GERAÇÃO. APIROGENICIDADE produto estéril, potencial/ pirogênico ESTERILIDADE
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- Rafael Santana Tomé
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1 FOGO/ T C GERAÇÃO ESTERILIDADE APIROGENICIDADE produto estéril, potencial/ pirogênico ABRANGÊNCIA INJETÁVEIS EM GERAL (uso humano e veterinário) CORRELATOS DE INJETÁVEIS Produtos médico-hospitalares de uso invasivo Drogas e correlatos INTRATECAIS Produtos implantáveis Originam-se fora do corpo e induzem elevação térmica quando injetados em animais e homem - bactérias G(-) endotoxina / LPS -Bactérias G(+) ác. Teicóico -Fungos e vírus -Fármacos e esteróides -frações do plasma Pirogênio leucocitário: Substância homogênea Sintetizada por diferentes células do hospedeiro (leucócitos) após exposição ao pirogênio exógeno T C
2 ENDOTOXINA Pirogênio presente na parede da célula das bactérias G (- ) LPS Lipopolissacáride Mólecula quimicamente purificada da endotoxina ESTRUTURA da PAREDE de G (+) X ESTRUTURA da PAREDE de G (-) ESTRUTURA do LPS
3 Parte externa Proteínas Cadeia O-Específica Cadeia Fundamental polissacarídea Lípide A LPS Fosfolípide Membrana Lipoproteína Externa Peptideoglicano Espaço Periplasmático Membrana Interna Citoplasma celular Parte interna
4 Cadeia O específica Cadeia fund.polissacarídea Lipídeo A Lipopolissacarídeo (LPS) PM: a Daltons até 10 6 Daltons ext Sequências repetidas de açúcares (manose, galactose, ramnose, dideoxihexoses) Especificidade sorológica Polissacarídeos Difusão de solutos int 2 unidades glicosamino, pontes fosfato + ácidos graxos de cadeia longa ~ fosfolipídio Ação Biológica Toxicidade da molécula
5 EFEITO SOBRE O SISTEMA TERMORREGULADOR AÇÃO DIRETA: centro termorregulador do hipotálamo anterior 0,1 µg/kg febre considerável Limites diferentes produtos compêndios oficiais AÇÃO INDIRETA leucócitos liberação pirogênio leucocitário ação no centro termorregulador hipotálamo anterior EFEITO SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR Interação LPS c/ leucócitos, plaquetas e proteínas plasmáticas liberação de aminas vasoativas débito cardíaco miocárdio= Redução fluxo sanguíneo pressão arterial CHOQUE EFEITO SOBRE O SANGUE Leucopenia Alteração da eritropoiese Agregação plaquetária coagulação sg. disseminada EFEITO SOBRE O SISTEMA ENDÓCRINO HIPOTÁLAMO gl. Pituitária ACTH gl. Supra-renal cortisol EFEITO SOBRE O SISTEMA METABÓLICO Hiperglicemia seguida de Hipoglicemia Hiperlipidemia EFEITO SOBRE O SISTEMA IMUNOLÓGICO PRODUÇÃO de Anticorpos IgM, IgG, IgA
6 CALOR SECO ESTUFAS HIDRÓLISE ÁCIDO - BASE OXIDAÇÃO POR MÉTODOS QUÍMICOS ALQUILAÇÃO POR AGENTES ALQUILANTES RADIAÇÃO IONIZANTE E POLIMIXINA B LAVAGEM DESTILAÇÃO- água ULTRAFILTRAÇÃO Exclusão por peso molecular OSMOSE REVERSA Remoção por exclusão de tamanho (poros de 10 A ) O QUE SÃO PRODUTOS APIROGÊNICOS????? OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS - Na prática = lote contaminado rejeição e descarte - Remoção = não aplicável custo X efetividade - Processo produtivo GMP obtenção de produto apirogênio BIOBURDEN X PYROBURDEN
