HEPATITES Testes Moleculares
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- Maria das Dores Correia Alvarenga
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1 Responsável Técnico: Ariovaldo Mendonça - CRMMG / Inscrição CRM MG Av. das Nações, Distrito Industrial - Vespasiano/MG CEP: Tel.: atendimento@hermespardini.com.br HEPATITES Testes Moleculares Testes moleculares precisos para o diagnóstico precoce e acompanhamento do quadro clínico permitem um tratamento mais direcionado e o monitoramento da resposta do paciente à terapia.
2 HEPATITES A Melhor solução para o manejo do paciente com hepatite B Aprimorando o Manejo do Paciente e o Sucesso do tratamento da hepatite C Genética de Microorganismos Menu completo de exames para detecção e acompanhamento clínico Maior confiabilidade dos laudos Alto padrão na qualidade atrelada à utilização dos programas de controle de qualidade externos e internos Auxílio da determinação da carga viral para avaliação de prognóstico e resposta terapêutica Equipe altamente especializada Médico infectologista disponível para assessoria clínica e discussão de laudos O acompanhamento da carga viral do HBV se tornou uma ferramenta padrão para o manejo clínico da hepatite B crônica desde o início do tratamento até o monitoramento da resposta antiviral durante ele. Os testes de carga viral têm apoiado grandes ensaios clínicos de drogas para o tratamento da hepatite B aprovados pelo FDA desde Tecnologia e eficiência Alta sensibilidade e especificidade dos testes Confiança e eficácia da tecnologia de PCR em tempo real, extensivamente testada e comprovada. O COBAS AmpliPrep permite automatizar completamente a fase de preparação da amostra (extração e purificação de ácidos nucleicos), substituindo a preparação manual. O Laboratório Pardini possui testes que utilizam a tecnologia de PCR em Tempo Real aprovado pelo FDA, ANVISA e citado no guideline AASLD tanto para a para detecção do vírus da hepatite C quanto para a quantificação da carga viral do HCV. Solução em diagnóstico A tecnologia de PCR em tempo Real oferece alta sensibilidade para detecção e quantificação dos seis genótipos do HCV, auxiliando no adequado monitoramento e munindo de informação necessária para predição de resposta virológica sustentada (RVS) e manejo do tempo de tratamento adequado para cada paciente. De acordo com a American Association for the study of Liver Diseases (AASLD): para fins de monitoramento do tratamento da hepatites C, é importante utilizar o mesmo teste laboratorial antes e durante a terapia. (For monitoring purposes, it is important to use the same laboratory test before and during therapy). (1) Referência Bibliográfica 1. Adapted from Hunt CM, McGill JM, Allen MI, Condreay LD. Clinical relevance of hepatitis B viral mutations. Hepatology May;31(5): Referência Bibliográfica 1. M. G. Ghany, D. B. Strader, D. L. Thomas, and L. B. Seeff. Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C: An Update. Hepatology, 49(4):
3 Hepatite B Testes Moleculares Autores: Dr Guenael Freire Dr Adriano O March Hermes Pardini O Vírus da Hepatite B (HBV) representa uma questão global de saúde, com mais de dois bilhões de pessoas infectadas, das quais mais de 350 milhões apresentam doença crônica 1. Suas principais complicações são a cirrose e o carcinoma hepatocelular, sendo a décima maior causa de mortes em todo o mundo. Na atualidade, o Brasil é classificado como área de baixa prevalência, com menos de 1% de indivíduos portadores da doença 2. O HBV é um vírus pertencente à família Hepadnaviridae, possui genoma de fita parcialmente dupla de DNA circular e se replica através de transcrição reversa. É classificado em oito genótipos, identificados de A a H e no Brasil, predominam os genótipos A, D e F 3. Menos de 5% das infecções evoluem para a forma crônica, sendo essa definida pela persistência do marcador HBsAg por um período superior a seis meses. A pesquisa do HBeAg e a quantificação do HBV-DNA representam os dois marcadores de replicação viral utilizados na avaliação terapêutica 4. PCR Quantitativa em Tempo Real para HBV (Real Time PCR) O Hermes Pardini disponibiliza a quantificação do DNA-HBV (carga viral) através da técnica Real Time PCR, processada no sistema COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan. Essa técnica apresenta alta sensibilidade analítica (12 UI/ ml), larga faixa de linearidade, baixo risco de contaminação