DETERMINAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DE CANDIDA SPP A ANIDULAFUNGINA E CASPOFUNGINA PELO MÉTODO DE MICRODILUIÇÃO EM CALDO

Transcrição

1 PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO - FUNDAP Natalia Augusta Barbosa de Freitas DETERMINAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DE CANDIDA SPP A ANIDULAFUNGINA E CASPOFUNGINA PELO MÉTODO DE MICRODILUIÇÃO EM CALDO RIBEIRÃO PRETO 2011

2 PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO FUNDAP Natalia Augusta Barbosa de Freitas DETERMINAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DE CANDIDA SPP A ANIDULAFUNGINA E CASPOFUNGINA PELO MÉTODO DE MICRODILUIÇÃO EM CALDO Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP e FUNDAP, elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo USP/ Departamento de Microbiologia. Área: Microbiologia médica e controle de infecção hospitalar. Orientador: Prof. Dr. Roberto Martinez. Supervisor Titular: Rosa Helena A. R. Gironi. RIBEIRÃO PRETO 2011

3 SUMÁRIO Assunto Página SUMÁRIO... i LISTA DE TABELAS... ii LISTA DE FIGURAS... iii RESUMO... iv 1. INTRODUÇÃO Candidas Candida albicans Candida não albicans Identificação laboratorial Equinocandinas Caspofungina Anidulafungina OBJETIVO MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO... REFERÊNCIAS i

4 Tabela LISTA DE TABELAS 1. Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida albicans à 2. Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida tropicalis à Página Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida glabrata à Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida parapsilosis à 5. Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida haemulonii à Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida guilliermondii à Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida krusei à Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida kefyr, à Anidulafungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida famata, à Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida albicans à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da 16 ii

5 11. Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida tropicalis à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida glabrata à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da 13. Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida parapsilosis à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da 14. Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida haemulonii à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da 15. Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida guilliermondii à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da 16. Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida krusei à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM). 17. Susceptibilidade in vitro de amostras clínicas de Candida à Anidulafungina e Caspofungina, pelo método de microdiluição em caldo. CIM 90 para espécies mais freqüentemente isoladas 18. Sensibilidade in vitro de amostras clínicas de Candida a outros antifúngicos testados pelo método de disco difusão LISTA DE FIGURAS Tabela Página 1. Candida albicans Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida glabrata Candida albicans.- Tubo germinativo. 07 iii

6 RESUMO Determinação da susceptibilidade de Candida spp. a Anidulafungina e Caspofungina pelo método de microdiluição em caldo. FREITAS, N. A. B. Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Laboratório de Microbiologia e Sorologia. O aumento das infecções por Candida spp em pacientes imunocomprometidos vem ganhando importância em razão da crescente resistência à antifúngicos. A toxicidade da anfotericina B e a crescente resistência à azólicos fazem com que as equinocandinas sejam opções terapêuticas. Este trabalho visa determinar a sensibilidade e a concentração inibitória mínima de anidulafungina e caspofungina para diferentes espécies de Candida isoladas de pacientes hospitalizados. Foram avaliados 100 isolados de Candida spp de sangue e urina de pacientes do Hospital das Clinicas da FMRP-USP, no período de março a outubro de Utilizou- se o método de microdiluição em caldo para determinar a concetração inibitória mínima (CIM) da anidulafungina e caspofungina, usando como referência para o desenvolvimento das técnicas o documento M27-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Para a Anidulafungina tivemos uma variação de CIM entre 0,007 µg/ml a 4,0 µg/ml, sendo a CIM 90 de 0,015 µg/ml para Candida albicans, de 0,12 µg/ml para Candida tropicalis, de 0,12 µg/ml para Candida glabrata, e de 2,0 µg/ml para Candida parapsilosis. Para Caspofungina a CIM variou de 0,25 µg/ml a > 4,0 µg/ml, verificando-se CIM 90 de 0,5 µg/ml para Candida albicans, de 2,0 µg/ml para Candida tropicalis, de 1,0 µg/ml para Candida glabrata, e 2,0 µg/ml para Candida parapsilosis. Considerando um breakpoint de 2,0 µg/ml, podemos concluir que a maioria dos isolados mostrou sensibilidade às equinocandidas avaliadas. Contudo, detectou-se resistência, principalmente relacionada com Candida parapsilosis e com caspofungina, inclusive em razão das CIM para esta droga serem mais elevadas do que para anidulafungina. iv

