UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA. Patrícia Regina Pellegrini

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA MÉDICA Patrícia Regina Pellegrini VALOR PROGNÓSTICO DO ÁCIDO HIALURÔNICO SÉRICO NA RESPOSTA VIROLÓGICA SUSTENTADA DOS PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA Rio de Janeiro 2008

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3 ii Patrícia Regina Pellegrini VALOR PROGNÓSTICO DO ÁCIDO HIALURÔNICO SÉRICO NA RESPOSTA VIROLÓGICA SUSTENTADA DOS PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Clínica Médica. Orientadores: Prof. Guilherme Ferreira da Motta Rezende Prof. Henrique Sérgio Moraes Coelho Rio de Janeiro 2008

4 iii Pellegrini, Patrícia Regina. Valor prognóstico do ácido hialurônico sérico na resposta virológica sustentada dos pacientes com hepatite C crônica / Patrícia Regina Pellegrini Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, xvii, 88f. : il. ; 31 cm Orientadores: Guilherme Ferreira da Motta Rezende e Henrique Sérgio Moraes Coelho. Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, Referências bibliográficas: f Hepatite C crônica. 2. Cirrose hepática. 3. Ácido hialurônico - biossíntese. 4. Ácido hialurônico uso diagnóstico. 5. Colágeno sangue. 6. Prognóstico. 7. Interferon-alfa - uso terapêutico. 8. Ribavirina uso terapêutico. 9. Kit de reagentes para diagnóstico. 10. Reprodutibilidade dos testes. 11. Clínica Médica - Tese. I. Rezende, Guilherme Ferreira da Motta. II. Coelho, Henrique Sérgio Moraes. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Clínica Médica. IV. Título.

5 iv FOLHA DE APROVAÇÃO VALOR PROGNÓSTICO DO ÁCIDO HIALURÔNICO SÉRICO NA RESPOSTA VIROLÓGICA SUSTENTADA DOS PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA PATRÍCIA REGINA PELLEGRINI Orientadores: Prof. Guilherme Ferreira da Motta Rezende Prof. Henrique Sérgio Moraes Coelho Dissertação submetida ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação em Clínica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Setor de Gastroenterologia, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre em Clínica Médica. Aprovada em 21 de outubro de 2008 Banca examinadora Prof a Adriana Marques Caroli de Freitas Bottino Prof a Cristiane Alves Villela Nogueira Prof Mariano Gustavo Zalis Rio de Janeiro Outubro 2008

6 AO MEU MARIDO E AOS MEUS FILHOS v

7 vi AGRADECIMENTOS A meu marido, Rodrigo, e aos meus filhos, Gabriel e Guilherme, que muito me apoiaram e me incentivaram, tanto na idéia quanto no desenvolvimento desta tese, e que entenderam sempre com muita paciência e resignação a privação de inúmeros momentos em que a eles não pude me dedicar. Aos meus pais, que sempre me incentivaram na busca de conhecimentos na área médica. Aos meus irmãos, à minha tia Lêda e a outros familiares queridos, que viram o meu esforço e dedicação na realização deste estudo e que deste, tenho certeza se orgulham. Aos meus orientadores, Prof. Guilherme, que tanto me ajudou a ultrapassar as dificuldades apresentadas durante a elaboração desta tese, sempre com paciência indescritível e com palavras de incentivo e de coragem, desta forma aumentando muito os laços de amizade adquiridos anteriormente; e ao Prof. Henrique Sérgio, que me deu a oportunidade de participar de um Serviço de Hepatologia onde todos me acolheram com carinho, amizade e respeito. Ao meu colega de mestrado, Dr. Vílson Lemos Jr., que comigo enfrentou e superou todos os percalços, principalmente durante a coleta de dados no ambulatório do HUCFF-UFRJ. Ao Prof. Maurício Gama, que sempre com muita calma, me ajudou a entender o raciocínio dos cálculos estatísticos. À Dra. Simone Guaraldi, que me ensinou a trabalhar com o software Endnote, utilizado para ordenar as referências bibliográficas.

8 vii Ao Laboratório Nikko do Brasil e ao Laboratório Richet, que tiveram participação fundamental no patrocínio e na análise laboratorial do ácido hialurônico empregado nesta monografia. A todas as pessoas amigas, que acreditam no meu potencial e que comigo brindam o fim de mais uma etapa acadêmica. E finalmente, agradeço a todos os pacientes incluídos neste trabalho, pois sem eles nada seria possível.

9 viii RESUMO Introdução: Nos pacientes com hepatite C crônica, a biópsia é o exame de eleição para avaliação do grau de fibrose hepática (FH), havendo uma relação inversa entre esta e a possibilidade de cura da infecção viral. Marcadores não-invasivos de FH, com menor custo e risco, têm sido propostos como alternativa à biópsia. Dentre estes, o ácido hialurônico (AH), cujos níveis séricos aumentam com o desenvolvimento da FH e que parece diminuir nos pacientes respondedores à terapêutica anti-viral. Sua utilidade como critério prognóstico de resposta terapêutica ainda não foi estabelecida. Objetivos: Pesquisar a associação entre o AH e o grau de fibrose hepática prétratamento; pesquisar a associação do AH pré tratamento e de sua variação antes e após o tratamento com a resposta virológica sustentada (RVS). Métodos: Noventa e um pacientes PCR RNA HCV positivo, genótipo 1, vírgens de tratamento, foram submetidos à terapia anti-viral com interferon-α convencional (3MU 3x/semana SC) e ribavirina (13 mg/kg/dia VO). Nos pacientes em que o vírus se tornou indetectável na 24ª semana, o tratamento foi mantido por 48 semanas. A pesquisa do VHC por PCR RNA foi repetida na 48ª e na 72ª semanas, definindo-se como RVS a não detecção do vírus nesta última. A biópsia hepática (BH) foi realizada em todos os pacientes antes do início do tratamento. Foi determinado o nível sérico do AH (NSAH) antes e após a 72ª semana do início do tratamento. A variação do NSAH foi classificada como queda/estabilidade ou elevação, conforme a segunda dosagem se mostrasse inferior/igual ou superior à primeira. Resultados: Dezoito pacientes (18,4%) obtiveram RVS. Apesar de ter sido observada uma correlação linear entre fibrose hepática pré-tratamento e ácido hialurônico pré-tratamento, esta correlação foi fraca. Não foi observada diferença significativa no NSAH pré-tratamento entre pacientes com e sem RVS (Teste de Mann-Whitney U, p = 0,54). Não foi observada diferença significativa na variação do NSAH pré e pós tratamento entre pacientes com e sem RVS (Teste exato de Fisher, p = 0,77). Conclusão: Em pacientes com hepatite C crônica e genótipo 1, o nível sérico de ácido hialurônico não parece ser útil para se determinar a possibilidade de resposta ao tratamento com interferon-α convencional e ribavirina.

10 ix ABSTRACT Introduction: Biopsy is required for staging hepatic fibrosis (HF) in patients with chronic hepatitis C (HCV). It is known that there is an inverse relation between the HF and the possibility of a viral infection cure. Hepatic fibrosis non-invasive markers have been presented as an alternative to the invasive biopsy procedure. In this group, the hyaluronic acid (HA) reveals increasing serum levels from the development of hepatic fibrosis and decreasing levels in responders patients who had received anti-viral treatment. The prognosis criteria for therapeutical response has not been established yet. Aims: Research the association between the HA level and the HF grade before treatment. Research the association between HA pre-treatment level or its variation before and after treatment with the sustained viral response (SVR). Methods: We studied ninety one patients with detectable serum HCV RNA by polimerase chain reaction (PCR), genotype 1, without previous treatment. Patients were treated with subcutaneously alpha-interferon at a dose of 3 MUI three times a week and ribavirin (13 mg, orally, according to the weight of each patient). Patients showing indetectable PCR during week 24 continued treatment until week 48. During weeks 48 and 72, PCR was redone. Sustained virologic response was defined as for the absence of detectable serum HCV RNA PCR, 24 weeks after the end of treatment. Hepatic biopsy was realized in all patients before treatment. Serum hyaluronic acid levels (SHAL) were assessed before treatment and 24 weeks after the end of treatment. The variation SHAL was classified as decreased/ stable or elevated, if the second measurement of hyaluronic acid level was inferior/ equal or superior in comparison to the first one. Results: Eighteen patients (18, 4%) achieved SVR. Although linear correlation between HF and HA level before treatment was observed, it was not relevant. There was no significant change in the concentration of SHAL among responder and nonresponder patients (Mann-Whitney U Test, p = 0,54). Finally, there was no major difference in the variation of SHAL before and after treatment in patients with or without SVR (Fisher's Exact Test, p = 0,77). Conclusion: Serum hyaluronic acid level doesn t seem useful to provide information on the effectiveness of alpha-ifn / ribavin therapy in HCV virus infected patients, genotype 1.

