Capa do programa da cerimônia de entrega do Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia de 1963.

Transcrição

1 O Modelo de Hodgkin-Huxley Biofísica II FFCLRP USP Prof. Antônio Roque Aula 18 Os ecanisos iônicos responsáveis pela geração de u potencial de ação fora elucidados pelos trabalhos de Hodgkin e Huxley co o axônio gigante de lula na prieira etade do Século XX. Capa do prograa da ceriônia de entrega do Prêio Nobel de Medicina e Fisiologia de

2 U vídeo do YouTube ostrando coo o experiento de HH foi feito está disponível e: O axônio gigante da lula é ua fibra não-ielinizada co u diâetro e torno de eio ilíetro e vários centíetros de copriento. Ela é ua das aiores células de aniais conhecidas. Para coparação, as células dos vertebrados possue diâetros de alguns poucos icrôetros. Por causa disso, o axônio gigante da lula constitui u sistea ideal para a realização de experientos eletrofisiológicos. Para a realização de seus experientos, Hodgkin e Huxley utilizara duas técnicas experientais, conhecidas coo grapeaento espacial e grapeaento de voltage (veja a figura abaixo). 2

3 Dois eletrodos finos e longos são inseridos ao longo do axônio e conectados aos instruentos ostrados. A resistência dos eletrodos é tão baixa que podese considerar que todos os pontos ao longo do axônio tê o eso potencial elétrico e cada instante de tepo. Portanto, o potencial passa a depender apenas do tepo e não do espaço, coo nua célula pontual (isopotencial). Dizeos que a célula está sob u grapo espacial. U dos eletrodos está eparelhado co u eletrodo externo ao axônio, para edir a diferença de voltage V através da ebrana. O outro eletrodo é usado para injetar ou retirar corrente da célula, na quantidade justa para anter a diferença de potencial através da ebrana nu valor constante qualquer. A edida dessa corrente perite o cálculo da condutância (ou da resistência) da ebrana. Esta técnica é chaada de grapo de voltage, ou fixação de voltage, e perite controlar o potencial de ebrana, fazendo co que ele tenha qualquer valor que se queira. Quando o potencial de ebrana é elevado abruptaente do seu valor de repouso para outro valor, e antido neste valor, a corrente de ebrana I (t) apresenta u coportaento coo o ostrado a seguir. 3

4 A corrente de ebrana I (t) te três coponentes: 1. U brevíssio pulso de corrente (de alguns poucos icro-segundos) para fora da célula. Esta corrente corresponde ao carregaento do capacitor que constitui a ebrana, pois o auento da voltage iplica nu auento da carga arazenada na superfície da ebrana. 2. U fluxo de corrente transiente para dentro da célula co duração de 1 a 2 s. Vários experientos, coo, por exeplo, substituindo-se os íons de sódio no eio extra-celular por outros íons onovalentes, ostrara que esta corrente é devida à entrada de íons de sódio na célula. 3. Ua corrente para fora da célula que se anifesta aproxiadaente 4 s após o início do grapo de voltage e peranece estável pelo tepo que durar esse grapo. Estudos co traçadores iônicos revelara que esta corrente é devida a íons de potássio. (E ua escala de tepo de várias dezenas de ilisegundos, esta corrente de potássio tabé cai para zero coo a de sódio). 4

5 Alé dessas três coponentes, há tabé ua pequena corrente constante para fora (iperceptível na escala do desenho) que corresponde a íons de cloreto e outros íons que passa pela ebrana. Co base nos seus estudos experientais, Hodgkin e Huxley postulara o seguinte odelo fenoenológico para explicar os eventos observados durante a ocorrência de u potencial de ação no axônio gigante da lula: 1. A corrente de ebrana é dada pela soa da corrente capacitiva e de ua corrente iônica: I dv ( t) ( t) = Iiônica ( t) + C. (1) dt 2. A corrente iônica é dada pela soa de correntes iônicas para íons específicos. A corrente de u dado íon é independente das correntes iônicas dos outros íons. Há três correntes iônicas responsáveis pela geração do potencial de ação: de sódio, de potássio e de vazaento (ou fuga): I t) = I + I + I iônica ( (2) Na K vaz A razão para esta últia corrente é que, e seus experientos, Hodgkin e Huxley observara ua corrente adicional alé das de sódio e de potássio cuja condutância não dependia da voltage; eles atribuíra essa corrente a u vazaento na ebrana, possivelente devido ao eletrodo. 3. Os canais iônicos de sódio e de potássio são odelados por condutâncias ativas, que depende da voltage e do tepo, e série co baterias cujas voltagens são dadas por seus respectivos potenciais de Nernst: 5

