VERIFICAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE DE ENDOTOXINA EM ÁGUA

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1 VERIFICAÇÃO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE DE ENDOTOXINA EM ÁGUA Leandro Raimundo da Silva 1, Karyne Mourthe Miranda 2, Sibele Aryadne da Silva 3, Carla Martins Pittella 4 1 SENAI, Campus CETEC, Belo Horizonte, Brasil, leandro.raimundo@fiemg.com.br 2 SENAI, Campus CETEC, Belo Horizonte, Brasil, kmourthe@fiemg.com.br 3 SENAI, Campus CETEC, Belo Horizonte, Brasil, sibele.silva@fiemg.com.br 4 IGTEC, Belo Horizonte, Brasil, carla.pittella2007@yahoo.com.br RESUMO O Laboratório de Endotoxina faz parte do Instituto SENAI de Tecnologia de Alimentos e Bebidas (IST A&B), que atende à demanda de hospitais, clínicas, laboratórios farmacêuticos e centros para tratamento de hemodiálise do estado de Minas Gerais e de outros estados do país, realizando análises de detecção de endotoxina bacteriana em água. O processo de verificação de metodologia em laboratórios garante a confiabilidade dos processos envolvidos. Para determinar a precisão do método uma amostra foi analisada dez vezes pelo mesmo analista, os resultados apresentaram boa repetibilidade. Houve participação em interlaboratorial e todos os resultados estavam dentro do esperado. Em paralelo foram analisados outros requisitos de rotina determinantes para a verificação do método como o teste de sensibilidade do kit e apresentação de possíveis interferentes do processo, apresentado pelo diagrama de Ishikawa. Palavras-chave: verificação, metodologia, endotoxina. INTRODUÇÃO O Laboratório de Endotoxina atende à demanda de hospitais, clínicas, laboratórios farmacêuticos e centros para tratamento de hemodiálise do estado de Minas Gerais e de outros estados do país, realizando análises de detecção de endotoxina bacteriana em água. O parâmetro é exigido pela Resolução Nº 11 de 13/03/2014 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária [1], que dispõe sobre o regulamento técnico para o funcionamento dos serviços de diálise e pela RDC nº 8, de 02 de janeiro de 2001, que aprova o regulamento técnico que institui as boas práticas de fabricação do concentrado polieletrolíticos para hemodiálise - CPHD [2], e outras legislações nacionais e internacionais para diversos tipos de água. O ensaio e preparo de materiais para a detecção de endotoxina bacteriana presente na água são realizados de acordo The United States Pharmacopeial USP [3]. Os kits para detecção de endotoxina encontrados no mercado são compostos por padrão de endotoxina bacteriana e reagente produzido a partir do lisado de amebócitos do crustáceo Limulus (Limulus Amebocyte Lysate - LAL) liofilizados. A água utilizada como reagente deve ser isenta de endotoxina, ou seja, apirogênica. Os kits são acompanhados de um certificado de análise emitido pelo fabricante e as informações contidas nele são de fundamental importância para a preparação das diluições necessárias para sua utilização no ensaio [4]. O reagente LAL só deve ser utilizado após a confirmação da sensibilidade declarada pelo fabricante. Sendo assim, a cada novo lote são realizados testes de sensibilidade, antes do ensaio de detecção de endotoxina propriamente dito [5]. A reação do kit é baseada na formação de gel, que ocorre quando a enzima de coagulação dos amebócitos do Limulus é ativada pela endotoxina. Quando ocorre à formação de gel firme, é confirmada a presença de endotoxina, caracterizando a amostra como positiva [6]. OBJETIVO Estudo de verificação da aplicação do método gel-glot pelo Limulus Amebocyte Lysate para determinação de endotoxinas em água para diálise, de acordo The United States Pharmacopeial, no Laboratório Endotoxina. MATERIAIS E MÉTODOS Amostra usada para verificação A escolha da amostra de água foi feita de forma aleatória, dentre as amostras recebidas para análise de rotina pelo Laboratório Endotoxina em Março/2014. Com a finalidade de caracterizar a fonte desta amostra, foi feito um levantamento dos resultados das análises anteriores de endotoxina, referentes às amostras coletadas periodicamente, sempre no mesmo ponto do sistema 1