11 x LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS Figuras e Gráficos Pág. 1 - Prevalência dos diferentes genótipos do HCV no Brasil Esquema histológico mostrando: a) os hepatócitos; b) a célula estrelada (em azul) onde no seu interior ocorre a produção de ácido hialurônico (em verde); c) o sinusóide, com suas paredes revestidas por células endoteliais fenestradas, onde por mecanismos mediados por receptores específicos, o ácido hialurônico será degradado pela ação da hialuronidase. 3 - Esquema histológico mostrando o desenvolvimento do processo fibrótico hepático com a deposição de fibras colágenas na matriz extra-celular (em bege) e a não degradação do ácido hialurônico. O ácido hialurônico em grande quantidade, atingirá a circulação sanguínea através do sistema linfático, traduzindo dessa forma o nível sérico aumentado durante a fibrogênese hepática. 4 -Boxplot apresentando a correlação linear entre NSAH e fibrose hepática pré-tratamento. 5 - Curva ROC para estabelecer o melhor ponto de corte do NSAH pré tratamento para diferenciação de pacientes com fibrose leve (F1 a F3) ou avançada (F4 a F6), conforme sensibilidade e especificidade do teste 67

12 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Estadiamento da fibrose hepática conforme a classificação histológica de Knodell- Ishak Pág Estadiamento da fibrose hepática conforme a classificação histológica METAVIR Concentrações de AH em diferentes tecidos de seres humanos e de outros animais vertebrados 4 Estadiamento da fibrose hepática pré-tratamento, pela Classificação de Knodell- Ishak, visto à biópsia hepática 5 - Classificação dos pacientes de acordo com o estágio de fibrose hepática (leve/moderada x acentuada/cirrose), conforme a Classificação de Ishak Tipo de resposta terapêutica segundo as semanas de tratamento antiviral Avaliação qualitativa do coeficiente de Pearson utilizando-se o AH pré-tratamento em função das variáveis laboratoriais (ALT, GGT e plaquetas) Estatística de regressão múltipla do AH com ALT, GGT e plaquetas pré-tratamento Regressão linear entre AH e GGT pré-tratamento Associação entre os diferentes estágios de fibrose hepática e NSAH prétratamento - Teste de Mann-Whitney U 11 - Teste de correlação bivariada de Kendall e Spearman, mostrando haver correlação linear entre o NSAH pré-tratamento e os diferentes estágios de fibrose hepática (Cl. Knodell-Ishak) Comparação entre o NSAH pré-tratamento e a resposta virológica sustentada Teste estatístico de Mann-Whitney U para correlacionar o NSAH pré-tratamento com a resposta virológica sustentada 14 - Teste Qui-Quadrado e Fisher para correlacionar NSAH pré-tratamento, dicotomizado, e resposta virológica sustentada, utilizando-se os valores do kit do fabricante, média e mediana 15 - Categorização dos pacientes conforme a queda, manutenção ou aumento do NSAH ao longo do acompanhamento Teste t de Student - Diferença entre as médias de NSAH pré e pós-tratamento Avaliação qualitativa do coeficiente de Pearson entre NSAH pré e pós-tratamento Avaliação da associação entre a variação do NSAH pré e pós-tratamento e a resposta virológica sustentada 19 - Teste estatístico Qui-Quadrado utilizado para verificar a associação entre variação do NSAH ao longo do acompanhamento e a resposta virológica sustentada 72 73

13 xii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AH/ABT: teste respiratório para medir a relação entre o ácido hialurônico e a aminopirina AH: ácido hialurônico ALT: alanina aminotransferase ALTPRÉ: nível sérico da alanina aminotransferase pré-tratamento Anti-HCV: anticorpos contra o vírus da hepatite C AR: artrite reumatóide em atividade AST: aspartato aminotransferase BH: biópsia hepática Branched -DNA assay (b-dna): técnica de amplificação pelo método PCR ou pela técnica de amplificação de sinal, para diagnóstico de hepatite C crônica BT: bilirrubina total CE: célula estrelada ou célula de Ito CES: célula endotelial sinusoidal CEP: Comitê de Ética em Pesquisa CH: cirrose hepática CTGF: fator de crescimento de tecido conjuntivo ( nnective tissue growth factor ) DHGNA: doença hepática gordurosa não-alcoólica EHNA: esteato-hepatite não-alcoólica EIA: técnica por enzimaimunoensaio ( enzime imuno assay ) FA: fosfatase alcalina FH: fibrose hepática FHPRÉ: fibrose hepática pré-tratamento

14 xiii FIBROSURE: testes de escore de fibrose hepática FT: Fibrotest, testes de escore de fibrose hepática GGT: gama glutamil transpeptidase GGTPRÉ: nível sérico da gama glutamil transpeptidase pré-tratamento HBC: hepatite B Crônica HC C: hepatite C crônica HCV RNA: ácido ribonucléico do vírus da hepatite C HCV: vírus da hepatite C HEPASCORE: testes de escore de fibrose hepática IFN-α: interferon alfa IHS: infant hepatitis síndrome KS: Keratan sulfate, sulfato de queratina LSN: limite superior da normalidade MMP: metaloproteinases matriciais MSNIFH: marcadores séricos não invasivos de fibrose hepática NPLAQ: número de plaquetas NR: pacientes sem resposta virológica ao tratamento com interferon alfa e ribavirina NSAH: nível sérico de ácido hialurônico PCR HCV-RNA: ácido ribonucléico do vírus da hepatite C pelo método da reação em cadeia da polimerase PCR: reação em cadeia da polimerase ( polymerase chain reaction ) PEG-IFN: interferon peguilado PIIINP: N-terminal pró-peptídeo tipo III do colágeno PLAQPRÉ: número de plaquetas pré-tratamento RBV: ribavirina

15 xiv RIBA: teste sorológico para detecção do Anti-HCV (recombinant immunoblot assay) RT-PCR: teste utilisando biologia molecular, pelo método da reação em cadeia da polimerase com a enzima transcriptase reversa (reverse transcription polymerase chain reaction, para diagnóstico de hepatite C crônica RV: pacientes com resposta virológica ao tratamento com interferon alfa e ribavirina RVP: pacientes com resposta virológica precoce ao tratamento com interferon alfa e ribavirina RVS: pacientes com resposta virológica sustentada ao tratamento com interferon alfa e ribavirina ( sustained virological response ) TAP: tempo de atividade de protrombina TIMP s : inibidores das metaloproteinases matriciais TMA: teste utilizando biologia molecular pela amplificação do ácido nucléico mediada pela transcriptase reversa (transcription-mediated amplification, método TMA), para diagnóstico de hepatite C crônica USG: ultra-sografia abdominal VPN: valor preditivo negativo VPP: valor preditivo positivo

16 xv SUMÁRIO Título Pág. Dedicatória v Agradecimentos vi Resumo viii Abstract ix Lista de figuras e gráficos x Lista de tabelas xi Lista de abreviaturas e siglas xii 1- Introdução Revisão de literatura Fígado Anatomia do fígado Histologia do fígado Fisiologia do fígado Hepatite C Epidemiologia Diagnóstico laboratorial Genotipagem Quasispecies Análise bioquímica Biópsia hepática Tratamento da hepatite C crônica Fibrogênese hepática Marcadores imunohistoquímicos de fibrose hepática Marcadores séricos não invasivos de fibrose hepática Métodos indiretos Relação entre ALT e AST Relação entre AST e Plaquetas Índice Forns Índice PGA e PGAA Fibrotest Índice de Bonacini Fibroscan Métodos diretos YKL-40 22

17 xvi Colágenos, colagenases e seus inibidores Citoquinas séricas Laminina Ácido hialurônico Localização, concentração e funções do ácido hialurônico Uso diagnóstico do ácido hialurônico na Reumatologia Uso terapêutico do ácido hialurônico exógeno Oftalmologia Ortopedia / Reumatologia Otorrinologia Dermatologia, Cosmetologia e Cirurgia Plástica Farmacologia Uso diagnóstico do ácido hialurônico na Hepatologia Uso clínico do ácido hialurônico na Hepatologia Hepatite C aguda Hepatite C crônica Cirrose hepática Hemofilia Hepatite B Crônica Doença alcoólica do fígado Doença hepática gordurosa não-alcoólica Esteato-hepatite não-alcoólica Hemangioendotelioma Complicação pós-hepatectomia Esquistossomose Hepatologia pediátrica ssociação de métodos não invasivos de fibrose hepática epascore 47 3 Objetivos 49 4 Pacientes e métodos Variáveis analisadas Acompanhamento clínico ambulatorial Primeira consulta ambulatorial HCV-RNA positivo pelo método do PCR (PCR HCV-RNA) Biópsia hepática Ultra-sonografia abdominal 55