6 I íon íon ( V ( t), t)( V ( t E ) ( t) = G ), (3) onde íon = Na + ou K O canal iônico de vazaento é odelado por ua condutância passiva G vaz e série co ua bateria E vaz (veja a figura a seguir): íon Os valores de G vaz e E vaz são deterinados epiricaente para que a solução nuérica do odelo se ajuste be aos dados experientais. O circuito elétrico equivalente ao odelo de Hodgkin-Huxley para a ebrana do axônio gigante da lula é dado pela figura a seguir: 6

7 Note as posições das baterias: a posição de E K indica que o potencial de Nernst do potássio é negativo (negativo no interior da célula e relação ao exterior) e a posição de E Na indica que o potencial de Nernst do sódio é positivo (positivo no interior da célula e relação ao exterior). A posição da bateria da corrente de vazaento indica que o seu potencial de reversão é positivo. E seus experientos de grapeaento de voltage, Hodgkin e Huxley auentava a voltage para u certo valor e relação ao repouso e deterinava o coportaento teporal das correntes dos íons de sódio e potássio enquanto a voltage peranecesse constante no valor grapeado. Para fazer isso, é fundaental conseguir isolar as contribuições de cada corrente iônica particular para a corrente iônica total. 7

8 Hodgkin e Huxley conseguira isso colocando o axônio de lula e u banho co concentração de sódio uito baixa (ou e que o sódio fosse substituído por colina, que é u cátion ao qual a ebrana é ipereável). Isso fazia co que a corrente de sódio (I Na ) fosse praticaente zero, de aneira que toda a corrente edida era a de potássio (I K ). Posteriorente, colocava-se o axônio e u banho co concentração noral de sódio e edia-se a corrente iônica noral (I iônica ). Subtraindo-se dessa corrente a corrente de potássio deterinada anteriorente podia-se deterinar I Na. Isso está ilustrado na figura abaixo (retirada do capítulo IV do The Book of GENESIS ver referência no fi desta aula). Esta figura ostra o coportaento da densidade de corrente (e A/c 2 ) contra o tepo (e s) quando se anté a voltage grapeada no valor de 9 V (56 V acia do valor de repouso). A corrente total edida está indicada por I K + I Na. A corrente total quando o axônio está ierso e u banho co apenas 10% da concentração noral de sódio está indicada por I K ; e a corrente obtida pela diferença entre I K + I Na e I K está indicada por I Na. 8

9 Outra aneira de repetir esse experiento é usando u bloqueador de canais iônicos. Existe toxinas e agentes faracológicos capazes de bloquear seletivaente apenas alguns tipos de canais iônicos. U exeplo é a tetrodotoxina (TTX), capaz de bloquear apenas os canais de sódio. Quando se faz u experiento coo o descrito acia e se consegue isolar a corrente devida apenas a u íon, a condutância do íon pode ser deterinada da seguinte aneira. Supondo que apenas u tipo de íon pode passar através da ebrana, a equação para o potencial de ebrana torna-se: ou dv ( t) C + G( V, t)( V Erev) I dt = dv ( t) C = G( V, t)( V Erev) + I dt inj ( t), inj ( t), onde I inj (t) é a corrente que te que ser injetada pelo eletrodo dentro da célula para anter o potencial constante no valor grapeado e E rev é o potencial de reversão do único íon presente. Coo a corrente injetada faz co que o potencial de ebrana peraneça constante, dv /dt = 0 e o lado esquerdo da equação anterior deve ser nulo. Pode-se então escrever: I inj ( t) = G( t)( V Erev ). (4) Esta equação indica que o coportaento teporal da corrente injetada é o eso da condutância do íon que está fluindo através da ebrana. Coo os valores de V e de E rev são conhecidos, ela perite que se deterine G(t). 9