e amplificação inespecífica, grande velocidade de processamento e boa reprodutibilidade interlaboratorial 5. O PCR quantitativo é necessário na avaliação da indicação terapêutica para pacientes HBeAg não reagentes e no monitoramento da resposta de todos os pacientes tratados 4. PCR Qualitativa para HBV Exame útil na investigação de quadros de hepatite sem etiologia definida, como os casos de hepatite fulminante ou de hepatite crônica de etiologia indeterminada (hepatite B oculta ). O PCR qualitativo é processado por metodologia própria (in house), sendo capaz de detectar 100 UI/mL de DNA-HBV. Ressalta-se que o teste quantitativo Real Time apresenta sensibilidade suficiente para ser utilizado com o propósito qualitativo. Teste de Resistência ao Antiviral Lamivudina É processado pela amplificação do gene da DNA polimerase do HBV, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), com análise por enzima de restrição (RFLP). Indicado para avaliação de falência ao esquema de tratamento com a lamivudina. Necessita-se de uma carga viral superior a UI/mL para a sua realização. São pesquisadas as mutações de maior importância: polm552v (rtm204v), que representa a clássica mutação YMDD, polm552i (rtm204i) e poll528m (rtl180m). Referências Bibliográficas 1. Lavanchy D. Hepatitis B virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and control measures. J Viral Hepat. 2004;11(2): Estudo de Prevalência de Base Populacional das Infecções pelos Vírus das Hepatites A, B e C no Brasil. Brasília, Outubro de Roncato R, Ballardin PAZ, Lunge VR. Influência dos Genótipos no da Hepatite B. Rev HCPA 2008;28(3): Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas para o da Hepatite Viral Crônica B e Coinfecções. Ministério da Saúde Brasília DF, Allice T, Cerutti F, Pittaluga F, Varetto S, Gabella S, Marzano A, Franchello A, Colucci G, Ghisetti V. COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus (HBV) Test: a Novel Automated Real Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma. Journal of Clinical Microbiology, March 2007, p , Vol. 45, No. 3. Hepatite C Testes Moleculares Autores: Dr Guenael Freire Dr Adriano O March Hermes Pardini A OMS estima que 170 milhões de pessoas sejam portadoras de hepatite C em todo o mundo. Até 5% dos portadores falecem por complicação de cirrose ou hepatocarcinoma, tornando-a uma das principais indicações para transplante hepático. No Brasil, 1,87% dos indivíduos entre 20 e 69 anos apresentam sorologia reativa para o HCV 1. Trata-se de um vírus RNA, com elevada variabilidade genética, sendo classificados em seis genótipos, designados de 1 a 6, com mais de 50 subtipos. O genótipo possui importância epidemiológica e prediz a resposta ao tratamento antiviral. Os genótipos 1, 3 e 2 predominam em nosso meio, sendo o genótipo 1 o que ocorre com maior freqüência em todo o Brasil 2. Os métodos moleculares diagnósticos desempenham um papel imprescindível no manejo da hepatite C. PCR Quantitativa em Tempo Real para HCV (Real Time PCR) O Hermes Pardini disponibiliza a quantificação do RNA-HCV (carga viral) através da técnica Real Time PCR, processada no sistema COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan. Essa técnica apresenta alta sensibilidade analítica (15 UI/ ml), larga faixa de linearidade, baixo risco de contaminação e amplificação inespecífica, grande velocidade de processamento e boa reprodutibilidade interlaboratorial 3. É utilizado, principalmente, no monitoramento da resposta terapêutica de pacientes portadores do genótipo 1, sendo solicitado prévio ao tratamento e na 12ª semana do curso terapêutico 4,5. PCR Qualitativa para HCV Exame indicado para confirmação de infecção ativa após testagem sorológica positiva ou indeterminada e como teste inicial em situações especiais, como em imunodeprimidos, recémnascidos, nos casos de exposição ocupacional e de hepatite aguda. Adicionalmente, é indicado para o monitoramento da resposta terapêutica, sendo realizado durante e após o tratamento, de acordo com as particularidades de cada genótipo 4, 5. O HCV PCR é processado no sistema COBAS Amplicor, com limite inferior de detecção de 50 UI/mL. Ressalta-se que o teste quantitativo Real Time apresenta sensibilidade suficiente para ser utilizado com o propósito qualitativo. Genotipagem Realiza-se transcrição reversa, seguida da reação em cadeia da polimerase (PCR) e análise dos fragmentos após digestão com enzimas de restrição (RFLP). A definição do genótipo apresenta implicação prognóstica e terapêutica, determinando o esquema e a duração do tratamento 4, 5. É necessária carga viral superior a 600 UI/ml para que este exame possa ser realizado, podendo, opcionalmente, ser solicitado em conjunto com o PCR quantitativo. Referências Bibliográficas 1. Estudo de Prevalência de Base Populacional das Infecções pelos Vírus das Hepatites A, B e C no Brasil. Brasília, Outubro de Perone C, Castilo DM, Pereira GL, Carvalho NO, Januário JN, Teixeira R. Alta Prevalência do Genótipo 1 em portadores de Hepatite C crônica em Belo Horizonte, MG. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 41(3): , mai-jun, Sizmann D, Boeck C, Boelter J, et al. Fully automated quantification of hepatitis C virus (HCV) RNA in human plasma and human serum by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan system. J Clin Virol. 2007; 38: Consensus of the Brazilian Society of Infectious diseases of the Management and treatment of Hepatitis C. The Brazilian Journal of Infectious Diseases 2007;11(Suppl 1]: Ghany MG, Strader DB, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, Management and Treatment of Hepatitis C: An Update. Hepatology. April 2009;
4 EXAMES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADO AO DIAGNÓSTICO E MANEJO DA HEPATITE B EXAMES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADO AO DIAGNÓSTICO E MANEJO DA HEPATITE C Exame HBV PCR Quantitativo HBV PCR Qualitativo Teste de Resistência à Lamivudina Exame HCV PCR Quantitativo HCV PCR Qualitativo HCV Genotipagem Indicação Clínica Quantificação do HBV-DNA (carga viral) com o propósito de indicação e monitorização terapêutica. Pesquisa qualitativa do HBV-DNA, com finalidade diagnóstica. Confirmar falência terapêutica, por resistência do HBV ao antiviral Lamivudina (LAM). Indicação Clínica Quantificação do HCV-RNA (carga viral) com o propósito de monitorização da resposta terapêutica. É também aplicável como teste qualitativo. Pesquisa qualitativa do HCV-RNA, para confirmação diagnóstica e monitorização terapêutica. Avaliação do genótipo viral para determinação do prognóstico e do esquema terapêutico. Metodologia Polimerase em Tempo Real (Real Time PCR). Polimerase (PCR). PCR e Fragmentação por Enzimas de Restrição (RFLP) do Gene da DNA- Polimerase. Metodologia Polimerase em Tempo Real (Real Time PCR). Polimerase (PCR). Transcrição reversa, seguida por PCR e fragmentação por enzimas de restrição (RFLP). Plataforma COBAS-AmpliPrep / COBAS-TaqMan (Roche). Própria (in house). Própria (in house). Plataforma COBAS-AmpliPrep / COBAS-TaqMan (Roche). COBAS-Amplicor (Roche). Própria (in house). Características do Exame Técnicas Outras Alta sensibilidade analítica (limite de detecção: 12 UI/ ml). Extensa faixa de linearidade. Alta especificidade. Sistema totalmente automatizado. Tecnologia avançada e bem estabelecida Apresenta grande precisão e reprodutibilidade, sendo utilizada por laboratórios de referência em todo o mundo. Modernos equipamentos e instalações laboratoriais. Confiabilidade do pré-analítico ao pós-analítico. Preço competitivo. Assessoria Médica. Sensibilidade: 100 UI/mL. Técnica qualitativa eficaz e de baixo custo. Assessoria médica para discussões sobre indicação e interpretação do exame. Pesquisa dirigida às três principais mutações, potencialmente emergentes no decorrer do tratamento, incluindo a clássica mutação YMDD. Exame resolutivo para a maioria dos casos de falha terapêutica com o uso da LAM. Assessoria médica para discussões sobre indicação e interpretação do exame. Características do Exame Técnicas Outras Alta sensibilidade analítica (limite de detecção: 15 UI/mL). Extensa faixa de linearidade. Alta especificidade (apresenta menor risco de contaminação e de amplificação inespecífica). Sistema totalmente automatizado. Tecnologia avançada e bem estabelecida. Apresenta grande precisão e reprodutibilidade, sendo utilizada por laboratórios de referência em todo o mundo. Modernos equipamentos e instalações laboratoriais. Confiabilidade do préanalítico ao pós-analítico. Assessoria médica. Sensibilidade: 50 UI/mL. Técnica qualitativa eficaz e de baixo custo. Moderno laboratório. Confiabilidade. Assessoria médica. Determinação do genótipo e do subtipo viral. Permite a detecção dos seis genótipos e dos principais subtipos. Moderno laboratório. Confiabilidade. Assessoria médica.