18 xvii Termo de consentimento livre e esclarecido Após a primeira consulta ambulatorial Tratamento antiviral Acompanhamento ambulatorial Resultados do PCR HCV-RNA Exames laboratoriais de rotina Utilização de fármacos para controle de efeitos adversos Dosagem de ácido hialurônico pós-tratamento Análise estatística 58 5 Resultados Análise descritiva Características da amostra Dados laboratoriais Dados histológicos Tipo de resposta terapêutica Ácido hialurônico pré-tratamento Ácido hialurônico pós-tratamento Análise comparativa Associação entre AH pré-tratamento e ALT, GGT e plaquetas pré- 63 tratamento Avaliação qualitativa do coeficiente de correlação de Pearson Regressão múltipla Regressão linear simples Associação entre NSAH pré-tratamento e estágios de fibrose hepática Associação entre NSAH pré-tratamento e resposta virológica sustentada Variação entre NSAH pré e pós-tratamento Associação entre NSAH pós-tratamento e resposta virológica sustentada 72 6 Discussão 74 7 Conclusão 81 8 Referências bibliográficas 82

19 1 1 INTRODUÇÃO A hepatite C é um problema de saúde pública em todo o mundo. É a causa mais comum de hepatopatia crônica, acarretando o aparecimento, de maneira insidiosa e progressiva, da cirrose hepática e do hepatocarcinoma. Tem sido a principal indicação de transplante hepático no mundo. Até o início dos anos 90, a principal via de transmissão da hepatite C era a endovenosa, com o emprego de sangue e/ou derivados de sangue contaminados, seguida do uso compartilhado de seringas em pessoas infectadas pelo virus C (VHC). Atualmente, devido ao intenso e eficiente controle dos bancos de sangue, passa a ter papel mais relevante na epidemiologia, o uso de seringas contaminadas pelos usuários de drogas ilícitas. A transmissão sexual e perinatal, embora com baixa porcentagem, também podem ocorrer. Em aproximadamente 40% dos pacientes infectados, não é possível identificar a via de contaminação. Após a decodificação do genoma do vírus da hepatite C em 1989 [1], testes sorológicos possibilitaram o diagnóstico da infecção pelo vírus C (Teste Elisa e Riba). A acurácia diagnóstica aumentou com o desenvolvimento de técnicas moleculares específicas, ou seja, detecção qualitativa e quantitativa do ácido ribonucléico do HCV (RNA HCV) [2]. Essas técnicas também têm contribuído no acompanhamento dos pacientes em relação ao tipo de resposta terapêutica. A biópsia hepática é mandatória no manejo dos pacientes infectados pelo HCV, embora seja um método invasivo e passível de complicações. Ela possibilita o estadiamento da atividade inflamatória e principalmente do estágio de fibrose hepática (FH), o que influenciará na indicação do tratamento antiviral. Devido ao fato da FH ser distribuída de maneira heterogênea no parênquima hepático, a biópsia hepática fica propensa à variabilidade diagnóstica. Dessa forma,

20 2 os métodos de detecção de fibrose hepática séricos, respiratórios ou por imagem têm sido utilizados como alternativa para diagnosticar e acompanhar a FH. Os marcadores séricos não invasivos de fibrose hepática (MSNIFH) se dividem em diretos e indiretos. Os indiretos refletem alterações laboratoriais quanto à função hepática, dentre elas, as aminotransferases e a contagem de plaquetas. Já os diretos refletem o balanço entre a síntese e a degradação da matrix extracelular, isto é, fibrogênese e fibrólise hepáticas. Dentre os MSNIFH diretos mais estudados, está o ácido hialurônico (AH), um glicoaminoglicano, produzido pelas células estreladas (células de Ito) e degradado pelas células endoteliais sinusoidais hepáticas. Durante a injúria hepática, as células estreladas quiescentes, armazenadoras de vitamina A, são ativadas e se transformam em células fibrogênicas. Essa ativação tem sido descrita como fator central do processo fibrótico hepático. A capilarização sinusoidal hepática, decorrente da perda funcional das células endoteliais sinusoidais, associada à fibrose peri-sinusoidal, diminuí o clearance do AH, o que leva a um aumento de sua concentração sérica, fato observado com a progressão da fibrose e do desenvolvimento da cirrose hepática. A terapia para a hepatite C crônica, proposta atualmente, somente é eficaz em uma parcela dos pacientes. É sabido que, nesses pacientes, a FH significativa é um fator preditivo de má resposta aos antivirais, ou seja, quanto maior a FH menor a chance de resposta terapêutica [3]. Baseando-se nessas informações, foi proposto esse estudo, utilizando-se o ácido hialurônico como marcador sérico de fibrose hepática, para avaliar se este seria um fator não invasivo, preditivo de resposta ao tratamento antiviral de pacientes com hepatite C crônica.

21 3 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 FÍGADO Anatomia do fígado O fígado se localiza no quadrante superior direito do abdômen encontrandose aderido à superfície inferior do diafragma. Divide-se em lobos direito e esquerdo os quais se subdividem respectivamente em quatro segmentos. Esta subdivisão é importante para auxiliar e orientar a ressecção cirúrgica de patologias localizadas em um ou em ambos os lobos. O suprimento sanguíneo hepático é realizado em 70 a 80% pela veia porta e o restante pela art hepática. A veia porta se ramifica para o lobo direito e para o lobo esquerdo transportando sangue proveniente do tubo digestivo (circulação enterohepática). A artéria hepática e seus ramos apresentam variabilidade intra-hepática de pessoa para pessoa. A drenagem hepática é realizada pelas veias hepáticas e seus ramos, que drenam o sangue diretamente na veia cava inferior istologia do fígado Os hepatócitos se agrupam em placas poliédricas que se anastomosam entre si formando os lóbulos hepáticos. Estes se encostam uns aos outros, exceto em algumas regiões onde os lóbulos ficam separados por tecido conjuntivo e vasos, local denominado de espaços-porta (EP) ou tríadel. O EP é composto por uma vênula (ramo da veia porta), uma arteríola (ramo da artéria hepática), um ducto biliar, vasos linfáticos e nervos, cercados por tecido conjuntivo. Do espaço-porta, o sangue chega a espaços vasculares denominados de sinusóides. As paredes dos sinusóides são revestidas por células endoteliais fenestradas [4] e por macrófagos

22 4 (células de Kupffer). Os sinusóides desembocam nas veias centrolobulares e estas nas veias hepáticas. O estreito espaço entre os hepatócitos e os sinusóides é chamado de Espaço de Disse, onde é observada a célula estrelada, também denominada célula de Ito ou célula gordurosa [4], além de fibras colágenas, fibras reticulares e fibras elásticas. Esse material protéico que preenche os espaços entre as células, conduz os vasos sanguíneos e linfáticos forma a matriz extracelular [5]. O canalículo biliar localizado entre os hepatócitos, com função coletora de bile, desemboca em ductos chamados de ducto de Hering, que vão se alargando progressivamente para formarem o ducto hepático comum [4], que transportará a bile até esta desembocar na luz duodenal. A unidade funcional do fígado, o ácino hepático, depende do suprimento da veia porta e se divide em 3 zonas: zona 1 (zona periportal), zona 3 (zona centrolobular) e zona 2 (médiolobular) Fisiologia do fígado Os hepatócitos têm como função: a síntese protéica (em particular a de albumina, assim como de lipoproteínas, protrombina e fibrinogênio); secreção de bile; desintoxicação e neutralização de toxinas; depósito de metabólitos (vitamina A, glicogênio e gordura) e gliconeogênese (produção de energia, utilizando-se do glicogênio intra-hepático).