7 COELHOS (teste de pirogênio) Aceitação ou reprovação da amostra em teste reação febril do animal Coelhos sistema termorregulador ao humano Cachorros dificuldade no manuseio Cobaios sensibilidade do sist. Termorregulador Espécie Oryctolagus cuniculus, ordem logomorfa (albino, grande orelha) TESTE PROPRIAMENTE DITO Animais de ambos os sexos, tratados em biotérios c/ isolamento acústico Interrupção de alimentos 3hrs antes do teste (água livre) contendores especiais Uso de 3 animais (respeitar a dose humana) ml/kg de peso corporal Tomada da temperatura basal Administração da amostra veia marginal da orelha (estéril e isotônica) Novas medições de T C após 1,2 e3 horas
8 COELHOS (teste de pirogênio) INTERPRETAÇÃO DO TESTE CRITÉRIOS Considerar somente elevações de temperatura 3 coelhos 1 animal c/ elevação > ou = a 0,6 C e/ou Σ T C máx.> 1,4 C RETESTE C/ +5 ANIMAIS Os critérios são farmacopéicos (USP e Farm.Bras. IV ed.) COELHOS T C BASAL T C 1 T C 2 T C 3 VARIAÇÃO 1 38,5 39,1 39, , ,2 0,3 3 39,3 39, ,4 0,7
9 LISADO dos AMEBÓCITOS LIMULUS LAL Teste de endotoxina bacteriana Baseia-se na propriedade das células (amebócitos) do carangueijo Limulus polyphemus formarem coágulo na presença de endotoxina Limulus polyplemus CARCAÇA FRONTAL Limulus polyplemus PARTE POSTERIOR infecção por bact. G(-) PRÓ-ENZIMA Sg animal endotoxina Ca +2 / Mg +2 ENZIMA ATIVADA + COAGULOGÊNIO Sg animal hidrólise coágulo sanguíneo polimerização rearranjo PÉPTIDES
10 REAGENTE LAL 1 frasco contendo endotoxina padronizada 1 frasco contendo pró-enzima + coagulogênio (distintas sensibilidades-λ EX: λ= 0,125UE/mL, 0,200UE/mL, 0,250UE/mL Escolha: de acordo com o pyroburden das amostras - VALIDAÇÃO Punção da região torácica e retirada da hemolinfa TESTE PROPRIAMENTE DITO GELIFICAÇÃO ou GEL-CLOT Introdução USP XX e 4ª ed. Farmacopéia Bras. Vol. = de reagente LAL + solução teste ensaio limite Homogeneização suave e incubação a 37 C por 1 hora INVERSÃO 180 formação de gel sólido AMOSTRA POSITIVA
11 LISADO dos AMEBÓCITOS LIMULUS LAL Teste de endotoxina bacteriana MÉTODO GEL-CLOT Cálculo da Concentração de Endotoxina na amostra Resultado em EU/UE Sensiblidade do reagente LAL = 0,125 EU/mL (λ) diluições seriadas da amostra R é p lic a s D ilu iç ã o d a A m o s tra 1 :2 1 :4 1 :8 1 :1 6 1 : Ponto Final de Gelificação da Amostra Log 10 Ponto Final 1:16 (0,0625) - 1,204 1:8 (0,125) - 0,903 Média = -1,054 Antilog 10 da Média = 0,088 Concentração = Sensibilidade LAL = 0,125 EU/ml = 1,42 EU/ml endotoxina antilog10 média pto. final 0,088
12 TESTE ANIMAL IN VIVO VANTAGENS Animal simula melhor condições fisiológicas DESVANTAGENS emulsão, suspensão, sol. Oleosa não quantitativo natureza do fármaco antitérmicos, anestésicos limitações quanto à re-utilização (tolerância) TESTE Gel clot IN VITRO VANTAGENS Abrangência Sensibilidade (validação) Especificidade Custo / simplicidade DESVANTAGENS Natureza do fármaco (validação interferências) Amostras opacas / leitosas mét. Cromogênico Grande demanda e sensib. mét. Turbidimétrico
São substâncias que, quando injetadas em pacientes causam elevação da temperatura corporal (pirexia ou febre), podendo ser:
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