Interface entre el laboratorio y el contexto clínico en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófi los

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1 Interface entre el laboratorio y el contexto clínico en la determinación de anticuerpos anti-citoplasma de neutrófi los 72º CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUÍMICA Buenos Aires, de agosto de 2017 Luís Eduardo Coelho Andrade Associate Professor Rheumatology Division UNIFESP luis.andrade@unifesp.br WHO/IUIS/AF Autoantibody Standardizing Committee Medical consultant in Immunology Fleury Medicine & Health Laboratories luis.andrade@grupofleury.com.br

2 Conflitos de interesse Laboratório Fleury

3 Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos Anticorpos contra antígenos de: Grânulos azurófilos de neutrófilos Lisossomos de monócitos Marcador de vasculites associadas ao ANCA Bosch X, et al. Lancet 2006;368:

4 Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos antígenos Antígenos principais Proteinase 3 Mieloperoxidase Outros antígenos Lactoferrina Elastase BPI Bactericidal Permeability Increasing Lisozima Catepsina G Azurocidina Souza AW. Front Immunol 2015;6:184. Doi: /fimmu

5 Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos Positividade Doenças Especificidade Frequência GPA generalizada PR3-ANCA 80-90% GPA localizada PR3-ANCA 30-40% PAM MPO-ANCA 60-74% GEPA MPO-ANCA 30-40% Vasculite renal limitada MPO-ANCA 75-80% Doença do anticorpo anti-mbg MPO-ANCA 10-40% Weiner M & Segelmark M. Autoimmun Rev 2016;15:

6 Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos Positividade Padrão Doenças Frequência Hepatite autoimune tipo I 40-96% RCU 50-85% a-anca ou p-anca Doença de Crohn 10-20% CEP 26-94% Fibrose cística Anti-BPI (77,3%) Weiner M & Segelmark M. Autoimmun Rev 2016;15:

7 Cómo llegamos a la cadera de la actualidad?

8 Era pré-anca Heinz Klinger 1931 Síndrome consumptiva, artralgias, epistaxe, nariz em sela e otite média Autópsia GN crescentes e inflamação granulomatosa de vias aéreas Freidrich Wegener 1939 Relatou 3 casos envolvimento de vias aéreas, inflamação granulomatosa e vasculite Godman & Churg 1954 Tríade angiíte, inflamação e necrose do trato respiratório e GN necrosante Prosposta Granulomatose de Wegener Jennette JC & Falk RJ. N Eng J Med 1997;337:

9 Era pré-anca Davson et al 1948 Relato de casos de GN na PAN - Forma microscópica da PAN 1ª descrição da PAM Jacob Churg & Lotte Strauss pacientes com asma, eosinofilia, inflamação granulomatosa Vasculite sistêmica necrosante e GN Davson J, et al. QMJ 1948;17: Churg J, Strauss L. Am J Pathol 1951;27:

10 Era pré-anca Godman & Churg 1954 Revisão de 22 casos da literatura e 7 casos próprios Doenças com características semelhantes Granulomatose de Wegener Forma microscópica da periarterite nodosa Síndrome de Churg-Strauss Godman GC, Churg J. Arch Pathol 1954;58:

11 8 pacientes com GN necrosante Fator sérico que reage contra o citoplasma de neutrófilos na IFI Sorologia positiva para o vírus Ross River (arbovírus) Davies et al. BMJ 1982;285:606.

12 1985 Fokko van der Woude IgG anti-citoplasma de neutrófilos pela IFI Positivo em 25 de 27 pacientes com granulomatose de Wegener ativa Positivo em 4 de 32 pacientes em remissão Woude et al. Lancet 1985;1:425-9.

13 Especificidade do ANCA P-ANCA ELISA para anti-mpo C-ANCA sem reatividade C-ANCA 1990 Cromatografia + sequenciamento + atividade enzimática Falk R & Jennette JC. N Engl J Med 1988;318: Jenne D, et al. Nature 1990;346:520.