23 HEPATITE C Epidemiologia C e silencioso, causada por um RNA vírus, da família Flaviviridae [6]. Estima-se que cerca de 3% da população mundial, isto é, cerca de 170 milhões de pessoas sejam portadoras do vírus da hepatite C (HCV) [3, 4]. Nos Estados Unidos da América, observa-se que 1.8 % da população em geral está infectada pelo HCV, com maior prevalência da doença no sexo masculino e na raça negra. Já no norte da África, a estimativa varia de 9.6 até 20% [4]. No Brasil, a incidência da hepatite C crônica, nos doadores de sangue, varia de 1,2% a 2%, diferindo entre as distintas regiões geográficas brasileiras: RegiãoNorte 2.1%; Região Sudeste 1.4%; Região Centro-Oeste 1.2%; Região Nordeste 1% e Região Sul % [7] A hepatite C crônica (HC - C) é responsável por cerca de 60% do total das hepatopatias crônicas, sendo atualmente a principal causa de cirrose hepática e transplante hepát, tanto no Brasil quanto em países desenvolvidos. A transmissão viral ocorre devido à transfusão de sangue e/ou derivados contaminados. Os grupos de riscos são pacientes em uso de drogas endovenosas ilícitas, em programas de hemodiálise, assim como receptores de órgãos ou tecidos transplantados. A transmissão perinatal pode ocorrer em cerca de 5% dos casos, com mães apresentando sorologia positiva, mas o tipo de parto e o aleitamento materno não estão associados ao maior risco de contaminação [8]. Em 10 a 30% dos infectados, o modo de transmissão é desconhecido. A forma aguda da doença, geralmente, é assintomática e os pacientes apresentarão cura espontânea em cerca de 15% dos casos. Dos pacientes que

24 6 desenvolvem a forma crônica da doença, aproximadamente 20 a 30% evoluirão para a cirrose e hepatocarcinoma em um período de 20 a 30 anos [3, 6] Diagnóstico laboratorial O teste sorológico de utilizado para a detecção do anticorpo contra o vírus da hepatite C é o anti-hcv (Teste ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay). O teste ELISA 3ª geração, é positivo em 7 a 8 semanas após exposição ao vírus. Nos pacientes que apresentam um sistema imunológico comprometido o teste ELISA, pode ser falso negativo. O anti-hcv pode persistir ou diminuir no soro durante toda a vida e até sumir com o passar do tempo. Nos pacientes com infecção crônica, o anti-hcv é sempre positivo. Já o testeriba (recombinant immunoblot assay) é um teste confirmatório, sendo atualmente pouco utilizado. Poderá ser usado quando há suspeita do teste ELISA ser falso-positivo (portadores de doenças auto-imunes). As técnicas de biologia molecular [9] para detectar o RNA-HCV no sangue são: a) qualitativa: utiliza técnica de amplificação pelo método da reação em cadeia da polimerase com a enzima transcriptase reversa (reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ou pela amplificação do ácido nucléico mediada pela transcriptase reversa (transcription-mediated amplification, método TMA), os quais apresentam limites inferiores de detecção de aproximativamente 50 e 10 UI/mL de soro, respectivamente [4]. b) quantitativa: também utiliza as técnicas de amplificação pelo método PCR ou pela técnica de amplificação de sinal, branched-dna assay (b-dna). O

25 7 método quantitativo auxilia no monitoramento da resposta ao tratamento antiviral. Os pacientes que apresentam carga viral com valores maiores que UI/mL de soro são considerados como portadores de carga viral alta Genotipagem Os genótipos do HCV são designados em números arábicos de 1 a 6. Recentemente outros genótipos foram descobertos e classificados como 7, 8, 9, 10 e 11. Todos, exceto o 10, foram reclassificados como genótipo 6. O genótipo 10 foi reclassificado como genótipo 3 devido à relação filogenética observada entre eles [4]. Os genótipos estão subdivididos em mais de 50 subtipos (1a, 1b, 2a, etc) com características próprias de agressividade e de resposta diferente ao tratamento, dificultando a elaboração de uma única vacina eficaz. O genótipo 1 (1a e 1b) é o mais freqüentemente encontrado em nosso meio, assim também na Europa e nos EUA [4, 10]. Os subtipos 1a e 3a estão mais relacionados com o uso de drogas injetáveis, enquanto o 1b está associado com a hemotransfusão [4] A genotipagem não interfere na progressão da doença nem com a severidade da mesma, mas está relacionada com a duração do tratamento [4, 9]. Nos genótipos 2 e 3, o tratamento se faz por 24 semanas e nos genótipos 1 e 4, por 48 semanas, por serem estes mais resistentes. O paciente cirrótico, qualquer que seja o genótipo, é tratado por 48 semanas.

26 Quasispecies Pode ocorrer heterogenicidade genética na seqüência do vírus C em uma mesma pessoa, decorrente de mutações durante a replicação viral, fenômeno conhecido de quasispecies [4]. Essa característica viral pode explicar a ausência de resposta imune ao tratamento (ausência de clearance viral ) e a persistência da infecção. FIGURA 1 - Prevalência dos diferentes genótipos do HCV no Brasil Fonte: Campiotto et al., (modificado) Análise bioquímica A HC - C pode cursar com níveis flutuantes das aminotransferases (ALT e AST) [11]. Pacientes com valores séricos normais das aminotransferases, ou seja, cerca de 20% podem já apresentar certo grau de FH, com indicação de tratamento [8, 11]. Outros autores mencionam que pacientes com taxas normais e persistentes

27 9 de aminotransferases podem apresentar leve inflamação com nenhum estágio de fibrose hepática na histologia [12]. Outra enzima, que também pode estar elevada no soro, é a gama-glutamiltransferase (GGT), que tem sido associada a fator preditivo de resposta ao tratamento [13] BIÓPSIA HEPÁTICA O padrão ouro utilizado para o diagnóstico tanto de inflamação quanto de fibrose ou cirrose hepática, é ainda a biópsia hepática (BH). A BH percutânea apresenta uma taxa de mortalidade de 0,01 a 0,1 % [14]. Sendo um método invasivo e por vezes com pouca aceitação entre os pacientes [15], é sujeito a restrições clínicas (volumosa ascite, coagulopatias e DPOC grave) e complicações (dor no local da punção, ematoma de parede abdominal, hemoperitôneo, pneumotórax e perfuração colônica e/ou da vesícula biliar). O fragmento de tecido hepático, obtido através da BH, reflete parcialmente a fibrose dentro do fígado, representando 1/ da massa total do fígado acarretando erro amostral [16-18]. A insuficiência de material coletado ou a divergência nos achados histopatológicos, por parte dos patologistas, pode ocasionar sub ou superestimação do estágio de fibrose hepática. Oberti reportou que o grau de experiência e a longa prática dos patologistas têm certamente um grande impacto na interpretação do diagnóstico da biópsia hepática, até maior do que o próprio tamanho da amostra [19]. Desse modo, o tamanho da amostra e o tipo de agulha, usada durante o procedimento, estão diretamente relacionados com a acurácia do diagnóstico de fibrose hepática. Colloredo concluiu que uma amostra adequada deveria ter, no mínimo, 20 mm de extensão com no mínimo 11 espaços-

28 10 portas completos [20]. Já outros autores descrevem que uma amostra ideal deveria ter, no mínimo, 15 mm de extensão com mais de 5 espaços-porta [21, 22]. Abdi sugere que a biópsia hepática sejarealizada em três sítios diferentes, o que aumentaria o acerto no diagnóstico de fibrose hepática em cerca de 80 a 100% [23]. Regev também sugere que amostras obtidas de diferentes lobos hepáticos, durante procedimento laparoscópico, informariam diferentes graus de fibrose em um terço dos casos [24]. A fibrose hepática, em si, tem um valor preditivo de morbidade e de mortalidade, indicando os pacientes candidatos à terapia antifibrótica. As classificações anatomopatológicas mais utilizadas são a de Knodell-Ishak (Tabela 1) e a de METAVIR (Tabela 2) [3, 25-27]. Tabela 1 Estadiamento (alteração arquitetural, fibrose hepática e cirrose) conforme a classíficação histológica de Knodell-Ishak Estágio de fibrose F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 Descrição ausência de fibrose portal expansão fibrosa de alguns espaços- porta, com ou sem curtos septos fibrosos expansão fibrosa de muitos espaços-porta, com ou sem curtos septos fibrosos expansão fibrosa dos espaços-porta com ocasionais pontes porta-porta expansão fibrosa dos espaços-porta com marcadas pontes porta-porta, assim como pontes porta-centro marcadas pontes porta-porta e/ou porta-centro com ocasionais nódulos (cirrose incompleta) cirrose provável ou definitiva