10 U coportaento típico das condutâncias específicas (ou condutâncias por unidade de área) g K e de g Na para u auento no potencial (no caso, de 26 V), a T = 6 o C, está ostrado na figura abaixo. Exercício: tente explicar o coportaento teporal das condutâncias específicas de sódio e de potássio acia e teros do que foi discutido na aula 16 sobre os ecanisos iônicos responsáveis pela geração de u potencial de ação. Esses experientos de Hodgkin e Huxley ostrara claraente que o responsável pelo potencial de ação é o fluxo de íons de sódio para dentro da célula através da ebrana. Hodgkin e Huxley notara que o ecaniso de auento da pereabilidade da ebrana ao sódio é regenerativo: a entrada de íons de sódio (carga positiva) no interior da célula faz crescer a despolarização da ebrana e isso provoca u auento ainda aior na pereabilidade da ebrana ao sódio. O ecaniso, portanto, é de feedback positivo. 10

11 Após a identificação experiental do papel das condutâncias de potássio e sódio, Hodgkin e Huxley tivera que encontrar equações capazes de fitar o coportaento teporal dessas condutâncias para cada valor de grapo de voltage usado. A figura abaixo (tabé retirada do The Book of GENESIS) ostra o resultado de vários experientos dando a variação teporal da condutância específica do potássio para diferentes valores da voltage grapeada. Os círculos abertos indica os dados experientais e as linhas sólidas indica as curvas obtidas por Hodgkin e Huxley para fitar os dados. 11

12 Observe que o valor final (chaado de valor estacionário) da condutância específica auenta co o valor da voltage grapeada (os valores de voltage dados no gráfico são edidos e relação ao potencial de repouso da célula). Observe tabé que a taxa de cresciento da condutância específica e direção ao valor estacionário (a inclinação da curva) auenta co a voltage grapeada. Observando seus dados, Hodgkin e Huxley pensara e fitar as curvas de condutância específica por ua função envolvendo ua exponencial, tal coo g K ( V, t) ( V ) 1 e t = τ ( V ) g K co g K e τ dependentes do valor da voltage. g K (V) daria o valor estacionário para o qual a condutância específica tenderia a ua dada voltage grapeada e τ(v) deterinaria quão rapidaente a condutância específica cresceria para esse valor estacionário., No entanto, ua exponencial siples coo a da função acia não daria u bo ajuste. A figura abaixo ostra por quê. Ua curva de condutância específica te inclinação (derivada) nula e t = 0, enquanto que ua exponencial te inclinação não nula. 12

13 Existe uitas aneiras de se gerar ua função ateática que se pareça elhor co a curva experiental de ua condutância específica. Ua delas é usando o fato de que para x pequeno (1 e -x ) é aproxiadaente igual a x (ostre isso a partir da expansão da função exponencial e série de Taylor). A função x elevada a ua potência se aproxia da orige co inclinação nula (veja o gráfico esboçado a seguir). Por outro lado, para x, (1 e -x ) 1 assi coo (1 e -x ) α, onde α é u expoente qualquer. Isto iplica que ua função que envolva u tero do tipo (1 e -t/τ ) α pode ser capaz de fitar a curva experiental da condutância específica: para t 0 ela se aproxia da orige co inclinação nula e para t ela tende a 1. Hodgkin e Huxley propusera ua expressão do tipo a seguir para descrever o coportaento da condutância específica do potássio para cada valor grapeado de V: t τ g K ( V, t) = gk n ( V ) 1 e. α 13

