) (Unidades de Endotoxina EU) Pessoa Parenterais Intratecal 14 0,2 Radiofármacos Intravenosa 175 2,5 Parenterais (exceto radiofármacos) Parenterais (exceto intratecais) Kg 350 5,0 Pode ser realizada de duas formas: - Inativação - Remoção de endotoxinas Hidrólise Ácido-Base reduz ou elimina a atividade biológica de lipopolissacarídeos, pela desativação do lipídeo A. Ex: HCl ( 30 min a 100 C) Oxidação Possivelmente através da oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeos A do LPS. Ex: H2O2. Alquilação Promove a redução da atividade via substituição nucleofílica na ligação glucosamina do lipídeo A. Ex: Óxido de etileno. 3
4 Tratamento por calor seco estufas e túneis de convecção, condução ou irradiação (infravermelho), para materiais termorresistentes. Ex: ( 250 C 30 min). Radiação ionizante Uso de 60 Co para a redução da toxicidade de endotoxinas bacterianas. Com este processo, aumenta a possibilidade de alterações químicas desconhecidas em fármacos e soluções parenterais. Polimixina B Antibiótico catiônico que pode anular a atividade biológica do LPS. Lavagem Utilizando solventes estéreis e apirogênicos. Destilação A água recentemente destilada, coletada e mantida em frascos estéreis e apirogênicos. Ultrafiltração Uso de membranas com capacidade de retenção de moléculas com tamanho de daltons ou maiores. Outros métodos: Osmose reversa, carvão ativo, atração eletrostática, atração por membranas hidrófoba. Deve-se ressaltar a importância em trabalhar todo o processo produtivo em condições adequadas de higiene, dos operadores e ambiente, além de empregar matérias-primas com baixas cargas microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado. Em resumo, aplicar todos os conceitos de BPF, de forma que o produto seja obtido apirogênico no primeiro processamento, dispensando preocupações quanto processos ou tratamentos adicionais. 1 Teste da hipertermia em coelhos 2 Método do lisado de amebócitos do Limulus (LAL) - gelificação - turbidimétrico - cromogênico 3 Ensaio da cultura da linhagem de células Ex.: Células Mono Mac-6 4
5 Teste da hipertermia em coelhos ( PIROGÊNIOS) Pág: 226 Farmacopéia 5 edição O teste Oficial de Pirogênios em coelhos foi descrito inicialmente na USP XII em 1942: Fundamenta-se na medida do aumento da temperatura corporal dos coelhos, após injeção intravenosa de dose-limite de 10 ml por Kg de peso, durante período não superior a 10 minutos, de solução estéril da substância ativa ou produto farmacêutico sob análise. Seleção dos animais: - coelhos adultos e sadios; - preferencialmente da mesma raça; - pesando no mínimo 1,5 kg; - mantidos em gaiolas individuais, livre de perturbações e sob temperatura controlada (20 C ± 2 C); - a reutilização de animais só pode ser feita após 48 horas de descanso, desde que o resultado não tenha sido positivo. Neste caso, será necessário um período de 2 semanas de intervalo. Registro de temperatura: - Utilizar termômetro clínico de precisão, graduado em 0,1 C, com tempo de elevação máxima previamente determinado ou qualquer outro dispositivo de registro de temperatura de igual sensibilidade. - Introduzir no reto do animal à profundidade aproximada de 6 centímetros. - Se for utilizado registrador, que deva permanecer no reto durante o período de teste, conter os coelhos de maneira que fiquem em postura natural de repouso. 5