29 11 Tabela 2 - Estadiamento da fibrose e cirrose hepática conforme a classíficação histológica METAVIR Estágio de fibrose F0 F1 F2 F3 F4 Descrição ausência de fibrose portal e periportal fibrose portal e periportal sem septos fibrose portal e periportal com raros septos fibrose portal e periportal com numerosos septos cirrose TRATAMENTO DA HEPATITE C CRÔNICA De acordo com o consenso do National Institute of Health (NIH) e a Associação Européia para Estudos das Doenças do Fígado os pacientes com hepatite crônica pelo vírus C devem seguir critérios mínimos para receberem tratamento específico da doença [3]. São eles: 1- Elevação da ALT por no mínimo seis meses; 2- CV RNA detectável no soro; 3- Doença hepática compensada; 4- Abstinência alcoólica e de drogas ilícitas; 5- Biópsia hepática com algum grau de doença; 6- Aderência do paciente ao tratamento; 7- Ausência de contra-indicação ao tratamento; ialmente o tratamento era realizado com interferon-alfa recombinante (IFN-α) uma taxa de erradicação do vírus de apenas 10 à 15% dos casos [28]. A partir de

30 , iniciou-se uma associação do INF-α com a ribavirina na tentativa de melhorar a resposta terapêutica, o que foi verificado em cerca de 30 a 40% dos pacientes [3, 13]. No início dos anos 2000, para melhorar a taxa de resposta terapêutica e aumentar a meia-vida do medicamento, uma molécula de polietilenoglicol foi incorporada ao IFN-α, medicamento denominado peginterferon (PEG-IFN) [29]. A resposta à terapêutica antiviral significa negativação viral e engloba resposta bioquímica (melhora dos parâmetros laboratoriais), rsposta histológica (melhora histológica) e resposta virológica (RNA HCV indetectável). A resposta virológica pode ser dividida em: a) resposta virológica precoce (RVP) com negativação do RNA HCV na 12ª semana de tratamento; b) resposta virológica [30], com negativação do RNA HCV na 24ª ou na 48ª semana de tratamento, respectivamente para genótipos 2 ou 3 e genótipo 1; c) resposta virológica sustentada (RVS ou sustained virological response ) com negativação do RNA HCV após 24 semanas do término da administração dos medicamentos; Os pacientes genótipo 1 que não respondem à terapêutica no sexto mês de tratamento são ditos não-respondedores (NR), e por isso as medicações deverão ser suspensas. Dentre os fatores preditivos de boa resposta terapêutica, estão incluídos: pacientes genótipos 2 e 3; baixo grau de FH ( pacientes cirróticos respondem menos ao tratamento); carga viral baixa (< UI/mL); pacientes jovens; pacientes do sexo feminino e valor normal da GGT pré-tratamento [3, 13]. Tanto o interferon (IFN-α ou PEG-IFN) quanto a ribavirina apresentam diversos efeitos adversos. Dentre os mais relacionados com o uso do interferon

31 13 destacam-se: febre, mal-estar, astenia, dores musculares, queda de cabelo, insônia, irritabilidade, nervosismo, depressão, diminuição do apetite, perda de peso, pancitopenia e disfunção tireoidiana. Já com a ribavirina, observa-se, principalmente, anemia hemolítica, sendo esta contra-indicada nos pacientes portadores de insuficiência renal crônica e doença valvular cardíaca, optando-se nesses casos, pela monoterapia com o IFN-α ou PEG-IFN FIBROGÊNESE HEPÁTICA A fibrose hepática (FH) é sem dúvida um dos resultados mais temíveis durante o curso das hepatopatias crônicas. A fibrogênese hepática é um processo dinâmico, envolvendo o balanço entre a produção (fibrogênese) e a degradação (fibrólise) de substâncias na matriz extracelular [5, 31, 32]. Na presença de fatores inflamatórios, degenerativos ou neoplásicos hepáticos, e quando os estímulos para a fibrogênese superam os da fibrólise, o tecido fibroso é gerado e acumulado na MEC, constituindo a fibrose hepática. Não se deve confundir fibrose com cirrose, já que a primeira é um componente da cirrose, e esta última é um processo generalizado que acarreta uma regeneração nodular com desarranjo do parênquima hepático, associado ao aparecimento de alterações vasculares como as fístulas porto-hepáticas e arteriovenosas intrahepáticas, desvios porto-sistêmicos (colaterais) e capilarização sinusoidal [33]. O desenvolvimento da FH significativa e a progressão para a cirrose [34] estão mais fortemente relacionados com: a) pacientes do sexo masculino; b) idade maior que 50 anos; c) longo tempo de exposição causal;

32 14 d) presença de co-morbidades como obesidade e diabetes mellitus; e) uso crônico diário de álcool; f) co-infecção HCV / HIV; g) aumento da GGT, caracterizando lesão dos ductos biliares, por ação do HCV; h) trombocitopenia, associada ao desenvolvimento de hipertensão portal e diminuição na produção de trombopoetina pelo fígado; i) síntese de colesterol diminuída; j) aumento da bilirrubina indireta, devido ao shunt portal-sistêmico; Quando o agente causal é removido antes do desenvolvimento da cirrose, a fibrose hepática pode ser revertida. Assim, a fibrose recente tem remoção mais rápida; nas fibroses mais antigas, a remoção é mais demorada. O exemplo dessa regressão de fibrose tem sido demonstrado na esquistossomose, em estudos experimentais, evidenciando que o colágeno do tipo III predomina nas fibroses recentes; e o do tipo1, nas fibroses densas e antigas [33]. O colágeno é o responsável pelas principais características da MEC, podendo ser degradado com rapidez ao ser depositado extracelularmente. No fígado normal o colágeno está localizado em grande quantidade na cápsula de Glisson ao redor dos grandes vasos,portal e no espaço subendotelial. Na presença de uma fibrose avançada, o colágeno pode aumentar de 3 a 10 vezes o seu valor basal [35]. A célula estrelada (CE), ou célula de Ito, é um dos principais componentes da MEC. Em condições fisiológicas, tem função armazenadora de gordura e vitamina A (retinóide). Durante a injúria hepática, ocorre um influxo de células inflamatórias com posterior proliferação e ativação das CE quiescentes. Estas, ao serem ativadas, perdem vitamina A, se tornam altamente proliferativas, se transformam em células

33 15 miofibroblásticas do tipo contrátil e sintetizam o colágeno do tipo I. As CE também passam a secretar outras citoquinas envolvidas na fibrogênese [35]. É o que se observa na HC - C onde o vírus induz, no fígado do hospedeiro, um stress oxidativo. Por outro lado, as CE podem ser também ativadas por citoquinas fibrogênicas como [32]: o fator ß de crescimento tumoral (TGF-ß), o maior estímulo à produção de colágeno I; o fator alfa de necrose tumoral (TNF-α); o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), relacionado à proliferação de células estreladas; a proteína quimiotáxica dos monócitos (MCP-1); a endotelina (ET-1), o mais potente estímulo contráctil das CE; As CE também estão relacionadas à degradação da MEC pela liberação das metaloproteinases matriciais (MMP). Estas, por sua vez, se dividem em cinco categorias diferentes [35]: colagenases intersticiais: MMP 1, 8 e 13; gelatinases: MMP 2 e 9; estroma-lisinas: MMP 3, 7, 10 e 11; metaloproteinase tipo-membrana: MMP 14, 15, 16, 17, 24 e 25; metaloelastase: MMP 12; As metaloproteinases são inibidas pelos inibidores teciduais das metaloproteinases (TIMPs). As células de Kuppffer também podem estimular [35]: a síntese de colágeno pela MEC, através do TGF-β;

34 16 a proliferação celular, atribuída ao TGF-α; a liberação de retinóide pelas células estreladas através de citoquinas, especialmente a TGF-β1 e ROS; as substâncias anti-inflamatórias, como a interleucina ( IL-10), que regulam a fibrogênese, diminuindo a síntese do colágeno e aumentando a produção de colagenase; o óxido nítrico, que reduz a proliferação e a contratilidade da CE e é o antagonista endógeno da endotelina 1; os reactive oxygen species (ROS), capaz de aumentar a síntese de colágeno; as prostaglandinas D2 (PGD2) e prostaglandinas E2 (PGE20), que mediam o relaxamento da contratilidade das CE; os tromboxanes, que promovem a contratilidade das CE; Os leucócitos, além das células de Kupffer, também modulam as CE [35]. Os neutrófilos ativados são uma importante fonte de ROS assim como de óxido nítrico MARCADORES IMUNO e coma sua estreladas,fibroblastos, através da expressão de α-actina de músculo liso ( ),de [10]., e que de, em relação à FH e à atividade necro-inflamatória [36]. E os marcadores histo,nto de tecido conjuntivo (CTGF, nnective tissue growth factor ). Trata-se de estreladas,