7 1 INTRODUÇÃO As infecções fúngicas em ambiente hospitalar tem aumentado consideravelmente devido ao uso indiscriminado de antimicrobianos de amplo espectro, principalmente em pacientes imunocomprometidos que são submetidos a constantes procedimentos invasivos. A candidemia é a infecção fúngica invasiva com elevado risco de mortalidade, que acomete geralmente pacientes considerados de risco, como os infectados pelo vírus da imunodeficiência humana, os transplantados, neoplásicos e os submetidos a quimioterapia e terapias imunossupressoras. O aumento das infecções por Candida spp nesses pacientes vem ganhando importância em razão da crescente resistência à antifúngicos, enfatizando a necessidade da identificação das espécie e a realização de testes de susceptibilidade antifúngica. A toxicidade da anfotericina B e a crescente resistência à azólicos fazem com que as equinocandinas sejam opções terapêuticas. Primeiro com o uso da caspofungina, e agora também temos a opção da anidulafungina. A anidulafungina é uma equinocandina sintetizada a partir da fermentação do Aspergillus nidulans e tal como a Caspofungina, inibe seletivamente a 1,3-β-D glucana sintase, uma enzima presente nas células fúngicas, um componente estrutural importante da parede celular do fungo, mas que não está presente em células de mamíferos o que diminui os efeitos adversos em seres humanos. E possui uma atividade fungicida eficiente contra espécies de Candida, além de ter uma importante característica farmacocinética porque degrada lentamente no plasma humano através de processos de biotransformação ao invés de ser metabolizada. Este trabalho visa determinar a sensibilidade e a concentração inibitória mínima de anidulafungina e caspofungina para diferentes espécies de Candida isoladas de pacientes hospitalizados no Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto, usando como referencia para o desenvolvimento das técnicas de microdiluição em caldo o documento M27-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 1

8 1.2 CANDIDA A candidíase é considerada uma micose oportunista por ser um fungo de baixa virulência que vive pacificamente com o hospedeiro, mas no caso de um hospedeiro com o sistema imunológico debilitado causa doença. Por isso a maior parte das infecções causadas por Candida são de origem endógena. Mas em ambiente hospitalar também podemos ter a transmissão exógena. A transformação dessa levedura, de comensal a importante agente de infecções, ocorre em ambiente hospitalar devido o surgimento de grande número de procedimentos invasivos, quebrando barreiras de proteção natural, e uso intensivo de antibiótico de amplo espectro.[ Castro, T.L,2006] Os antibióticos intravenosos têm sido associados a infecções por Candida pois as bactérias que normalmente habitam a flora intestinal. Inibem o crescimento de fungos, modificando a flora bacteriana intestinal com o uso de antibióticos sistêmicos, os fungos têm a possibilidade de crescer e invadir tecidos profundos, vasos sanguíneos e linfáticos, resultando em uma candidemia ou doença disseminada. Este gênero compreende 197 espécies, das quais cerca de 20 já foram associadas a processos infecciosos. É uma levedura, que possui propriedade de dimorfismo, exibindo a característica de pseudomicélio em certos ambientes nutricionais Os blastoconídios podem ser globosos, ovóides, cilíndricos ou alongados, raramente triangulares ou ogivais. A reprodução é, em geral, por brotamento multipolar. O pseudomicélio (conjunto de pseudo-hifas) pode ser rudimentar ou bem desenvolvido. Algumas espécies apresentam micélio verdadeiro e somente Candida albicans produz clamidósporos em condições estabelecidas. A cor da colônia pode ser branca ou creme e não há produção de pigmentos carotenóides. A consistência pode variar de cremosa e lisa a rugosa e sulcada. [MENDES-GIANNINI, M.J.S, et. al, 2001] A Candida albicans é a espécie mais comum, mas também encontramos C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. Krusei, C. guilliermondii, C. famata, C.Kefyr e C. haemulonii, C. dubliniensis. 2