6 Adaptação dos animais: Uma semana antes e até o dia anterior ao ensaio realizar testes de adaptação simulando as condições do dia do teste: - acomodar o animais nas caixas de contenção e empregar o termômetro - injetar solução fisiológica estéril (10 ml/kg) simulando a amostra - acompanhar e anotar as variações de temperatura. Valores acima de 0,3ºC entre as leituras podem indicar possibilidade de falso-positivo - suprimir a alimentação na noite anterior ao ensaio e durante sua realização Preparação da amostra: - todos os utensílios utilizados para a diluição/preparação da amostra devem ser apirogênicos: vidraria: 200 ºC 1 h ou 250 ºC 30 min. solução fisiológica: 121ºC 15 min. x 3 ciclos - realizar a diluição no dia do teste - dose: 0,5 a 10 ml/kg de solução na concentração especificada na monografia do produto - aquecer a solução à 37 38ºC antes de injetar Procedimento do ensaio: - Utilizar 3 animais para cada amostra. - No mínimo 40 minutos antes do ensaio determinar a temperatura controle (inicial) de cada animal mediante duas leituras feitas com intervalos de 20 minutos. A média das temperaturas é considerada como o valor de T ºC controle do animal, que é a base para a determinação de qualquer aumento de temperatura resultante da injeção da solução teste durante o ensaio. - Não devem ser usados os animais que apresentarem desvio maior do que + 0,2 C, nas duas leituras da temperatura controle. Procedimento do ensaio: - A dispersão da T ºC controle entre os animais de cada grupo não deve ser superior a 1,0 C - Não usar animais com temperatura superior a 39,8 C. - Injetar pela veia marginal da orelha de três coelhos a quantidade indicada na monografia. A injeção não deve durar mais de 10 minutos, a menos que na monografia se especifique tempo diferente. - Registrar a temperatura nos tempos de 1:00, 2:00 e 3:00 horas após a injeção 6
7 Interpretação dos resultados: Se nenhum coelho apresentar um aumento individual de temperatura igual ou superior 0,5 C, em relação à t emperatura controle e a soma dos aumentos dos três não exceder a 1,4 C, o produto cumpre com os requisitos do teste de pirogênios. Se algum dos coelhos apresentar um aumento igual ou superior a 0,5 C, repete-se o teste com outros 5 co elhos. Neste caso, se não mais que 3 coelhos apresentarem aumentos individuais de 0,5 C ou, se a soma dos 8 aumentos individuais de temperatura não exceder a 3,3 C, o produto em exame cumpre com os requisitos do teste de pirogênios. DESVANTAGENS - Baixa sensibilidade - Custo elevado - Interferências na resposta - Uso de animais - Qualitativo VANTAGENS - Reproduz resposta fisiopatológica - Detecta pirogênios Nestes casos a especificidade da resposta está intimamente relacionada com endotoxinas, excluindo outras substâncias termogênicas. Teste de toxicidade de pirogênio bacteriano em embrião de galinha. Resposta tóxica em camundongos. Redução de ferro em ratos. 7
8 ( ) Farmacopéia Brasileira 5 pág pág:: 227 MÉTODO DO LISADO DE AMEBÓCITOS DO LIMULUS - LAL Princípio: O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado. Utiliza Utiliza--se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como reagente LAL. MÉTODO DO LISADO DE AMEBÓCITOS DO LIMULUS - LAL Princípio: É um método in vitro onde diluições da amostra são misturadas com uma solução do lisado de amebócitos do caranguejo Limulus Polyphemus. No caso da presença de endotoxinas bacterianas na amostra sob análise, estas produzem uma reação de gelificação com o lisado através de um processo enzimático, possibilitando a determinação semi-quantitativa da presença de endotoxinas em produtos farmacêuticos. 8