35 17 A a,demonstraque,de reversibilidade enquanto que o aparecimento de vitronectina,demonstra de [37] MARCADORES SÉRICOS NÃO INVASIVOS DE FIBROSE HEPÁTICA O MSNIFH ideal seria aquele capaz de oferecer acurada informação sobre a atividade de fibrogênese hepática, além dos diferentes graus de FH nos pacientes com doença hepática progressiva e crônica [16, 17, 32]. Apresentaria as seguintes características: alta especificidade para o fígado; capacidade de mensurar todos os estágios de fibrose, atividade de depósito e remoção da MEC; meia vida e via de excreção conhecidos; não ser passível de influência por outras co-morbidades, como doença renal ou do sistema retículo-endotelial; alta sensibilidade; reprodutibilidade; fácil realização; A utilização dos MSNIFH é uma alternativa à BH, uma vez que são, na sua grande maioria, de fácil realização e passíveis de avaliação já na fase inicial do acompanhamento clínico. Na prática, entretanto, os MSNIFH, têm algumas desvantagens, como a variabilidade interlaboratorial e a falta de reprodutibilidade,

36 18 mas, sobretudo podem ocasionar erro no diagnóstico de fibrose hepática em até 20% dos pacientes, o que impede que sejam usados em substituição integral à BH [17]. São classificados em diretos e indiretos. Os diretos estão relacionados diretamente com a fibrogênese hepática, ou seja, com o turnover da MEC. Os indiretos indicam as alterações na função hepática sem refletirem o metabolismo da MEC. Como marcadores diretos, cita-se o ácido hialurônico, os diferentes tipos de colágeno e colagenases e dentre os marcadores indiretos, destaca-se as aminotransferases, GGT, bilirrubina total, contagem de plaquetas, colesterol total, gama-globulina e fatores de coagulação, que são parâmetros comumente utilizados nos pacientes hepatopatas crônicos, além de outros menos usados como α 2 macroglobulina, apoliproteína A1, haptoglobina MÉTODOS INDIRETOS Relação entre ALT e AST Os níveis sanguíneos de AST e ALT aumentam com a progressão da FH. Em um estudo realizado em pacientes HCV positivos abstêmios observou-se que, quando a razão das dosagens de AST/ALT é maior que um (AST/ALT > 1), há fibrose intensa ou cirrose (F3 e F4, METAVIR) e se menor que um (AST/ALT < 1) a fibrose é moderada, leve ou está ausente (VPP de 43,2% e especificidade de 81,6%). Associando-se ao método a contagem de plaquetas (cut-off /mm3), este poderia detectar com mais certeza a FH intensa (VPP=93% e especificidade=99%). Todavia, se estes parâmetros forem utilizados isoladamente nos pacientes com nenhum ou leve estágio de fibrose, os valores obtidos de

37 19 sensibilidade, especificidade, VPP e VPN seriam insatisfatórios. Neste estudo foi ainda constatado, que 7,1% destes pacientes poderiam não ter realizado a BH [38]. Giannini demonstrou também que a taxa ASL/ALT e a contagem de plaquetas apresentavam uma alta acurácia no diagnóstico de FH significativa (80,5%), e que esses três marcadores séricos juntos em um algoritmo poderiam evitar a realização da BH em cerca de 70% dos pacientes [39] Relação entre AST e plaquetas A relação entre AST e plaquetas (índice APRI) utiliza valores séricos da AST e de plaquetas, tendo, como vantagens, um preço acessível, fácil aplicação e fácil memorização. Sua fórmula é mostrada a seguir: APRI = (AST / limite superior da normalidade) X 100 Contagem de plaquetas(10 9 / L) 6 Em estudo realizado por Lackner em pacientes HCV positivo, esse índice foi capaz de excluir a cirrose em cerca de 85% dos pacientes [40] Índice FORNS O índice de Forns, de fácil obtenção e relação custo/benefício razoável, foi desenvolvido para discriminar pacientes com e sem FH significativa. Estudando 351 pacientes com hepatite C crônica, todos submetidos à BH, foi então construído um modelo e um sistema de escore, combinando-se variáveis como: a idade do paciente, valor de GGT, valor de colesterol e contagem de plaquetas.

38 20 Forns demonstrou que, com este modelo um score abaixo de 4.2, excluiria a presença de FH significativa em 36% dos pacientes (VPN= 96%) e concluíu que a combinação destas variáveis tornaria desnecessária a realização da BH em cerca de um terço dos pacientes [15] Índice PGA e PGAA O índice PGA associa medidas de tempo de atividade de protrombina, GGT e apolipoproteína A1 enquanto que no índice PGAA foi acrescido o valor de α-2 macroglobulina [17] Fibrotest O Fibrotest (FT) e o Fibrosure são testes de escore de FH equivalentes, utilizados respectivamente na Europa e nos EUA. O Fibrotest foi desenvolvido na França, pela equipe do Prof. Poynard, utilizando-se um score que vai de zero a 1 e que combina os seguintes parâmetros laboratoriais: α-2 macroglobulina (inibidor de protease cuja concentração aumenta com a ativação das células estreladas e FH); alfaglobulina (haptoglobina), gamaglobulina, apolipoproteína A1, GGT e bilirrubina total. Tal escore foi estabelecido a partir de um estudo realizado em 377 pacientes portadores de HC - C, com uma prevalência de 40% de FH significativa à BH ( F2 METAVIR). Nesses pacientes, um escore menor que 0,1 permitiu eliminar uma FH 2 ( Classificação de METAVIR) com um VPN de 100%. Ao contrário, um escore

39 21 maior que 0,6 permitiu predizer uma FH 2, com um VPP maior que 90%. Nesse estudo, utilizando-se esse escore, teria sido possível evitar a BH em cerca de 46% dos pacientes [18]. Em outro estudo retrospectivo, realizado em pacientes HCV positivos, tratados com interferon alfa, foi demonstrada uma diminuição significativa do escore de fibrose nos pacientes respondedores, comparado aos pacientes nãorespondedores ou recidivante, constatando que o Fibrotest é útil na avaliação terapêutica antifibrótica [41] Índíce de Bonacini O índice de Bonacini utiliza, como parâmetros, a relação AST/ ALT, a contagem de plaquetas e a taxa de protrombina, além de ter sido proposto para substituir a BH no diagnóstico de cirrose hepática nos portadores do vírus C. Um escore maior de 7 permitiria o diagnóstico de cirrose hepática, com uma especificidade de 100%. Em contrapartida, um escore menor que 3 eliminaria a CH com apenas uma especificidade de 58%. Entretanto, nesse estudo, a maioria dos pacientes estavam compreendidos entre um escore de 3 e 7; dessa forma, este algoritmo teria evitado a BH em somente 23% dos casos [42] Fibroscan É um método radiológico no qual se mede a dureza do fígado através da elastografia, correlacionando-a com a fibrose hepática. Por utilizar uma técnica ultrasonográfica não será descrito nesta monografia MÉTODOS DIRETOS

40 YKL-40 É uma glicoproteína, presente nas cartilagens e no tecido hepático dos seres humanos. É um novo marcador de FH, sendo, inicialmente, estudado nos pacientes com doença hepática alcoólica. Em um estudo com pacientes HCV positivos, mostrou especificidade de 81% e sensibilidade de 78%, mas com uma acurácia baixa em predizer cirrose hepática [43] Colágenos, colagenases e seus inibidores O nível sérico do colágeno do tipo IV aumenta com a progressão da FH. Tem sido estudado tanto em pacientes com doença gordurosa hepática não alcoólica (DHGNA) como nos com hepatite C crônica. Entretanto, Murawaki, estudando pacientes HCV positivos, comparou a acurácia de alguns MSNIFH, observando que o AH apresentou-se como melhor preditor de FH em relação ao colágeno do tipo IV [44]. O N-terminal pró-peptídeo tipo III do colágeno (PIIINP) tem sido também avaliado como marcador de FH na hepatite C e na doença alcoólica do fígado, mas com resultados inferiores, se comparado ao AH e colágeno do tipo IV. Por outro lado, Pares concluiu que o PIIINP tem sido considerado bom índice de fibrogênese nos pacientes alcoólatras crônicos em ingestão ativa de álcool [45]. Outro estudo realizado por Festuccia, mostrou que o nível sérico de PIIINP parece ser o principal marcador de atividade inflamatória na hepatite C crônica e que este marcador poderia ser útil em monitorar a resposta terapêutica com agentes antifibróticos e antifibrogênicos [46].