9 Candida albicans É a espécie de levedura isolada com maior freqüência, ela faz parte da microbiota de indivíduos sadios, está presente na pele, mucosas e no trato gastrointestinal. Por isso é considerada uma infecção oportunista, pois acomete os indivíduos com o sistema imunológico debilitado. Candida albicans é, sem dúvida alguma, a espécie mais freqüentemente isolada de infecções superficiais e invasivas em diferentes sítios anatômicos e em todas as partes do mundo. Trata-se de levedura com potencial patogênico bastante conhecido, apresentando como principais fatores de patogenicidade e virulência a capacidade de aderência a diferentes mucosas e epitélios, o dimorfismo com produção de estruturas filamentosas que auxiliam a invasão tissular, a termotolerância significativa, e a produção de enzimas como proteinases e fosfolipases. [ Castro, T.L,2006].(Figura 1) Uma importante característica dessa espécie e a produção de clamidósporo em ágar fubá e a formação de tubos germinativos em condições pré estabelecidas. Figura 01- Candida albicans. Fonte: Candida não albicans Nos últimos anos, vem aumentando o número de infecções invasivas causadas por espécies de Candida não albicans, tais como C. tropicalis, C. 3

10 glabrata, C. parapsilosis, C. Krusei, C. guilliermondii, C. famata, C.Kefyr e C. haemulonii, que passaram a ser considerados importantes patôgenos oportunistas. Este fenômeno está ligado de alguma forma ao uso indiscriminado de antifúngicos, que por um processo de seleção, tornaram alguns fungos menos susceptíveis a determinadas drogas..[ Castro, T.L,2006] A Candida parapsilosis é uma das espécies de cândida não albicans mais frequentemente isoladas em culturas de sangue [ GOMES-LOPEZ, et al, 2008]. A C.parapsilosis prolifera-se em soluções contendo glicose, tem capacidade de produzir biofilme e frequentemente coloniza a pele e tem sido associada a casos de candidemia em pacientes internados em unidades de terapia intensiva, com uso prolongado de cateter venoso central.[ Castro, T.L,2006] (figura 2) Figura 02- Candida parapsilosis. Fonte: Candida krusei tem-se mostrado como um patógeno hospitalar ocasional, particularmente, em pacientes portadores de doenças hematológicas malignas e ou submetidos a transplante de medula óssea. Alguns autores relataram aumento da ocorrência de fungemias causadas por C. krusei em pacientes neutropênicos expostos prolongadamente a fluconazol. Esta levedura é naturalmente resistente ao fluconazol e talvez isso explique o aumento em pacientes neutropênicos expostos a este antifúngico. [SILVA V, et al, 2002]. A Candida tropicalis, surgiu como um fungo oportunista potencialmente perigoso. Isto pode ser devido, tanto a um aumento do reconhecimento e 4

11 identificação específica da C. tropicalis como um agente etiológico da infecção, como a um aumento do numero de pacientes imunocomprometidos susceptíveis ao ataque de fungos oportunistas. Esta levedura é comum como comensal, mas sob certas condições demonstrou causar significativa morbidade e mortalidade e tem sido descrito como um patógeno importante em paciente imunocomprometidos. [BARCHIESI, et al, 2000] (figura 3). Figura 03- Candida tropicalis. Fonte: Candida glabrata tem ganhado significado pelo crescente numero de infecções sistêmicas causadas por essa espécie e o fato de desenvolverem rapidamente resistência aos azóis, e a alta taxa de mortalidade por candidemia por C. glabrata. [SANGUINETTI, et al, 2005] (Figura 4) Figura 04- Candida glabrata. Fonte: IDENTIFICAÇÃO LABORATORIAL Candidas spp são facilmente identificadas pelos métodos convencionais que dependem de uma combinação de características morfológicas, bem como 5

12 a capacidade dos organismos selecionados para fermentar determinadas fontes de açúcares ou assimilar uma variedade de compostos de carbonos e nitrogênios [BORMAN, et al 2008] O diagnóstico da candidíase é feito através do exame direto do espécime clinico. A verificação da forma invasiva do fungo, que são hifas com células leveduriformes, em material de biópsia ou raspado das lesões, fundamenta o diagnóstico da candidíase. As hifas são septadas, com septos espaçados: próximo as septos aparecem as células leveduriformes que podem ser arredondadas ou ovaladas. [TRABULSI,et al, 2004] As diferentes espécies de Candida podem ser isoladas em ágar Sabouraud glicose desenvolvendo-se como colônias cremosas, de cor creme, formadas por elementos leveduriformes, ovais ou arredondadas. Pseudo-hifas podem se desenvolver. [TRABULSI,et al, 2004] As amostras de urina devem ser semeadas em placa Sabouraud com o auxilio de uma alça bacteriológica estéril de 10 µl. Devem ser semeadas em 4 campos sobrepostos, incubar a 35 C por até 72 horas. As amostras de sangue devem ser semeadas com auxilio de pipetas estéreis e agulhas descartáveis em 2 tubos de Ágar Sabouraud, incubar à 35 C por até 30 dias, sendo monitoradas para caso haja crescimento serem devidamente identificada quanto ao gênero e espécie. A identificação de Candida albicans pode ser obtida pela formação de tubo germinativo em soro fetal bovino após incubação a 35 C, por 2 horas, ou pela produção de clamidósporos em meio ágar fubá à temperatura ambiente. Para realização da prova do tubo germinativo é necessário suspender um fragmento de uma colônia bem isolada da levedura em estudo em 0,5 ml de soro de fetal bovino e incubar a a 35 C por 2 horas, após incubação coloca uma gota da suspensão em uma lâmina, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio a presença de tubos germinativos. O tubo germinativo é definido como uma extensão filamentosa de uma célula de levedura cuja largura é cerca da metade e o comprimento ao redor de três a quatro vezes o diâmetro da célula mãe. O verdadeiro tubo germinativo não apresenta constrição no ponto de origem. [KONEMAN, E. W, et al, 2001] (Figura 5) 6