14 Critérios de classificação do ACR Masi et al. Arthritis Rheum 1990;33: Leawitt et al. Arthritis Rheum 1990;33:

15 Consenso de Chapel Hill 1994 Jennette et al. Arthritis Rheum 1994;37:

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17 Anticorpos anticitoplasma de neutrófilos Fenótipos Variáveis PR3-ANCA MPO-ANCA Epidemiologia Norte da Europa América do Norte Austrália Sul da Europa Ásia Idade ao diagnóstico anos anos Genética HLA-DP, SERPINA1 e PRTN3 HLA-DQ Patologia Órgãos envolvidos Prognóstico Inflamação granulomatosa Vasculite Vias aéreas superiores Nódulos pulmonares Múltiplos órgãos Maior risco de recidivas Fibrose Vasculite Glomerulonefrite Fibrose pulmonar Maior risco de falha ao 1º tratamento Maior risco de IRC terminal Weiner M & Segelmark M. Autoimmun Rev 2016;15:

18 ANCA Técnicas baseadas em IFI Sangue de doador saudável Separação de neutrófilos Fixação Etanol Formalina Metanol

19 ANCA Neutrófilos fixados no etanol Positividade 1/40 Titulação Padrão C-ANCA P-ANCA A-ANCA Savige J, et al. Am J Clin Pathol 1999;120:312-4.

20 c-anca p-anca p-anca atípico

21 ANCA Neutrófilos fixados no etanol C-ANCA Anti-PR3 C-ANCA atípico Anti-BPI P-ANCA atípico Anti-elastase P-ANCA Anti-MPO Anti-lactoferrina Anti-catepsina G Anti-lisozima Anti-azurocidina

22 ANCA em pacientes com FAN positivo - Inconclusivo

23 ANCA Neutrófilos fixados na formalina Csernok E & Moosig F. Nat Rev Rheumatol 2014;10:

24 Solicitação de ANCA IFI com neutrófilos fixados no etanol ELISA Anti-PR3 Anti-MPO IFI com FAN neutrófilos fixados na formalina

25 Especificidade do ANCA ensaios de fase sólida ELISA: Anti-PR3 Anti-MPO IFI + ELISA (diagnóstico x acompanhar títulos): Maior especificidade IFI positivo isoladamente em 10% ELISA positivo isoladamente em 5% Savige J, et al. Am J Clin Pathol 1999;120:312-4.

26 Especificidade do ANCA ELISA anti-pr3 Métodos Sensibilidade IC de 95% IFI 92,0% (73,9-98,8%) ELISA direto 60,0% (38,7-78,8%) ELISA de captura 72,0% (50,6-87,9%) ELISA de ancoragem 96,0% (79,6-99,3%) GPA (n=86) Csernok E & Moosig F. Nat Rev Rheumatol 2014;10: Hellmich B, et al. Clin Exp Rheumatol 2007;25(1 Suppl 44):S1-5. Controle saudáveis (n=80) Outras doenças (n=450) Especificidade: 95,5-98,5%

27 Especificidade do ANCA ELISA Grupos N Diagnóstico histológico de GPA (Wegener) 60 Artrite reumatoide 30 Controles saudáveis 30 Soro testado em 6 laboratórios de referência Conclusão: ELISA de captura é mais reprodutível e tende a melhor desempenho para detectar PR3-ANCA na GW Pode ser utilizado em conjunto com a histologia para diagnóstico de GW

28 E O ANCA EM NOSSO MEIO?

29 Variáveis China (N=411) Brasil (N=64) p ANCA positivo, n (%) 410 (99,8) 43 (67,2) < 0,0001 Variáveis Positividade (n=134) c-anca, n (%) 39 (9,7) 29 (69,0) p-anca, n (%) 363 (90,3) 12 (28,6) a-anca, n (%) 0 1 (2,4) ELISA realizado, n (%) ELISA negativo, n (%) < 0, (99,7) 31 (48,4) -- 1 (0,2) 9 (29,0) ANCA (68,6%) c-anca + 83 (61,9%) PR3-ANCA, n (%) 38 (9,3) 17 (54,8) MPO-ANCA, n (%) 371 (90,5) 5 (16,1) < 0,0001 p-anca + 17 (12,9%) Brasil: 64 pacientes Unifesp, USP e HFSP-RJ GPA (86,6%) e PAM (13,4%) China: 411 pacientes Renal Division, Department of Medicine, Peking University PAM (69,1%), GPA (23,6%) e VRL (7,3%)