41 23 As metaloproteinases matriciais (MMP) e seus inibidores (TIMP s ) têm sido descritas como marcadores de fibrose hepática. As MMP e as TIMP s são também expressas em outros tecidos, não sendo específicas para o fígado [47]. A diminuição da MMP-1 foi correlacionada com a severidade da atividade necroinflamatória do tecido hepático, enquanto a MMP-2, com a progressão da FH [48, 49]. No estudo de Lichtinghagen com pacientes HCV positivo, foi demonstrado que, tanto a expressão da MMP quanto a da TIMP s, aumentava na progressão para a cirrose hepática [47] Citoquinas séricas Imbert-Bismut concluiu que o TGF-β apresentaria menor capacidade de predizer o grau de FH, se comparado a outros MSNIFH [50] Laminina No estudo de Santos, com pacientes portadores de DHGNA, a combinação de laminina e colágeno tipo IV apresentava 100% de VPP e sensibilidade diagnóstica de 64%, para discriminar pacientes com significativa fibrose [51] Ácido hialurônico O ácido hialurônico (AH) também chamado hialuronan ou hialuronato, é sintetizado pelas células estreladas abundantes do tecido embrionário ou mesenquimal, sendo uma substância estrutural da MEC. Atinge a circulação sistêmica através do sistema linfático. É degradado pelas células hepáticas endoteliais sinusoidais por um processo mediado por receptores específicos [52, 53].

42 24 A maior quantidade de AH é observada nos linfonodos intestinais, os quais recebem a linfa proveniente do estômago, do mesentério e do próprio intestino [54]. O AH é um polissacarídeo linear, formado por unidades de dissacarídeos que contêm, na sua estrutura, N-acetil-D-glucosamina e ácido β-glucurônico, estando presente em quase todos os líquidos e tecidos do organismo. No interior de sua molécula, circula o líquido intersticial com nutrientes e oxigênio, além de também serem eliminados produtos do catabolismo celular. Em condições fisiológicas, é encontrado em baixas concentrações, no soro de pacientes jovens e, à medida que a idade avança, sua concentração se eleva [55]. Normalmente, também, é observado em altas concentrações no líquido sinovial, já que nas articulações tem o papel de reter água e lubrificar as mesmas [56]. O nível sérico de ácido hialurônico (NSAH) aumenta após a ingesta de determinados alimentos, principalmente os gordurosos e os ricos em glicose (45-90 minutos após as refeições), o que é explicado, provavelmente, pela vasodilatação esplâncnica e a motilidade intestinal, decorrentes do maior influxo de AH proveniente dos linfonodos intestinais [54, 57]. É também relatado que o NSAH pós-prandial aumentaria mais nos pacientes com hepatite crônica com maior atividade necroinflamatória e com maior estágio de fibrose, assim como nos pacientes portadores de cirrose hepática [54]. Também, observa-se que, após a realização de exercício físicos, em pacientes portadores de artrite reumatóide, ocorre aumento do NSAH, já que o AH endógeno, presente nas articulações, penetraria na circulação através dos movimentos musculares e articulares [54, 58].

43 25 Elevadas concentrações do NSAH também têm sido reportadas como decorrentes de processo inflamatório hepático, na presença de colagenoses e/ou em certos tipos de doenças malígnas [54] Localização, concentração e funções do ácido hialurônico Anteriormente, pensava-se que o AH era apenas uma molécula inerte e preenchedora do tecido conjuntivo, mas sabe-se que o AH, ao se ligar a proteínas ou a receptores, pode mediar outras atividades funcionais. Cita-se o importante papel na embriogênese e na motilidade celular. Sua função está relacionada diretamente com o tamanho de sua molécula, ou seja, grandes polímeros de AH têm função preenchedora de espaços, ação antiangiogênica e imunossupressiva. Os de tamanho intermediário têm ação inflamatória, imuno-estimuladora e altamente angiogênica. Já os de baixo peso molecular funcionam como alertas de perigo endógeno [56]. A tabela 3 mostra que a maior concentração de AH no corpo humano é localizada no cordão umbilical, líquido sinovial, humor vítreo ocular, derme e epiderme; além de concentrações variadas, em outros animais vertebrados. Tecidos como os da crista do galo, pele de tubarão e olhos de boi, funcionam como fonte de AH de alto peso molecular. Preparados obtidos, principalmente, com a crista do galo são comercializados e aprovados pela FDA (Food and Drug Administration, USA) para aplicação em seres humanos, embora seja totalmente descartado seu uso clínico em pacientes alérgicos a produtos aviários. O AH também pode ser secretado por certos microorganismos, como por exemplo, cepas atenuadas de Streptococcus zooepidermicus e Spreptococcus equisimillis, chamado de AH fermentativo ( fermentative HA ) [56]. Entretanto,

44 26 mutações podem ocorrer, com a possibilidade de produção de toxinas, pirógenos e complexos imunogênicos, o que acarreta a diminuição de seu uso na prática médica. Cepas de bactérias geneticamente modificadas, como Bacillus subtilis, têm sido também descritas como produtoras de AH, de menor peso molecular, o qual é denominado de AH extraído ( extractive HA ). Tem como vantagem, seu fácil cultivo em laboratório e a não produção de hialuronidase, o que não degradaria o AH sintetizado assegurando seu uso principalmente na cosmetologia. A pele pode chegar a ter grandes concentrações de AH, que se localizam inter e intracelularmente. Dentro da célula, podem aumentar o volume da derme por reterem água, além de influenciarem a proliferação, a diferenciação e o reparo tissular. Também têm função protetora, quando a pele está em contato direto com os raios ultra-violetas, diminuindo o stress oxidativo, a degeneração e a morte celular. Tabela 3 - Concentrações de AH em diferentes tecidos de seres humanos e de outros animais vertebrados. TECIDOS /FLUÍDOS CONCENTRAÇÃO COMENTÁRIOS ORGÂNICOS (ng/ml) Crista do galo 7500 Local onde se encontra a maior concentração de AH. Cordão umbilical humano 4100 Contém AH com alto peso molecular Fluído sinovial humano Concentração de AH aumenta sob condições inflamatórias. Cartilagem nasal bovina 1200 Geralmente usado como modelo de cartilagem em estudos experimentais. Humor vítreo humano Concentração de AH aumenta com a maturação deste tecido Derme humana Sugerido como agente rejuvenescedor na cosmetologia. Epiderme humana 100 Concentração de AH é muito maior em torno

45 27 Cérebro de coelho 65 Coração de coelho 27 Linfonodos torácicos humanos Urina Humana Soro Humano das células que o sintetizam. AH foi suposto como provável redutor da ocorrência de tumor cerebral. AH é o constituinte principal da matriz patológica que obstrui a artéria na reestenose coronariana. Apresentam moléculas de AH de baixo peso molecular, já que os de maior peso se encontram no fígado (CES). Urina é uma importante fonte de hialuronidase. Concentração sérica de AH aumenta nos idosos, assim como nas hepatopatias crônicas e nas artropatias Uso diagnóstico do ácido hialurônico na Reumatologia O nível sérico de AH tem sido utilizado como marcador de inflamação sinovial como também tem sido correlacionado com a progressão de doença em portadores de artrite reumatóide em atividade e osteoartrite tíbio-femoral [59]. É sugerido que altos NSAH possam predizer a destruição das articulações [60]. Sharif investigou em pacientes portadores de osteoartrite tíbio-femoral do joelho vírgens de tratamento, o valor preditivo de progressão da doença utilizando o AH e o sulfato de queratina [61]. Esse dois marcadores foram mensurados na admissão e em até 5 anos após a inclusão no estudo. Constataram que: a) quando havia progressão da doença, o NSAH aumentava significantemente quando comparados aos níveis basais; b) o NSAH basal no grupo dos pacientes com progressão da doença já era aumentado; c) os níveis de KS entre os pacientes com e sem progressão da doença não sofreram alteração; d) pacientes com prévias cirurgias no joelho, também apresentaram NSAH aumentado quando comparado ao