13 Figura 05- Candida albicans. Fonte: ttp:// A classificação das espécies de candida baseia-se em provas fisiológicas de assimilação de fontes de carbonos e de nitrogênio e de fermentação de açúcares. Atualmente existem no mercado métodos automatizados para o diagnóstico mais rápido e antifugigrama. No entanto, esses métodos devem ser usados criticamente, e com interpretação adequada. No caso do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, além do método convencional também é usado o automatizado para identificação de leveduras, o VITEK 2 da Bio-Mérieux. 1.4 EQUINOCANDINAS Os antifúngicos podem ser agrupados em quatro classes de acordo com o seu modo de ação: os polienos, que atuam e promovem alterações ao nível da membrana fúngica, e de que fazem parte a anfotericina B e as suas formulações lipídicas; os derivados dos azoles, os quais inibem a síntese do ergoesterol (principal componente da membrana celular fúngica), sendo exemplos o fluconazol, voriconazole e mais recentemente o posaconazole; os análogos das pirimidinas que atuam por inibição da síntese de DNA e RNA, onde se encontra inserida a 5-fluorocitosina (5-FC); e as equinocandinas de que fazem parte a caspofungina, anidulafungina e micafungina.[cunha, A. et al,2011] As equinocandinas inibem a síntese do 1,3-β-D-glucano, componente essencial da parede celular fúngica. E apresentam excelente atividade fungicida in vitro e in vivo contra espécies de Candida. Em geral cepas com 7

14 concentração inibitória mínima 2,0 µg/ml são consideradas sensíveis.[sharon C.-A.CHEN,et al, 2011] Seu mecanismo de ação consiste na inibição não competitivo da sintase de 1,3-β-D-glucano e em menor grau da 1,6-β-D-glucano sintase, um complexo enzimático dentro da parede celular do fungo. A alteração nesta parede faz com que o fungo perca a estabilidade osmótica, resultando em lise celular.[alexis D. P, 2004] CASPOFUNGINA A capofungina foi o primeiro antifúngico inibidor da síntese de glucano a receber aprovação da FDA (United States Food and Drug Administration), é eficaz para o tratamento de candidíase da mucosa e invasiva e aspergilose invasiva, comercializado como Cancidas pela Merck. Contém como ingrediente ativo o acetato de caspofungina, que é quimicamente descrito como o sal do diacetato de pneumocandina B0.[ DERESINSKI S C, et al, 2003] O acetato de caspofungina, inibe a síntese do ß(1,3)-D-glucana, um componente essencial da parede celular de muitos fungos filamentosos e leveduras que não faz parte das células dos mamíferos. As concentrações plasmáticas da caspofungina declinam de maneira polifásica após infusões intravenosas únicas de 1 hora. Uma fase-troca curta ocorre imediatamente após a infusão, seguida de uma fase-ß com uma meia-vida de 9 a 11 horas que caracteriza grande parte do perfil e apresenta claro comportamento loglinear de 6 a 48 horas após a dose, durante as quais a concentração plasmática diminui por uma ordem de magnitude; uma fase-troca adicional também ocorre (meia-vida de horas). A distribuição, e não a excreção ou a biotransformação, constitui o mecanismo dominante que influencia a depuração plasmática. A caspofungina liga-se extensamente à albumina e a distribuição nos eritrócitos é mínima. Os resultados do equilíbrio de massa mostraram que aproximadamente 92% da radioatividade administrada foi distribuída nos tecidos 36 a 48 horas após uma dose única de 70 mg de acetato de [ 3 H] caspofungina. Ocorre pouca excreção ou biotransformação da caspofungina durante as primeiras 30 horas após a administração. [ DERESINSKI S C, et al, 2003] A caspofungina é lentamente metabolizada por hidrólise e N-acetilação. 8