2 de diálise, pela mesma clínica. A Figura 1 representa o histórico dos dados dessas amostras entre novembro/2011 e dezembro/2013. Figura 1. Histórico da detecção de endotoxinas pelo método LAL (USP, 2011) em amostras coletadas periodicamente no mesmo ponto do sistema de diálise, pela mesma clínica, no período de novembro/2011 a dezembro/2013. Reagentes do kit de análise para endotoxinas Endosafe (Charles River) Lisado do amebócito do Limulus (LAL): reagente obtido do extrato aquoso de amebócitos do caranguejo ferradura (Limulus polyphemus). O reagente LAL deve ser estocado entre 2 C e 8 C no frasco de origem. Após a reconstituição com água isenta de endotoxina, o LAL deve ser estocado abaixo de -18 C por 28 dias, ou entre 2 C e 8 C por 24 horas. Após a reconstituição, agite suavemente o frasco, se necessário, para homogeneizar a solução. O reagente reconstituído só pode ser congelado e descongelado uma única vez. Endotoxina padrão: molécula complexa e tóxica que compõe a parede celular de bactérias Gram negativas, derivada de E. coli 055:B5. Após reconstituição com água isenta de endotoxina e de acordo com o certificado de análise do reagente, o material pode ser estocado entre 2 C e 8 C por 4 semanas. A solução deve ser agitada durante 05 minutos no agitador de tubos logo após ser reconstituída. Sempre que uma série de diluição for efetuada, a solução diluída deve ser homogeneizada no agitador tipo vortex, por 1 minuto, antes de proceder à diluição seguinte. Água apirogênica: água reagente isenta de endotoxina. RESULTADOS E DISCUSSÕES Teste de sensibilidade do kit de análise para endotoxinas Charles River Endosafe Foram realizados testes em quadruplicata com água apirogênica, do padrão de endotoxina e do reagente LAL para comprovação da sensibilidade do kit declarada pelo fabricante (0,125 EU/mL). O cálculo e a interpretação dos resultados são baseados na formação de gel firme nos tubos de reação das séries de diluição para as concentrações de 2 λ, λ, λ/2 e λ/4, onde λ é a sensibilidade declarada do LAL em UE/mL, que corresponde à concentração mínima de endotoxina padrão que adicionada ao LAL produz um gel firme, nas condições de operação. Após a realização do teste de sensibilidade de LAL, foram encontrados resultados de acordo com a Tabela 1. Lote LAL: D2712L Lote Endotoxinas: EX22512 Tubos e= log 10 e e / 4 R= 10 m ,90-3,60-0,90 0,125 2

3 , , ,90 Temperatura Inicial: 37,3 C Temperatura Final: 37,3 C Data de Despirogeinização: 18/06/2013 Analista: Leandro Controle negativo: negativo Controle positivo: positivo Tabela 1. Teste de sensibilidade do kit de análise para endotoxinas Charles River Endosafe Foi observada formação de gel firme em alguns tubos de reação indicando que a presença de endotoxina nas diluições. O cálculo foi feito pela média geométrica logarítmica dos pontos finais de formação de gel e o antilog da média. O resultado encontrado (R= 10 m ) comprovou que o kit estava dentro da faixa de detecção de endotoxina esperada (2λ R.λ/2). Repetibilidade do ensaio de detecção de endotoxina bacteriana em amostra de água As análises de detecção de endotoxina na amostra de água previamente escolhida foram realizadas após comprovação da sensibilidade dos reagentes do kit. Para os ensaios, a amostra de água foi analisada em uma curva de diluição (1/2 a 1/20) em duplicata. Para determinar a presença de possíveis interferentes que pudessem inibir a reação, a amostra não diluída foi positivada com endotoxinapadrão. Para comprovar a viabilidade da endotoxina-padrão e a pureza da água reagente e seus materiais, foram realizados, respectivamente, controles positivo (água reagente apirogênica + endotoxina-padrão) e negativo (água reagente apirogênica). A repetibilidade foi avaliada em 10 repetições do ensaio em duplicatas, usando sempre a mesma amostra e mesmo lote de kit, em temperatura externa de 23,6 C, como apresentado na Tabela 2. Repetições Controle Diluição da amostra Positivo Negativo Amostra positivada Amostra 1/2 1/4 1/8 1/16 1/20 Resultado (EU/mL) < 0, < 0, < 0, < 0, < 0, < 0, < 0, < 0, < 0, < 0,125 Tabela 2. Ensaios de detecção de endotoxina bacteriana em amostra de água de hemodiálise, realizadas com o kit de análise para endotoxinas Charles River Endosafe Nos ensaios para determinação da repetibilidade não houve variação dos resultados, sendo que todas as repetições apresentaram valores menores de 0,125 eu/ml, comprovando a precisão do método implantado no Laboratorio Endotoxina /IST A&B. 3