46 28 grupo não-operado; e) idade e espaço articular mínimos apresentavam significativa associação com NSAH [59]. No estudo de Majeed, foram selecionados pacientes com artrite reumatóide em atividade (AR) em fase precoce da doença e 47 pacientes-controle com o objetivo de medir o NSAH e correlacioná-lo com achados clínicos e laboratoriais de atividade da doença e com achados radiográficos de erosão articular. Concluiu-se que: a) o NSAH nos pacientes com AR eram significantemente aumentados em relação aos pacientes controles; b) o AH não se correlacionava com ou sem a positividade do fator reumatóide nem com HLA-DRBI (HLA-DRBI shared epitope sequence), o qual está associado à severidade da doença; c) o NSAH basal se correlacionava com atividade e a progressão da doença; d) pacientes que apresentassem erosões articulares no primeiro e no segundo ano de acompanhamento apresentavam NSAH maiores, embora esses valores não fossem necessariamente altos basalmente [60] Uso terapêutico do ácido hialurônico exógeno Além de marcador diagnóstico para certas patologias, como as doenças hepáticas e articulares, o AH apresenta diferentes aplicabilidades na área médica, conforme descrito abaixo [56]: 1- Visco-cirurgia: protegendo delicados tecidos e providenciando espaço durante as manipulações cirúrgicas, como por exemplo, na cirurgia oftalmológica 2- Visco-preenchimento: preenchendo ou aumentando espaços entre os tecidos, como na pele, músculos esfincterianos, cordas vocais ou tecidos faríngeanos

47 29 3- Visco-separação: separando o tecido conjuntivo traumatizado, decorrente de procedimentos cirúrgicos ou de trauma externo, evitando a aderência ou a formação excessiva de cicatrizes 4- Visco-substituição: substituindo fluídos, como por exemplo, na substituição de líquido sinovial nas artrites com o intuito de diminuir a dor da inflamação local 5- Visco-proteção: protegendo superfíceis saudáveis ou danificadas por agentes nocivos, como por exemplo, secura, queimaduras ou úlceras da pele, promovendo a sua cicatrização Destaco o uso terapêutico do preparado comercial do AH nas seguintes especialidades: Oftalmologia O AH tem importante papel nessa especialidade devido à sua propriedade viscoelástica, protegendo os tecidos oculares e promovendo espaço durante as cirurgias oftalmológicas. Entretanto, é na cirurgia de catarata e na implantação de lentes que se observa o seu grande uso, onde o preparado comercial de AH, substitui o humor vítreo, perdido durante o procedimento cirúrgico. Este preparado também é utilizado como protetor de endotélio corneal durante a cirurgia de transplante de córnea [56] Ortopedia / Reumatologia A partir do final da década de 80, devido à sua propriedade viscosubstituitiva, preparados de AH começaram a ser largamente utilizados na forma de injeções intra-articulares principalmente nos pacientes com diminuição da quantidade de fluído sinovial acometidos por processos inflamatórios nos joelhos [56]. e que essa, apresenta

48 30 E analgésica mais duradoura, o bem tolerados pelos pacientes e ocasionam adversos [62] Otorrinologia A propriedade viscoelástica do AH está diretamente relacionada ao espessamento das cordas vocais derivados de AH utilizados na reparação de trauma ou de ciatrizes nas cordas vocais, reconstrução laríngea e no tratamento da insuficiência da glote. Podem também ser usados nas cirurgias da orelha e seios da face, promovendo a cicatrização da membrana timpânica, facilitando sua reepitelização ou prevenindo aderências entre as camadas da mucosa [56] Dermatologia, Cosmetologia e Cirurgia Plástica Com o envelhecimento da pele, a quantidade de AH diminui, ocasionando desidratação da derme e formação de rugas. O preparado de AH poderá ser injetado na derme e abaixo desta, aumentando sua elasticidade, seu turgor e o seu volume. Assim, devido propriedades viscoelásticas, preench rugas ou de áreas cicatriciais da pele (região perioral, periorbital, frontal, perinasal, lábios, mento e região da bochecha), conferindo um efeito cosmético prolongado. Por outro lado, esses preparados, podem ser utilizados também em reconstrução e regeneração de tecidos moles, assim como na lipoatrofia facial. Vários produtos são comercializados, podendo-se citar o Hylam B gel, derivado da crista do galo, é usado para corrigir rugas profundas e o Restylane, derivado de fermentação bacteriana, possui menor peso molecular e que pode corrigir rugas ou depressões da pele de moderada à severa intensidade

49 31 ocasionando São bem tolerados, eficazes e não ocasionam antigenicidade. iindo dor, eritema e edema transitórios no local da injeção, vistos com mais freqüência nos preparados fermentativos. Raramente causam reações de hipersensibilidade [56, 63] Farmacologia O AH, conjugado com certas drogas, otimiza sua liberação orgânica, melhorando a biocompatibilidade destas [56] Uso diagnóstico do ácido hialurônico na Hepatologia A MEC hepática representa menos de 3% do peso total de um fígado normal. Ela está presente na cápsula hepática, nos espaços-porta, na lâmina basal ao redor dos vasos sanguíneos, nos canalículos biliares, na parede das veias centrolobulares e no espaço de Disse. No fígado, o AH atravessa os poros das células endoteliais sinusoidais, onde será degradado via um processo mediado por receptores específicos e por intermédio de uma enzima chamada hialuronidase. O AH endógeno é heterogêneo, possuindo diferentes valores quanto ao peso molecular, o que está relacionado diretamente com a afinidade deste com os receptores específicos presentes nas células endotelias sinusoidais [64]. Quanto maior for a molécula de AH, maior será a afinidade desta com os receptores específicos. A diminuição funcional das CES aumentaria, preferencialmente, a concentração das grandes moléculas de AH circulantes, as quais são encontradas em número reduzido nos pacientes sem doença hepática.

50 32 Durante o processo de injúria hepática, as células endoteliais sinusoidais são as primeiras a sofrerem alterações morfológicas [53]. Na presença do vírus, as células de Kupffer são ativadas, secretam citoquinas que agem nas CES induzindo o fechamento dos seus respectivos poros, resultando em menor clearance de AH e com posterior aumento de sua concentração sérica circulante que, associado à fibrose perissinusoidal, caracteriza o processo chamado de capilarização sinusoidal. Com a progressão da injúria, as células de Ito também são estimuladas pelas citoquinas e começam a produzir colágeno, o qual será depositado no Espaço de Disse. Esse acúmulo de colágeno desencadeará o processo fibrótico (figuras 2 e 3). Dessa forma, se explica a correlação do aumento do AH tanto no aparecimento quanto com o estágio de fibrose hepática. Elevados NSAH predizem injúria hepática, podendo até serem detectados no soro antes mesmo das elevações das aminotransferases, GGT, bilirrubinas e fosfatase alcalina [53]. Desse modo a quantificação do NSAH poderá providenciar informações úteis sobre a função das células endoteliais sinusoidais, já que esta reflete a capilarização sinusoidal. Esta idéia corrobora o fato de que há correlação entre o aumento do AH e a progressão da fibrose hepática [38, 65-67].

51 33 Figura 2 - Esquema histológico mostrando: a) os hepatócitos; b) a célula estrelada (em azul) onde no seu interior ocorre a produção de ácido hialurônico (em verde); c) o sinusóide, com suas paredes revestidas por células endoteliais fenestradas, onde por mecanismos mediados por receptores específicos, o ácido hialurônico será degradado pela ação da hialuronidase UFRJ ÁCIDO HIALURÔNICO CELTHEP Figura 3 - Esquema histológico mostrando o desenvolvimento do processo fibrótico hepático com a deposição de fibras colágenas no Espaço de Disse (em bege) e a não degradação do ácido hialurônico. O ácido hialurônico em grande quantidade, atingirá a circulação sanguínea através do sistema linfático, traduzindo dessa forma o nível sérico aumentado durante a fibrogênese hepática.

52 34 UFRJ ÁCIDO HIALURÔNICO CELTHEP Uso clínico do ácido hialurônico na Hepatologia Destaco o uso clínico do AH em algumas patologias hepáticas: Hepatite C aguda Diante de injúria hepática a produção de AH aumenta, ocasionando dessa maneira, o aumento da atividade da hialuronidase na tentativa de degradação do mesmo. Sendo assim, Isman investigou se o AH e a hialuronidase poderiam ser utilizados como MSNIFH em pacientes com hepatite C aguda, com hepatite C crônica, além de 32 pacientes controles. Relatou que, nos pacientes com HC - C o NSAH, ALT e AST aumentavam, se comparados aos controles. O AH aumentava à medida que a doença hepática progredia, enquanto que a concentração de hialuronidase diminuía. Assim, concluíram que ambos seriam úteis como indicadores séricos não-invasivos de atividade na hepatite C aguda [68] Hepatite C crônica