15 A caspofungina sofre também degradação química espontânea para um composto peptídico de anel aberto. O metabolismo adicional envolve a hidrólise em aminoácidos constitutivos e seus derivados, incluindo a diidroxihomotirosina e a N-acetil-diidroxihomotirosina; esses dois derivados da tirosina são encontrados apenas na urina, sugerindo rápida depuração plasmática desses derivados pelos rins. [ DERESINSKI S C, et al, 2003] Foram conduzidos dois estudos farmacocinéticos com uma dose única do antifúngico radio marcado. No primeiro estudo, foram colhidos plasma, urina e fezes durante 27 dias, enquanto, no segundo estudo, foi colhido plasma durante 6 meses. Aproximadamente 75 da radioatividade foi recuperada: 41 na urina e 34 nas fezes. As concentrações plasmáticas da radioatividade e da caspofungina foram similares durante as primeiras 24 a 48 horas após a dose; a seguir, os níveis do medicamento caíram mais rapidamente. No plasma, as concentrações da caspofungina caíram abaixo do limite de quantificação 6 a 8 dias após a dose, enquanto o nível de radioatividade caiu abaixo do limite de quantificação 22,3 semanas após a dose. Uma pequena quantidade de caspofungina é excretada inalterada na urina (aproximadamente 1,4 da dose) e a depuração renal da medicação original é baixa (aproximadamente 0,15 ml/min). [ DERESINSKI S C, et al, 2003] ANIDULAFUNGINA A anidulafungina é uma equinocandina sintetizada a partir da fermentação do Aspergillus nidulans e tal como a Caspofungina, inibe seletivamente a 1,3-β-D glucana sintase, uma enzima presente nas células fúngicas, um componente estrutural importante da parede celular do fungo, mas que não está presente em células de mamíferos o que diminui os efeitos adversos em seres humanos. E possui uma atividade fungicida eficiente contra espécies de Candida, além de possuir uma importante característica farmacocinética porque degrada lentamente no plasma humano através de processos de biotransformação ao invés de ser metabolizada. [DENNING D.W,2003] 9

16 Sua atividade não é afetada pela resistência a outras classes de agentes antifúngicos, fluconazol em particular. Anidulafungina tem potente em atividade fungicida in vitro contra uma ampla gama de espécies de Candida, incluindo C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, Candida famata, Candida rugosa e Candida stellatoidea e também é eficaz contra espécies de Candida que são intrinsecamente resistentes a azóis (Candida krusei). [JOHNSON E M et al, 2004] 2 OBJETIVO Este trabalho visou determinar a sensibilidade e a concentração inibitória mínima de Anidulafungina e Caspofungina pelo método de microdiluição em caldo, conforme o documento M27-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), para diferentes espécies de Candida isodadas de pacientes hospitalizados. 3 MATERIAIS E MÉTODOS Foram avaliados 100 isolados de Candida spp de sangue (N= 39) e urina (N=61) de pacientes do Hospital das Clinicas da FMRP-USP, no período de março a outubro de Utilizou- se o método de microdiluição em caldo para determinar a concetração inibitória mínima (CIM) da anidulafungina e caspofungina, usando como referência para o desenvolvimento das técnicas o documento M27-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). As culturas de Candida foram devidamente identificadas pelos métodos convencionais, características morfológicas, capacidade dos organismos fermentarem determinadas fontes de açucares ou assimilar uma variedade de compostos de carbonos e nitrogênios. Foram realizados subculturas das culturas 24 horas antes de cada procedimento, desses repiques foram realizados inóculos em 3,0 ml de salina estéril, com concentração de 1,00. A Anidulafungina obtida através do medicamento Ecalta da Pfizer que foi devidamente pesada em balança analítica para obtenção Anidulafungina. A Caspofungina obtida através do medicamento Cancidas da Merck. As drogas 10