30 ANCA no Brasil experiência de Laboratório Fleury Exames de ANCA de jan/2015 a dez/ meses. Variáveis Resultados Total de pedidos 8144 Positivos ( 1/20), n (%) 568 (7,0) Positivos ( 1/40), n (%) 429 (5,3) Inconclusivos, n (%) 315 (3,9) Negativos, n (%) 7218 (88,6)

31 n de pacientes ANCA no Brasil experiência de Laboratório Fleury Exames de ANCA de jan/2015 a dez/ meses. Padrões de ANCA Padrões Resultados 300 p-anca atípico, n (%) 271 (47,7) c-anca, n (%) 184 (32,4) p-anca, n (%) 100 (17,6) c-anca atípico, n (%) 13 (2,3) Total P-ANCA atípico C-ANCA P-ANCA C-ANCA atípico

32 n de pacientes n de pacientes n de pacientes ANCA no Brasil experiência de Laboratório Fleury Exames de ANCA de jan/2015 a dez/ meses. Títulos de ANCA anti-pr3 e C-ANCA Anti-MPO e P-ANCA /20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 >1/640 1/ Positivo Negativo Positivo Negativo 32,6% 42,0%

33 E O FUTURO DO ANCA?

34 Detecção de PR3-ANCA e MPO-ANCA IFI automatizada Imuno ensaios de linha ou ponto Imuno ensaios enzimáticos fluorecentes Ensaio de Cytobead Ensaios de multiplex Vasculitis kit Quimioiluminescência

35 ELISA (Quanta Lite) Quimioiluminescência (Quanta Flash) IFI (Inova) GPA 61,6% 75,6% -- Grupos N = 946 GPA 86 RCU 6,0% 31,1% 34,9% DC 0,0% 1,9% -- RCU 283 Doença de Crohn 208 Métodos Especificidade para RCU Outras doenças 264 Controles 105 IFI (P-ANCA atípico) 90,4% PR3-ANCA 98,1%

36 Medipan Cytobead & EuroPlus ANCA Biochip Mosaic Sowa M, et al. Plos One 2014;9:e Damoiseaux J, et al. J Immunol Methods 2009;348:67-73.

37 EuroPlus ANCA Biochip Mosaic EuroPattern Vasculites associadas ao ANCA (n=249) Outras doenças (n=85) Controles saudáveis (n=27) Concordância Variáveis IFI + ELISA EuroPlus PR3-ANCA MPO-ANCA Sensibilidade 76,7% 77,1% 96,8% 99,2% Especificidade 99,1% 98,1% Damoiseaux J, et al. J Immunol Methods 2009;348:67-73.

38 Medipan Cytobead Aklides Doenças N Métodos Cohen s Kappa Vasculites associadas ao ANCA 118 Artrite reumatoide 133 Doenças infecciosas 49 Doença inflamatória intestinal 77 C-ANCA 0,820 P-ANCA 0,876 PR3-ANCA 0,775 MPO-ANCA 0,720 Doenças hepáticas autoimunes 20 Colangite esclerosante primária 70 Controles saudáveis 125 Sowa M, et al. Plos One 2014;9:e107743

39 Número Métodos 1 QuantaLite 1ª geração 2 Quimioiluminescência 3 3ª geração anti-pr3 e anti-mpo (FEIA) 4 Multiplex Vasculitis kit Grupos N GPA 186 PAM 65 Outras doenças ELISA de captura 6 Orgentec anti-pr3 (3ª) anti-mpo (1ª) 7 Euroimmun anti-pr3 (3ª) anti-mpo (1ª) 8 Cytobead Assay

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41 CRIOGLOBULINAS ANCA ANTI-MBG GNRP E VASCULITES ANTI-C1q FAN COMPLEMENTO

42 Antimembrana basal glomerular (porção NC colágeno IV) Síndrome de Goodpasture

43 Shakil AO, Disceglie AM. NEJM 331:1624, 1994.

44 Conclusões Importante instrumento para diagnóstico e avaliação de fenótipo de vasculites associadas ao ANCA; Contexto apropriado; Na prática diária IFI e ELISA (com variações); Futuro Substituição da IFI por ensaios de fase sólida? Novas diretrizes.