4 Participação em Programa Interlaboratorial A participação em Programa Interlaboratorial é um requisito importante para a evidência de confiabilidade da análise. O Laboratório de Endotoxina participa anualmente de quatro rodadas, onde em cada rodada são analisadas duas amostras enviadas pelo provedor do Programa, seguindo o mesmo procedimento de análise de amostras reais. O desempenho do Lab. Endotoxina nos ensaios interlaboratoriais de 2012 a 2014 são apresentados na Figura 2. Todos os resultados dos ensaios estavam dentro do esperado pelo provedor, demonstrando a confiabilidade dos resultados obtidos. Figura 2. Desempenho do Laboratório de endotoxina em Programa Interlaboratorial para detecção de endotoxina pelo método Gel-Glot Diagrama de Ishikawa para abordagem de interferentes Devido ao ensaio de detecção de endotoxina pelo método de LAL apresentar resultados semi-quantitativos, há a dificuldade de implantação de análises estatísticas para avaliação de interferentes na metodologia implantada. Por isso, foi elaborado o diagrama de causa e efeito, também conhecido como diagrama de Ishikawa, utilizado para a análise de dispersões no processo. A equipe do laboratório levantou possíveis interferentes através de seis causas principais, como visualizado na Figura 3. Figura 3. Diagrama de causa e efeito 4

5 O diagrama de Ishikawa foi uma abordagem muito importante para o conhecimento de todos os possíveis interferentes no resultado e controle do laboratório. Foi observado que todos os itens determinados apesar de sua relevância estão em constante controle no laboratório. CONCLUSÃO De acordo com todos os resultados apresentados neste trabalho podemos concluir que o ensaio de Limulus Amebocyte Lysate (LAL), pelo método gel-glot apresentou resultados satisfatórios na verificação, atendendo também adequadamente as condições do Laboratório de Endotoxina. A utilização do diagrama de Ishikawa permitirá ao laboratório uma maior compreensão de todos os possíveis interferentes, facilitando a identificação e implementação de ações preventivas necessárias. REFERÊNCIAS [1] BRASIL. Resolução RDC nº 11, de 13 de março 2014 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA, publicada no Diário Oficial da União (DOU) em 14/03/2014. [2] BRASIL. Resolução RDC nº 8 de 02 de janeiro de 2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA que estabelece o Regulamento técnico que institui as boas práticas de fabricação do concentrado polieletrolíticos para hemodiálise CPHD. D.O.U. - Diário Oficial da União; Poder Executivo, de 10 de janeiro de [3] THE UNITED STATES PHARMACOPEIAL (USP). Bacterial Endotoxins Test. Interim Revision Announcement, p. 1-5, Apr (2011). [4] BRASIL. Farmacopéia Brasileira, volume 2 / Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: ANVISA, (2010). [5] Reagente LAL- Charles River [Online] [capturado em 17/09/2014] Disponível em: [6] N.T.O. Fukumori, Determinação de endotoxina bacteriana (pirogênio) em radiofarmacos pelo método de formação de gel. Verificação, (2008). 5