17 foram diluídas de 1:1 em água destilada estéril em 10 diluições seriadas. Do inóculo obtido realizamos uma diluição de 1:5 em meio RPMI. Na placa de microdiluição colocamos um controle positivo e um negativo para a ATCC (22019) e para cada isolado. No poço do controle positivo pipetamos 50,0µL de água destilada estéril, 100,0µL de meio RPMI e 5,0µL do inoculo. Os controles negativos foram preparados com 50,0µL da droga, 100,0µL de meio RPMI e 5,0µL de água destilada. Nos poços pré determinados para cada isolado colocamos 50,0µL de cada diluição da droga partindo da mais concentrada para mais diluída, acrescentamos 100,0µL do meio RPMI e 5,0µL do inoculo. Em cada placa colocamos um poço branco, que contém somente o meio RPMI este padroniza a leitura no fotômetro. Todas as placas foram realizadas em duplicatas. Após 48 horas de incubação em estufa a 35 C realizamos a leitura no fotômetro Multiskan MS e leitura macroscópica de acordo com o documento M27-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Adotamos como critério para determinação da CIM a menor concentração da droga que inibe 50% do crescimento de Candida spp. em relação ao poço do controle positivo. 4 RESULTADOS. Para a anidulafungina tivemos uma variação de CIM entre 0,007 µg/ml a 4,0 µg/ml. E para caspofungina houve uma variação de 0,25 µg/ml a > 4,0 µg/ml. para as espécies mais comuns. Para as espécies infrequentes tivemos uma variação de CIM entre 0,06 µg/ml a 0,50 µg/ml para anidulafungina e de 0,25 µg/ml a 4,0 µg/ml para a caspofungina. As tabelas 1 a 16 mostram os valores de CIM para isolados de cada espécie de Candida. A tabela 17 mostra os valores de CIM 90 de Anidulafungina e de Caspofungina para as quatro espécies mais comumente isoladas do sangue e da urina dos pacientes. 11

18 Demostramos abaixo os CIM encontrados para cada isolado: Tabela 01 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida albicans à Candida albicans Anidulafungina 1 0, , ,06 6 0,03 7 0,12 8 <0, , , , , ,0 35 0, , , , , , , ,03 45 <0, <0, , ,03 50 <0, , , , , , ,015 12

19 70 0, , , , , , ,0 81 0, , , , , , , ,06 Tabela 02 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida tropicalis à Candida tropicalis Anidulafungina 3 0,25 4 0, , , , , , , , , , , , ,015 13

20 72 0, ,5 82 0, , ,12 Tabela 03 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida glabrata à Candida glabrata Anidulafungina 9 0, , , , , , , , , , , , , ,0 Tabela 04 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida parapsilosis à Candida parapsilosis Anidulafungina 17 1,0 26 2,0 28 2,0 14

21 29 0,5 30 1,0 31 2,0 33 1,0 46 2,0 52 2,0 66 0, ,0 94 2,0 95 1, ,0 Tabela 05 - Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida haemulonii à Candida haemulonii Anidulafungina 27 0,25 Tabela 06 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida guilliermondii à Candidas guilliermondii Anidulafungina 38 4,0 62 0,12 Tabela 07 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida krusei à Candidas krusei Anidulafungina 60 0, ,12 15

22 Tabela 08 - Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida kefyr, à Candidas kefyr Anidulafungina 63 0,06 Tabela 09 - Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida famata, à Candidas famata Anidulafungina 71 0,5 Tabela 10 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida albicans à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Candida albicans Caspofungina 1 0,5 2 0,5 5 2,0 6 0,25 7 1,0 8 0, ,5 22 1,0 23 1,0 25 2,0 32 4,0 35 0, ,5 37 0, ,25 16

23 41 0, , ,5 44 1,0 45 0, ,5 48 0,5 49 0,5 50 0,5 53 2,0 54 1,0 56 0,5 57 2,0 61 0,5 64 1,0 70 1,0 73 0,5 75 0,5 76 0,5 77 0,5 78 0,5 80 4,0 81 1,0 83 0,5 84 0,5 85 0,5 93 0,5 96 2,0 97 2,0 98 1,0 17

24 Tabela 11 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida tropicalis à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Candida tropicalis Caspofungina 3 4,0 4 4,0 10 2,0 11 2,0 12 2,0 13 2,0 14 2,0 15 2,0 16 1,0 51 1,0 55 2,0 59 2,0 65 1,0 68 1,0 72 1,0 79 2,0 82 2,0 87 2,0 89 2,0 Tabela 12 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida glabrata à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Candida glabrata Caspofungina 9 0,5 18 0,5 19 0,5 20 0,5 24 2,0 18