14 Nesta expressão, Biofísica II FFCLRP USP Prof. Antônio Roque Aula 18 g K é o aior valor possível que a condutância específica do potássio pode atingir durante a aplicação do grapo de voltage por u longo tepo. Vaos chaar este valor de condutância específica áxia do potássio. Já o valor n α (V ) é u núero entre 0 e 1 e deterina a fração da condutância específica áxia g K que será atingida e t para o valor de voltage grapeada V. Portanto, o valor estacionário da condutância específica para u α dado valor de voltage grapeada V é dado por n (V ). g K Após uitas tentativas, Hodgkin e Huxley obtivera u bo ajuste para os seus dados co u expoente α = 4 na expressão proposta (este valor foi o enor expoente capaz de fornecer ua concordância aceitável da equação co os dados experientais). Desta aneira, para cada valor de V, o coportaento experiental da condutância específica do potássio pode ser be descrito epiricaente pela expressão: g K (V,t) = g K n 4 (V,t), (5) onde # n(v,t) = n (V ) 1 e t τ n (V )& % (. $ ' (6) 14

15 Note que a constante τ está agora indicada co u sub-índice n, τ = τ n. Isto foi feito para indicar que ela é relativa à variável n sendo usada para o potássio, pois aparecerão outras variáveis do tipo de n e outras constantes de tepo quando a condutância específica do sódio for odelada ais para a frente. Note que, para u dado valor de V, a função n(v, t) e (6) é solução da equação diferencial, para constantes τ n (V) e n (V). τ n (V ) dn dt = n (V ) n, (7) A variável n(v, t) é chaada de variável de ativação do potássio. A equação diferencial acia descreve coo a ativação do potássio auenta até atingir o valor estacionário para u dado valor de voltage. Para copletar a odelage fenoenológica da condutância específica do potássio, Hodgkin e Huxley tivera que deterinar coo os parâetros τ n (V) e n (V) depende de V. Isto foi feito a partir de fittings de dados experientais coo os ostrados anteriorente. As equações obtidas por eles para τ n (V) e n (V) serão ostradas ais adiante. A odelage da variação teporal da condutância do sódio para cada valor de grapo de voltage foi feita de aneira siilar por Hodgkin e Huxley. Poré, olhando para as curvas experientais a seguir, dando o coportaento de g Na contra t, veos que o coportaento de g Na é ais coplicado que o de g K. 15

16 A condutância específica do sódio inicialente sobe e resposta ao auento do potencial, as depois decai enquanto o potencial fica antido nu valor alto. O gráfico acia ostra as respostas da condutância específica do sódio, g Na, a auentos e V do tipo degrau de diferentes valores, obtidos pelo grapo de voltage e indicados pelos núeros à esquerda (e V). As curvas suaves são os ajustes fornecidos pelas equações do odelo de Hodgkin-Huxley. As escalas verticais à direita estão e unidades de S/c 2. Para fitar o coportaento transiente de g Na observado na figura acia, Hodgkin e Huxley propusera que a condutância específica do sódio deve obedecer a ua equação do tipo: g Na ( V, t) = g Na 3 ( V, t) h( V, t), (8) 16

17 onde Biofísica II FFCLRP USP Prof. Antônio Roque Aula 18 g Na é o áxio valor que a condutância específica do sódio pode atingir e e h são funções de V e t co valores entre 0 e 1, de aneira que o produto 3 h deterina a fração da condutância específica áxia e t para u dado valor do grapo de voltage V. g Na que é atingida Observe que a aneira de odelar a condutância específica do sódio é análoga à usada para odelar a condutância específica do potássio, só que agora são usadas duas variáveis ( e h) para descrever o coportaento teporal de g Na ao invés de apenas ua (n) coo no caso de g K. A função é chaada de variável de ativação do sódio e é ua função exponencialente crescente de V e t. A função h é chaada de variável de inativação do sódio e é ua função exponencialente decrescente de V e t. As variáveis e h obedece equações diferenciais siilares àquela para a variável n do potássio: d dh τ ( V ) = ( V ) e h ( V ) = h ( V ) h, dt dt τ (9) onde τ (V), (V), τ h (V) e h (V) tê a esa interpretação que as variáveis τ n (V) e n (V) para o potássio. Cobinando tudo o que foi visto acia, o odelo de Hodgkin-Huxley é caracterizado pela seguinte equação, dv I C = J ( V, t) + dt ( t), A inj (10) 17