9 Informações gerais do ensaio - Farmacopéia Brasileira: Há duas técnicas com sensibilidade diferente para este teste: 1. MÉTODO DE COAGULAÇÃO EM GEL: baseado na formação de coágulo ou gel (método semi-quantitativo) 2. MÉTODOS FOTOMÉTRICOS quantitativos que incluem: O MÉTODO TURBIDIMÉTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um substrato endógeno); O MÉTODO CROMOGÊNICO (baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um complexo peptídeo sintético cromógeno). Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que indicado contrário na monografia. Informações gerais do ensaio - Farmacopéia Brasileira: - Vidrarias e descartáveis: - Padrão de referência de endotoxinas (PRE) e padrão de endotoxina (PE): Todas as vidrarias devem ser despirogenisadas em estufa usando um processo validado. Utilize um tempo e temperatura mínimos de 250 ºC por 30 minutos. Se utilizar descartáveis plásticos, como ponteiras e pipetas usem somente os certificados que indicam ser livres de endotoxinas para não haver interferência no teste. - Teste da sensibilidade do reagente LAL (confirmar a sensibilidade declarada do regente). - Teste de inibição ou potencialização (determinar possíveis interferências da amostra sobre o ensaio). - Máxima diluição válida (diluição da amostra em que não há endotoxina detectável). Ponto final de Gelificação O mais simples e amplamente usado dos procedimentos para detecção de endotoxinas baseia-se na gelificação. Método de escolha para testes em números reduzidos ou não freqüentes, para amostras que turvem ou com expectativa de resultado negativo. Exemplo: Monitoramento em processos de materiais e da água. Ensaios Turbidimétricos Permite melhor medida quantitativa da endotoxina em grandes faixas de concentrações. Concentração de endotoxinas x aumento da turbidez Uso em monitoramentos diários de água, permitindo medidas de ação corretiva em caso de desvio de padrão da qualidade. Necessidade de elaboração de curva padrão de endotoxinas, para interpolação dos resultados obtidos a partir das avaliações das amostras. 9
10 Ensaios Cromogênicos Reação positiva: positiva: Formação de gel gel.. A reação enzimática é interrompida no final do tempo préestabelecido pela adição de reagente, antes das leituras. Espectrofotômetro (405 nm). Necessidade de elaboração de curva padrão de endotoxinas, para interpolação dos resultados obtidos a partir das avaliações das amostras. Outros métodos - ensaios de microdiluição. - ensaio de LAL radiomarcado e fluorescente ENSAIO DO LISADO DE AMEBÓCITOS DO LIMULUS RESULTADOS FALSO NEGATIVOS agentes desnaturantes soro ou plasma ph < 3 ou > 9 Microplate Absorbance Readers íons cálcio > 0,67 M lipídios, emulsões para infusão glutationa, acetil cisteína cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina penicilinas semi-sintéticas bactérias Gram (+) : Achromobacter 10
11 Método alternativo para teste de pirogênios, fundamentado no efeito das endotoxinas bacterianas, que induzem a secreção de Interleucina- 6 por monócitos humanos ou linhagens de células monocíticas. DETERMINAÇÃO DE IL-6, IL-1β e TNFα POR ELISA Verificar o LIMITE DE ENDOTOXINAS (UE/mL ou mg) preconizado para a amostra nas farmacopéias - Se não citado, deve-se calcular: L. E. = K/M onde: L. E. = limite de endotoxina M = dose humana máxima/kg ou por 70 kg administrada numa injeção por hora. K = 5 UE/kg (parenterais); 2,5 UE/kg (radiofármacos); 0,2 EU/ kg (parenterais adm. intratecal) EXEMPLO: Calcular a MÁXIMA DILUIÇÃO VÁLIDA (MDV) para a amostra: MDV = Limite de endotoxinas UE/mL sensibilidade do lisado (λ) Produto: Diclofenaco de sódio Dose máxima por Kg (M): 1,07 mg/kg ou 75 mg/70 kg Forma de apresentação: Ampola de 75mg/3 ml Sensibilidade do Lisado (λ): 0,06 EU/ml OU MDV = Limite de endotoxinas UE/mg ou UE/UI x [ ] do produto sensibilidade do lisado (λ) L.E. = 5 UE/Kg = 4,7 UE/mg 1,07 mg/kg MDV = 4,7 UE/mg x 25 mg/ml = 1958 ou 1/1958 0,06 UE/ml 11
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