25 34 0,5 40 0,5 58 1,0 67 1,0 74 1,0 88 1,0 90 1,0 91 2,0 99 4,0 Tabela 13 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida parapsilosis à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Candida parapsilosis Caspofungina 17 4,0 26 >4,0 28 >4,0 29 1,0 30 2,0 31 4,0 33 2,0 46 4,0 52 0,5 66 2,0 92 2,0 94 4,0 95 2, ,0 19

26 Tabela 14 - Susceptibilidade in vitro de amostra de Candida haemulonii à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Candida haemulonii Caspofungina 27 4,0 Tabela 15 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida guilliermondii à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Candidas guilliermondii Caspofungina 38 2,0 62 0,5 Tabela 16 - Susceptibilidade in vitro de amostras de Candida krusei à Caspofungina, pelo método de diluição em caldo. Determinação da Candidas krusei Caspofungina 60 1,0 69 1,0 Tabela 17 - Susceptibilidade in vitro de amostras clínicas de Candida à Anidulafungina e Caspofungina, pelo método de microdiluição em caldo. CIM 90 para espécies mais freqüentemente isoladas. Espécies de CIM 90 (µg/ml) de CIM 90 (µg/ml) de Candida n Anidulafungina Caspofungina Candida albicans 45 0, 015 µg/ml 0,5 µg/ml Candida tropicalis 19 0,12µg/ml 2,0 µg/ml Candida glabata 14 0,12µg/ml 1,0µg/ml Candida parapsilosis 14 2,0µg/ml 2,0 µg/ml Tabela 18 Sensibilidade in vitro de amostras clínicas de Candida a outros antifúngicos testados pelo método de disco difusão. 20

27 Antifúngico Porcentagem de Porcentagem de Testado Amostras sensíveis Amostras resistentes Anfotericina B 99% 1% Itraconazol 96% 4% Fluconazol 94% 6% Com relação as amostras resistentes a esses antifúngicos testados por disco difusão, somente uma apresentou resistência a caspofungina, as demais apresentaram sensibilidade em in vitro a caspofungina e anidulafungina pelo método de microdiluição em caldo. 5 DISCUSSÃO Em geral os isolados tiveram CIM s baixos para Anidulafungina, exceto isolados de C. parapsilosis que apresentaram CIM s mais altos, com um CIM 90 de 2,0 µg/ml, mais ainda sensíveis visto que o breakpoint é de 2,0 µg/ml. Os CIM para Anidulafungina tiveram uma variação de 0,007 µg/ml a 4,0 µg/ml, sendo a CIM 90 de 0,015 µg/ml para Candida albicans, de 0,12 µg/ml para Candida tropicalis, de 0,12 µg/ml para Candida glabrata, e de 2,0 µg/ml para Candida parapsilosis. Para Caspofungina houve uma variação de 0,25 µg/ml a > 4,0 µg/ml, verificando-se CIM 90 de 0,5 µg/ml para Candida albicans, de 2,0 µg/ml para Candida tropicalis, de 1,0 µg/ml para Candida glabrata, e 2,0 µg/ml para Candida parapsilosis. Portanto, as CIM s da caspofungina foram mais elevadas do que as da anidulafungina. Em um estudo realizado no Chile (Universidad Mayor,Santiago), com 100 amostras de Candida e utilizando o mesmo método deste estudo eles encontraram CIM 90 de 0,06 para Candida albicans, de 0,25 µg/ml para Candida tropicalis, de 0,25 µg/ml para Candida glabrata, e 2,0 µg/ml para Candida parapsilosis para Anidulafungina.[ Alburquenque, C. O, 2011] Em outro estudo realizado no centro de Doenças Infecciosas e Microbiologia, do Hospital da Universidade de Sydney, Austrália comparando as atividades das equinocandinas obtiveram CIM 90 de 0,06 para Candida 21