5 Abordagem terapêutica da hepatite B crônica em pacientes cirróticos virgens de tratamento Hepatite B Crônica Paciente cirrótico HBeAg + Abordagem terapêutica da hepatite B crônica em pacientes não cirróticos virgens de tratamento HBsAg positivo persistente por mais de 6 mêses (pacientes adultos não cirróticos virgens de tratamento Avaliação clínica e laboratorial inicial Biópsia hepática não é obrigatória e deve ser individualizada HBeAg + HBeAg - (encaminhar para transplante se Child B/C) ALT / AST** elevadas? ALT / AST** elevadas? ALT* elevada + * 200 UI/mL Biópsia hepática: A2 F2 *** Biópsia hepática: A2 F2 *** UI/mL Hepatite B Crônica Paciente cirrótico Child-Pugh A Hepatite B Crônica Paciente cirrótico Child-Pugh B ou C Monitoramento clínico-laboratorial ALT* normal + * < 200 UI/mL UI/mL < 200 UI/mL Monitoramento clínico-laboratorial Biópsia hepática: A2 F2 *** 200 e < UI/mL * Alanina aminotransferase ** Carga viral do vírus B realizado por PCR em Tempo Real Ministério da Saúde. Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas para o da Hepatite Viral Crônica B e Coinfecções, Brasília, * HBV-DNA - carga viral do vírus B realizado por PCR em Tempo Real ** ALT: alanina aminotransferase / AST: aspartato aminotransferase *** Classificação Metavir / Sociedade Brasileira de Patologia Ministério da Saúde. Protocolo Clinico e Diretrizes Terapêuticas para o da Hepatite Viral Crônica B e Coinfeccões, Brasília, devem basear-se exclusivamente nos algorítimos. Agosto / 2010 devem basear-se exclusivamente nos algoritmos. Agosto / 2010
6 Abordagem laboratorial da hepatite C - Genótipo 1 Abordagem laboratorial da hepatite C - Genótipos 2 e 3 Anti-HCV positivo HCV-RNA quantitativo (RT-PCR em Tempo Real*) ou PCR qualitativo + Genotipagem (genótipo 1) Anti-HCV positivo Fibrose moderada a intensa (F>1) Biópsia hepática Ausência de fibrose ou fibrose leve (F 1) HCV-RNA quantitativo e genotipagem (genótipo 2 e 3) tratamento com peginterferon + ribavirina Considerar não tratar** Biópsia hepática opcional Resposta Virológica Rápida (RVR) HCV-RNA qualitativo ou quantitativo (RT-PCR em Tempo Real) na 4ª semana*** Resposta Virológica Precoce (RVP) HCV-RNA quantitativo na 12ª semana RVR Probabilidade de Sucesso = 91% com peginterferon + ribavirina Resposta completa Probabilidade de Sucesso (RVS) = 83% Resposta virológica completa (HCV-RNA neg) RVP parcial ( HCV RNA 2 log) RVP parcial ( HCV RNA < 2 log) RVP<2 log Probabilidade de ausência de resposta de > 97% HCV-RNA qualitativo na semana 24 Continuar tratamento até 48 semanas HCV-RNA qualitativo na 24ª semana Suspender tratamento HCV-RNA positivo HCV-RNA indetectável HCV-RNA qualitativo / RT-PCR em Tempo Real na 48ª semana (Resposta do Fim do ) e na 72ª semana (Resposta Virológica Sustentada - RVS) HCV-RNA negativo HCV-RNA detectável HCV RNA indetectável Probabilidade de Sucesso = 45% Falência terapêutica HCV-RNA qualitativo na semana 48 (RVS) * Ensaios de HCV-RNA ultrassensíveis como o RT-PCR em Tempo Real (limite de detecção: 15 UI/mL) podem substituir o HCV-RNA qualitativo. **Qualquer grau de fibrose é indicativo de tratamento nos pacientes co-infectados com o HIV. ***Ausência de RVR tem valor preditivo negativo baixo para RVS e não indica suspensão do tratamento. Adaptado de: Ghany et al. Hepatology, Vol. 49, No. 4, Adaptado de: Ghany et al. Hepatology, vol. 49, No. 4, devem basear-se exclusivamente nos algorítimos. Abril / 2010 devem basear-se exclusivamente nos algoritmos. Abril / 2010
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