18 onde C é a capacitância específica da ebrana, I inj (t) é a corrente injetada na célula e A é a área da superfície da ebrana da célula. A divisão por A foi feita porque a equação acia está escrita e teros de grandezas específicas (por unidade de área). A densidade de corrente de ebrana J é coposta por três coponentes (corrente de sódio, de potássio e de vazaento): J ( V, t) J ( V, t) = g h( V E ) + g n ( V E ) + g ( V E ). = k Na Na k K V V k= 1 (11) As variáveis de ativação e n e de inativação h, por sua vez, obedece às seguintes equações diferenciais: τ n (V ) dn dt = n (V ) n, τ (V ) d dt = (V ), τ h (V ) dh dt = h (V ) h, (12) (13) (14) Por razões que serão vistas na próxia aula, é costue reescrever cada ua destas três equações e teros de duas novas variáveis, α i e β i, onde i = n,, h. Exercício: Mostre que as equações acia para n, e h pode ser reescritas coo: 18

19 dn dt ( 1 n) ( V ), = α ( V ) n n β n d dt = α (V ) 1 ( ) β (V ), dh dt ( 1 h) ( V ), = α ( V ) h h β h co as variáveis α i e β i, i = n,, h, definidas por (15) (16) (17) n ( V ) ( V ) α n ( V ) = ; α ( V ) = ; α h ( V ) = ; (18) τ ( V ) τ ( V ) τ ( V ) n h h ( V ) 1 n ( V ) 1 ( V ) 1 h ( V ) β n ( V ) = ; β ( V ) = ; β h ( V ) =. (19) τ ( V ) τ ( V ) τ ( V ) n h As dependências das variáveis, α i e β i co o potencial de ebrana V fora deterinadas epiricaente por Hodgkin e Huxley, resultando nas expressões: 10 V α ( V ) = 0,01 V n 10 V e β n ( V ) = 0,125exp (potássio) (20) exp V α ( V ) = 0,1 V 25 V e β ( V ) = 4exp (sódio) (21) exp V α h( V ) = 0,07 exp e 20 β h ( V ) = 1 30 V exp (sódio). (22) A voltage V que aparece nestas equações é o potencial de ebrana edido e relação ao potencial de repouso do axônio gigante da lula, e ilivolts (isto é, no repouso V = 0 nas equações acia). 19

20 As condutâncias específicas áxias para cada u dos três canais e os respectivos potenciais de reversão tabé fora deterinados experientalente por Hodgkin e Huxley e seus valores são: g = 120 S/c 2 ; g = 36 S/c 2 ; g = 0, 3 S/c 2 ; (23) Na K E Na = 115 V; E K = 12 V; E v = 10,163 V; C = 1 µf/c 2. (24) V A solução nuérica das equações do odelo de Hodgkin e Huxley ostra o apareciento de potenciais de ação para correntes acia de u valor liiar, confore observado experientalente. O exeplo a seguir é de ua siulação das equações de Hodgkin e Huxley co u potencial de repouso Vrep = 65V e ua densidade de corrente injetada Jinj = 10 µa/c 2 co duração de 1 s aplicada e t = 0. 20

21 Para entender o odelo de Hodgkin-Huxley, é conveniente fazer ua análise dos coportaentos de n(t), (t) e h(t) quando a voltage é fixada e u dado valor (siulando u experiento de grapeaento de voltage). Esses coportaentos são ostrados na figura a seguir: Observe que: - As variáveis de ativação do potássio (n, e azul) e do sódio (, e preto) são inicialente pequenas e auenta co o tepo de aneira exponencial, poré a variável auenta uito ais rapidaente que a variável n. - Já a variável de inativação do sódio (h, e verelho) te u valor inicial ais alto e depois decai para zero. Quando h = 0, a corrente de sódio está copletaente inativa. O ecaniso de geração de u potencial de ação pode ser entendido a partir de ua análise da figura acia. 21

22 Inicialente, existe u balanço entre a corrente de Na + para dentro e a corrente de K + para fora. No repouso, é pequena e h é grande, de aneira que o tero ³h é pequeno, as não nulo. A variável de ativação do K +, n, te u valor interediário entre e h, as n4 é tabé pequeno. Após o início do pulso de voltage, a despolarização auenta rapidaente e os canais de Na + se abre. Após alguns ilissegundos, h vai a zero e a condutância do Na + se inativa. Enquanto isso, n auenta e a condutância do K + cresce, atingindo u valor estacionário alto. Após o fi do pulso, n, e h retorna aos seus valores de repouso. A chave para se entender o coportaento do potencial de ebrana gerado pelas variáveis, h e n está nas suas respectivas constantes de tepo, τ, τ h e τ n. Observando a figura acia, veos que as variáveis de ativação do potássio (n) e de inativação do sódio (h) leva uito ais tepo para atingir seus valores estacionários (indicados pelo subíndice ) do que a variável de ativação do sódio (). Coo o coportaento teporal das três variáveis é exponencial, do tipo e t/τ, as constantes de tepo associadas às variáveis n e h são aiores do que a constante de tepo associada à variável. Isto pode ser ais be entendido observando as figuras abaixo, que ostra coo as constantes de tepo e as variáveis de ativação e inativação depende da voltage no odelo de Hodgkin-Huxley. 22

23 Observe que a constante de tepo de ativação do sódio, τ, é aproxiadaente dez vezes enor que as constantes de tepo de ativação do potássio, τ n, e de inativação do sódio, τ h. Isso significa que, quando ocorre ua despolarização, varia uito ais rapidaente que n e h e direção ao seu valor estacionário. Portanto, há u breve período durante o qual é grande e h ainda não é tão pequeno, o que faz co que o tero 3 h nas equações seja suficienteente grande para iplicar e ua condutância de sódio grande o suficiente para gerar u potencial de ação. Enquanto isso, coo τ n te u valor relativaente grande a variável n levará u tepo aior para atingir u valor tal que a condutância de potássio correspondente seja grande o suficiente para produzir ua corrente de potássio, de dentro para fora da célula, capaz de reduzir o potencial de ebrana da célula ao seu valor original. Observe tabé os valores desses parâetros nua situação de repouso, co o potencial de ebrana e torno de 70 V (indicado por setas nas figuras). 23

24 Note que o valor de h auenta co a hiperpolarização de célula e que existe ua faixa de valores de hiperpolarização tal que se anté diferente de zero. Isto iplica que ua possível estratégia para se despolarizar a célula é, prieiro, hiperpolarizá-la u pouco e depois despolarizá-la. Quando a célula é hiperpolarizada, o valor da variável de inativação do sódio, h, cresce u processo chaado de desinativação. Posteriorente, quando ocorre a despolarização, a variável de ativação do sódio,, cresce rapidaente e h se anté e u valor relativaente alto por u certo tepo (por causa da sua constante teporal grande). Isto iplica que o produto 3 h pode chegar a atingir valores aiores neste caso do que quando ocorre apenas ua despolarização a partir do repouso. Referências: - Bower, J.M. and Beean, D. (1998) The book of GENESIS (2nd ed.), Springer-Verlag, New York. Disponível gratuitaente na internet e: - Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F., A quantitative description of ebrane current and its application to conduction and excitation in nerve. Journal of Physiology, London, 117: , Nicholls, J.G., Martin, A.R., Wallace, B.G. and Fuchs, P.A. (2001) Fro Neuron to Brain (4th ed.), Sinauer, Sunderland, MA. 24