28 albicans, de 0,06 µg/ml para Candida tropicalis, de 0,06 µg/ml para Candida glabrata, e 1,0 µg/ml para Candida parapsilosis para Anidulafungina. Para Caspofungina CIM 90 de 0,06 para Candida albicans, de 0,06 µg/ml para Candida tropicalis, de 0,12 µg/ml para Candida glabrata, e 2,0 µg/ml para Candida parapsilosis. [SHARON C.-A.CHEN,et al, 2011] Considerando os estudos já existente de microdiluição em caldo para as equinocandinas em questão, observamos que os resultados de CIM s obtidos são coerentes com resultado obtidos em outros centros médicos, incluindo as CIM s mais elevadas para caspofungina e para C. parapsilosis. Apesar de usadas regularmente há vários anos na instituição onde foi realizado este estudo, Anfotericina B, Itraconazol e Fluconazol mantêm atividade in vitro contra a grande maioria dos isolados de Candida. Causa preocupação a resistência à fluconazol cerca de 6%, prevendo falha desta medicação em pacientes críticos com candidemia ou infecção em outros sítios. O antifugígrama pode orientar o uso de equinocandinas nestes casos. 6 CONCLUSÃO Considerando um breakpoint de 2,0 µg/ml, podemos concluir que a maioria dos isolados mostrou sensibilidade às equinocandinas avaliadas. Contudo, detectou-se resistência, principalmente relacionada com Candida parapsilosis e com caspofungina, inclusive em razão das CIM para esta droga serem em geral mais elevadas do que para anidulafungina. As equinocandinas tem demonstrado ser importantes opções terapêutica para infecções fúngicas invasivas, como as candidemias. 22

29 6 REFERÊNCIAS 1. ALBUQUERQUE, C. O; SILVA, V. A; FUENTES, M. G; TAPIA C. C;SILVA, V. V; Susceptibilidad in vitro a anidulafungina en 100 cepas de especies de Candida aisladas prévio a la introducción de esta equinocandina en Chile. Rev Chil Infect 2011; 28 (5): BARCHIESI, F; SCHMIZZI A.M; FOTHERGILL A. W; In vitro activity of the new echinocandin antifungal, MK-0991, against common and uncommon clinical isolates of Candida species. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999; 18: BORMAN, A. M. Petch; R. Linton, C.J; Palmer, M. D. Brigde; P.D Johnson, E.M. Candida nivariensis, an emersing pathogenic fungus with multidrugs resistence to antifungal agents. Journal of clinical Microbiology, 2008, 46, (3), pp CASTRO, T L. COUTINHO, H D M. GEDEON, C C. SANTOS, J M. SANTANA, W J. SOUZA, L B S. Mecanismos de resistência da Candida sp a antifúngicos Infarma v CHEN S C A. SLAVIN M A. SORREL T C. Echinocandin Antifungal Drugs in Fungal Infections. Drugs 2011; 71 (1): CUNHA, A. TELLES F Q. RIBEIRO J. Antifúngicos e infecções fúngicas DENNING D W. Echinocandin antifungal drugs. Lancet 2003; 362: DERESINSKI S C. STEVENS D A. Caspofungin. Clinical Infectious Diseases 2003; 36: GOMEZ-LOPEZ, A. ALASTRUEY-IZQUIERDO, A; Prevalence and Susceptibility Profile of Candida metapsilosis and Candida orthopsilosis: Results from Population-Based Surveillance of Candidemia in Spain. Antimicrobial Agentes Chemotherapy, v.52 p JOHNSON E M, GOLDSTEIN B P, DAVEY K G, FRASER M A. Comparison of the in vitro activity of anidulafungin with amphotericin B, caspofungin,fluconazole, itraconazole and voriconazole against a panel of 780 yeasts obtained from five European centres [poster 513]. In: Program and abstracts of the 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Prague). Basel, Switzerland: European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,

30 11. KONEMAN, E. W; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M; SCHRECKENBERGER, P. C; WINN, W.C.JR. Diagnóstico Microbiológico: 5 ed. Guanabara koogan, p MENDES-GIANNINI, M.J.S.; MELHEM, M.S.C. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes.: 2 ed. Guanabara Koogan, p NCCLS. Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade a Terapia Antifúngica das Leveduras; Norma Aprovada Segunda Edição. NCCLS document M27-A2 [ISBN ]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania Estados Unidos, SILVA V.; M CRISTINA DÍAZ J.; NALDY FEBRÉ Y. Red De Diagnóstico En Micología Médica.Vigilancia De La Resistencia De Leveduras A Antifúngicos. Rev. Chil. Infectol. Santiago v.19 Supl TRABULSI, L R. ALTERTHUM F. Microbiologia : 4ª ed Atheneu, p VASQUEZ J A, SOBEL J D. Anidulafungin: a novel Echinocandin. Clinical Infectious Diseases 2006; 43: