UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de pós-graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Produção e Controle Farmacêuticos Investigação da influência da velocidade de liberação do fármaco metoprolol a partir da forma farmacêutica sobre seu processo de absorção e de seus enantiômeros Francinalva Dantas de Medeiros Tese para obtenção do grau de Doutor Orientadora: Profa Dra Valentina Porta São Paulo, 2013

2 Francinalva Dantas de Medeiros Investigação da influência da velocidade de liberação do fármaco metoprolol a partir da forma farmacêutica sobre seu processo de absorção e de seus enantiômeros Comissão Julgadora da Tese para a obtenção do grau de Doutor Profa Dra Valentina Porta Profa Dra Jacqueline de Souza Profa Dra Samanta Cardozo Mourão Prof Dr José Eduardo Gonçalves Prof Dr José Carlos Saraiva Gonçalves São Paulo, 2013

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4 "Tenho duas armas para lutar contra o desespero, a tristeza e até a morte: o riso a cavalo e o galope do sonho. É com isso que enfrento essa dura e fascinante tarefa de viver." Ariano Suassuna

5 Agradecimentos À Profa. Dra. Valentina Porta, pela orientação e apoio neste trabalho; À banca examinadora, pelas contribuições e tempo dedicado à avaliação do trabalho; À Capes pela concessão da bolsa; À FAPESP pelo financiamento do projeto; À Coordenação, professores e funcionários do Programa de Pós-graduação em Fármaco e Medicamentos; Ao Hospital Universitário, pela disponibilização da área para realização do estudo clínico, e aos funcionários envolvidos; Aos coletores Alessandro e Vanessa, pelo carinho e dedicação; Aos vonluntários pela disponibilidade e carinho; Aos colegas do antigo Biofar, Eunice Kano, Eunice Emiko, Simone, Val e Eremita, pelos ensinamentos e pela amizade; À aluna de iniciação cientifíca Nathalia por toda ajuda e amizade; Aos amigos amigos do LPB, Marina, Caio, Michelle, Rafael Paraíso, Rafael Melo, Mônica, João, Juliana Barbosa, pela grande ajuda e amizade; À Michele Issa, pela ajuda com a análise estatística; Aos colegas de trabalho e melhores amigos que uma pessoa poderia desejar, José Eduardo, Guilherme, Marc, Marina, Rafael Paraíso, Rafael Melo, Mariane, Michelle, Karin, por todo amor e companheirismo;

6 Aos almoços inesquecíveis com José Eduardo, Guilherme e Marc; Às amadas amigas sempre presentes na minha vida, Izabelle, Sâmia, e Tássia, por todas as gargalhadas, lágrimas e amor dedicado; Aos amigos, Vanessa, Daniel, Rafael, Bruno, Wallace, Geraldo, Aline, Torres, pelo incentivo; A Linus, pela fofura; Aos sempre companheiros, Deusia, Elthon, Lidiane, Carol, Fernanda, Diogo, Milena, e a todos os demais amigos que sempre estiveram presentes na minha vida, com compreensão e me dando grandes alegrias; Aos meus professores e amigos da UFPB; Ao meu orientador do mestrado Prof. Dr. Eduardo, por todas as orientações e amizade; À minha irmã Neneide, e meus sobrinhos Renathinho e Rogerinho pelo carinho; Aos meus amados pais Francisca e José Calixto, pela confiança, compreensão pela ausência e amor dedicado; A Deus, pela luz e pela sombra.

7 Sumário Página Lista de figuras Lista de quadros Lista de tabelas Lista de abreviaturas Resumo Abstract I IV V XII XIV XV 1. Introdução 1 2. Revisão da literatura Ensaios de bioequivalência para medicamentos contendo fármacos racêmicos Metoprolol Métodos enantioméricos de quantificação de fármacos Objetivos Objetivos específicos Materiais e Métodos Materiais Substância química padronizada Medicamento Reagentes e solventes Equipamentos Materiais 27

8 4.2 Métodos Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação de (R,S) metoprolol em plasma humano Preparo da solução estoque padrão e soluções de trabalho padrão de metoprolol Preparo de amostras de plasma padrão da curva de calibração Preparo das soluções de trabalho padrão de controle de qualidade Preparo de amostras de plasma de controle de qualidade Tratamento das amostras de plasma para quantificação de metoprolol Condições cromatográficas para quantificação (R,S)-metoprolol em plasma humano Validação do método para quantificação de (R,S)-metoprolol em plasma humano Especificidade Recuperação Limite de Quantificação Linearidade Precisão Exatidão Estabilidade Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento Estabilidade de curta duração Estabilidade pós-processamento 40

9 Estabilidade das soluções padrão de trabalho Quantificação de (R,S)-metoprolol nas amostras de plasma humano Desenvolvimento e validação de método bioanalítico quiral para quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma humano Preparo das soluções estoque padrão e soluções de trabalho padrão dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol Preparo de amostras de plasma padrão da curva de calibração dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol Tratamento das amostras de plasma para quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol Condições cromatográficas para quantificação dos enatiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma humano Validação do método enantioseletivo para quantificação de (R)- metoprolol e (S)-metoprolol em plasma Quantificação de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol nas amostras de plasma dos voluntários Ensaios de Biodisponibilidade Administração do medicamento Casuística Procedimento do ensaio de biodisponibilidade Delineamento do estudo Local, forma de internação dos voluntários e alimentação Coleta, processamento e armazenamento das amostras Avaliação da Biodisponibilidade 51

10 Analise estatística Resultados Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação de (R,S)-metoprolol em plasma humano Especificidade Recuperação Limite de Quantificação Linearidade Precisão Exatidão Estabilidade Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento Estabilidade de curta duração Estabilidade pós-processamento Estabilidade das soluções padrão Quantificação de (R,S)-metoprolol em amostras de plasma humano Concentrações plasmáticas médias de (R,S)-metoprolol Curvas médias de decaimento plasmático versus tempo para (R,S)-metoprolol Parâmetros farmacocinéticos para o (R,S)-metoprolol Parâmetros farmacocinéticos para o (R,S)-metoprolol Desenvolvimento e validação de método quiral para quantificação 72

11 de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma humano Especificidade Recuperação Limite de Quantificação Linearidade Precisão Exatidão Estabilidade Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento Estabilidade de curta duração Estabilidade pós-processamento Estabilidade das soluções padrão Quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em amostras de plasma humano Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol e (S)- metoprolol Curvas médias de decaimento plasmático versus tempo para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol Parâmetros farmacocinéticos para os enantiômeros (R)- metoprolol e (S)-metoprolol 5.5 Análise comparativa dos parâmetros farmacocinéticos de (R,S)- metoprolol e seus enantiômeros Análise estatística 105

12 6. Discussão Conclusões Referências bibliográficas 132 Anexos 139

13 I Lista de Figuras Página Figura 1 Algoritmo de decisão para avaliação da necessidade de emprego ou não de métodos estereosseletivos de quantificação de fármacos em ensaios de bioequivalência. 8 Figura 2 Estrutura do fármaco metoprolol e seus enantiômeros. 13 Figura 3 Cromatograma referente a amostra de plasma branco. 55 Figura 4 Cromatograma referente a amostra de plasma fortificada com os padrões de metoprolol (8 min) e ofloxacino (4 min). Figura.5 Curva de calibração do metoprolol total em plasma na faixa de concentração de 5 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Cada valor representa uma média de seis determinações. Figura 6 Curva média de concentração plasmática do metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. Figura 7 Curva média de concentração plasmática do metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Figura 8 Curva média de concentração plasmática do metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Figura 9: Cromatograma referente a amostra de plasma branco, obtida por método quiral. Figura 10 Cromatograma referente a separação quiral, mostrando (R)- metoprolol em 6,0 minutos e (S)-metoprolol em 8,0 minutos. Figura.11 Curva de calibração para o (R)-metoprolol em plasma na faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Cada valor representa uma média de seis determinações Figura.12 Curva de calibração para o (S)-metoprolol em plasma na 76

14 II faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Cada valor representa uma média de seis determinações. Figura 13 Curva média de concentração plasmática de (R)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. Figura 14 Curva média de concentração plasmática de (S)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. Figura 15 Curva média de concentração plasmática de (R)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Figura 16 Curva média de concentração plasmática de (S)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Figura 17 Curva média de concentração plasmática de (R)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Figura 18 Curva média de concentração plasmática de (S)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Figura 19 Curva média de concentração plasmática em função do tempo para (R,S) metoprolol e seus enantiômeros na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. Figura 20 Curva média de concentração plasmática em função do tempo para (R,S) metoprolol e seus enantiômeros na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Figura 21 Curva média de concentração plasmática em função do tempo para (R,S) metoprolol e seus enantiômeros na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a

15 III voluntários sadios. Figura 22 Gráfico de Cmax em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico, para (R,S) metoprolol, com intervalo de confiança de 0,95. Figura 23 Gráfico de Cmax em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico, para (R)- metoprolol, com intervalo de confiança de 0,95. Figura 24 Gráfico de Cmax em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico, para (S)- metoprolol, com intervalo de confiança de 0,95. Figura 25 Gráfico de Cmax em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico, para as razões entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol e seu enantiômero (R)-metoprolol (R,S/R), com intervalo de confiança de 0,95. Figura 26 Gráfico de Cmax em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico, para as razões entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol e seu enantiômero (S)-metoprolol (R,S/S), com intervalo de confiança de 0,

16 IV Lista de Quadros Quadro 1: Parâmetros farmacocinéticos dos enantiômeros do metoprolol após a administração do racemato. Página 16 Quadro 2: Preparo das soluções de trabalho padrão de metoprolol. 31 Quadro 3: Preparo das amostras de plasma padrão da curva de calibração 32 Quadro 4: Preparo das soluções de trabalho padrão de metoprolol. 32 Quadro 5: Preparo das amostras de plasma de controle de qualidade 33 Quadro 6: Preparo das soluções de trabalho padrão de (R)- metoprolol e S metoprolol. Quadro 7: Preparo das amostras de plasma padrão da curva de calibração para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol. Quadro 8 Características dos voluntários que concluíram a etapa clínica para o estudo clínico

17 V Lista de Tabelas Página Tabela.1 Recuperação média de processo de purificação das amostras de plasma para metoprolol. Cada valor representa a média de seis determinações Tabela 2 Parâmetros relativos a curva de calibração do método bioanalítico para quantificação de metoprolol total em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência na faixa de concentração de 5 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Tabela 3 Precisão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação de metoprolol total em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de determinações para precisão intra-dia e para inter-dias. Tabela 4 Exatidão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação de metoprolol total em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de seis determinações para exatidão intra-dia e dezoito determinações para inter-dias. Tabela 5 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após um ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 1). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 6 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após dois ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 2). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 7 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após três ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 3). Cada resultado representa a média de três determinações Tabela 8 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade submetidas ao processo de purificação imediatamente após o preparo (tempo 0h) e submetidas ao processo de purificação 4 horas após o descongelamento (tempo 4h). Cada resultado representa a média de três determinações

18 VI Tabela 9 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o processo de purificação (tempo 0h) e 24h após o processo de purificação. Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 10 Concentrações plasmáticas médias do metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 11 Concentrações plasmáticas médias do metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 12 Concentrações plasmáticas médias do metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 13 Parâmetros farmacocinéticos para o metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela 14 Parâmetros farmacocinéticos para o metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela 15 Parâmetros farmacocinéticos para o metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela.16 Recuperação média de processo de purificação das amostras de plasma para o enantiômero (R)-metoprolol. Cada valor representa a média de seis determinações Tabela.17 Recuperação média de processo de purificação das amostras de plasma para o enantiômero (S)-metoprolol. Cada valor representa a média de seis determinações Tabela 18 Parâmetros relativos a curva de calibração do método 75

19 VII bioanalítico para quantificação do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência na faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Tabela 19 Parâmetros relativos a curva de calibração do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência na faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Tabela 20 Precisão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de determinações para precisão intra-dia e para inter-dias. Tabela 21 Precisão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de determinações para precisão intra-dia e para inter-dias. Tabela 22 Exatidão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de seis determinações para exatidão intra-dia e dezoito determinações para inter-dias. Tabela 23 Exatidão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de seis determinações para exatidão intra-dia e dezoito determinações para inter-dias. Tabela 24 Estabilidade do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após um ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 1). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 25 Estabilidade do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após dois ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 2). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 26 Estabilidade do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após três ciclo de

20 VIII congelamento/descongelamento (ciclo 3). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 27 Estabilidade do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após um ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 1). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 28 Estabilidade do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após dois ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 2). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 29 Estabilidade do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após três ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 3). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 30 Estabilidade do (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade submetidas ao processo de purificação imediatamente após o preparo (tempo 0h) e submetidas ao processo de purificação 4 horas após o descongelamento (tempo 4h). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 31 Estabilidade do (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade submetidas ao processo de purificação imediatamente após o preparo (tempo 0h) e submetidas ao processo de purificação 4 horas após o descongelamento (tempo 4h). Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 32 Estabilidade do (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o processo de purificação (tempo 0h) e 24h após o processo de purificação. Cada resultado representa a média de três determinações Tabela 33 Estabilidade do (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o processo de purificação (tempo 0h) e 24h após o processo de purificação. Cada resultado representa a média de três determinações. Tabela 34 Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV =

21 IX coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 35 Concentrações plasmáticas médias de (S)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 36 Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 37 Concentrações plasmáticas médias de (S)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 38 Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 39 Concentrações plasmáticas médias de (S)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Tabela 40 Parâmetros farmacocinéticos para o (R)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela 41 Parâmetros farmacocinéticos para o (S)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela 42 Parâmetros farmacocinéticos para o (R)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de

22 X variação. Tabela 43 Parâmetros farmacocinéticos para o (S)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela 44 Parâmetros farmacocinéticos para o (R)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela 45 Parâmetros farmacocinéticos para o (S)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Tabela 46 Razão entre os parâmetros farmacocinéticos médios de ASC 0-t e Cmax para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol. Tabela 47 Parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tabela 48 Intervalo de confiança (IC 95%) para os valores dos parâmetros farmacocinéticos para o (R,S) metoprolol, considerando o regime de tratamento. Tabela 49 Parâmetros farmacocinéticos de (R)-metoprolol após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tabela 50 Intervalo de confiança (IC 95%) para os valores dos parâmetros farmacocinéticos para o (R)-metoprolol, considerando o regime de tratamento. Tabela 51 Parâmetros farmacocinéticos de (S)-metoprolol após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tabela 52 Intervalo de confiança (IC 95%) para os valores dos parâmetros farmacocinéticos para o (S)-metoprolol, considerando o regime de tratamento

23 XI Tabela 53 Razão entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol e seu enantiômero (R)-metoprolol (R,S/R), após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tabela 54 Intervalo de confiança (IC 95%) para as razões entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol e seu enantiômero (R)-metoprolol (R,S/R), considerando o regime de tratamento. Tabela 55 Razão entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol e seu enantiômero (S)-metoprolol (R,S/S), após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tabela 56 Intervalo de confiança (IC 95%) para as razões entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol e seu enantiômero (S)-metoprolol (T/S), considerando o regime de tratamento

24 XII Lista de Abreviaturas ANOVA Análise de variância ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ASC Área sob a curva concentração plasmática versus tempo ASC 0-t ASC 0-inf CC CEP CL CLAE cm C max CMD CQA CQB CQM CS CT r 2 CV Área sob a curva concentração plasmática versus tempo do tempo zero ao tempo da última concentração quantificável Área sob a curva concentração plasmática versus tempo do tempo zero extrapolada ao infinito Curva de calibração Comitê de ética em pesquisa Clerance Cromatografia líquida de alta eficiência Centímetros Concentração plasmática máxima Concentração média determinada Controle de qualidade alto Controle de qualidade baixo Controle de qualidade Médio Curva seca Concentração teórica Coeficiente de determinação Coeficiente de variação CYP Citocromo P-450 DI Diâmetro interno DP Desvio-padrão EC Eletroforese capilar EMA European Medicines Agency FDA Food and Drug Administration FL Fluorencência C Graus celsius

25 XIII h Hora HIV Human immunodeficiency virus IC 95% Intervalo de confiança de 95% k el Kg mg mm mm Constante de velocidade de eliminação do fármaco Kilogramas Miligramas Milimolar Milimetro µg Microgramas min Minutos ml Mililitros µl Microlitros mm Micrômetros ng Nanograma nm Nanometro p Índice de significância P Padrão PA Para análise ph Potencial hidrogeniônico PI Padrão interno Pi Peso ideal RE Resolução rpm Rotação por minuto t Tempo t (1/2) t (1/2)el TGO TGP Tempo de meia vida Meia-vida de eliminação plasmática do fármaco Transaminase glutâmico-oxaloacética Transaminase glutâmico-pirúvica t max UV Vd v/v Tempo necessário para C max Ultra violeta Volume de distribuição Volume volume

26 XIV Resumo Investigação da influência da velocidade de liberação do fármaco metoprolol a partir da forma farmacêutica sobre seu processo de absorção e de seus enantiômeros A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) não exige a realização de ensaios de bioequivalência utilizando métodos enantiosseletivos de quantificação de fármacos para o registro de medicamentos genéricos ou similares contendo fármacos racêmicos. Porém, existe a possibilidade das diferenças de concentrações plasmáticas dos enantiômeros entre o medicamento referência e os genéricos e/ou similares comercializados no Brasil serem maiores que as estabelecidas pelos limites de bioequivalência. Esse estudo teve a finalidade de investigar a influência da velocidade de liberação do fármaco metoprolol, a partir da forma farmacêutica, sobre o processo de absorção do fármaco total e de seus enantiômeros por meio da avaliação das concentrações plasmáticas de metoprolol total, (S)-metoprolol e (R)-metoprolol, e da relação entre as concentrações dos enantiômeros (S/R) após a administração oral de medicamentos contendo mistura racêmica deste fármaco. Para isso, foi realizado ensaio de biodisponibilidade in vivo, em um grupo de 20 voluntários saudáveis, de acordo com procedimentos éticos estabelecidos internacionalmente. Foram empregados três esquemas de administração do metoprolol, com a finalidade de simular diferentes velocidades de liberação do fármaco a partir da forma farmacêutica, na Fase 1 foi administrado uma dose única de 100 mg de metoprolol em solução, na Fase 2 e Fase 3 essa mesma dose foi particionada em duas e cinco administrações, respectivamente, com intervalo de 30 minutos entre elas. Foram coletadas amostras de sangue, e estas foram analisadas utilizando método convencional e método quiral para quantificação do metoprolol total e seus enantiômeros, respectivamente, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência, com detector de fluorescência. Os parâmetros farmacocinéticos de ASC 0-t, C máx e T máx foram utilizados para comparação entre as três velocidades de liberação do fármaco a partir da forma farmacêutica. A análise farmacocinética para o fámaco (R,S) metoprolol e seus enantiômeros e a comparação entre seus parâmetros farmacocinéticos obtidos após administração oral do metoprolol, indicam uma cinética enantioseletiva para o metoprolol, que pode ter ocorrido devido a uma biotransformação pré-sistêmica dose-dependente, ou a uma inibição do metabolismo do (S)-metoprolol pela forma (R)-metoprolol; Palavras chave: Metoprolol, Estudo de Biodisponibilidade, Metódo Bioanalítico Enantioseletivo, Farmacocinética de enantiômeros.

27 XV Abstract Influence of the input rate of metoprolol on the absorption of its enantiomers ANVISA, brazilian regulatory agency for drug products, does not require the use of enantioselective bioanalytical methods in bioequivalence assays of generic and similar drug products containing racemic drugs. Therefore, it is possible that two formulations are bioequivalent based on plasmatic concentration of total drug, but are not bioequivalent on the basis of the comparison of the data of the stereoisomers. The objective of this study was to investigate the influence of the release rate of metoprolol from the dosage form on its absorption process and on its enantiomers' absorption process by measuring plasmatic concentrations of total metoprolol, (S)-metoprolol and (R)-metoprolol after oral administration of drug products containing racemic metoprolol. An in vivo bioavailability study was conducted in a group of 20 healthy volunteers, according to national and international guidelines for biomedical research, in which the administration rate of metoprolol was varied. In Phase 1 a single dose of 100 mg metoprolol was administered in solution, in Phase 2 and Phase 3 the same dose was partitioned into two and five administrations, respectively, with an interval of 30 minutes between them. Blood samples were collected, and these were analyzed using the conventional method and chiral method for quantification of (R,S)-metoprolol and for its enantiomers, using high performance liquid chromatography with fluorescence detection. The pharmacokinetic parameters AUC 0-t, C max and T max were used for comparisons between three different drug release rates. Pharmacokinetic analysis for (R, S) metoprolol and its enantiomers and comparison of their pharmacokinetic parameters obtained after oral administration of metoprolol, to indicate an enantioselective kinetic, which may be due to a biotransformation pre-systemic dose dependent or the inhibition of metabolism of the (S)-form for metoprolol (R)-metoprolol. Keywords: Metoprolol, Bioavailability Study, Enantioselective Bioanalytical Methods, Stereoselective Pharmacokinetic.

28 1. INTRODUÇÃO

29 1 A quiralidade é um fenômeno que ocorre em muitas moléculas sintéticas utilizadas hoje pelas indústrias de alimentos, de perfumaria, de cosméticos e farmacêuticas, entre outras, por isso a relevância do estudo da estereoquímica. Uma molécula é dita quiral quando apresenta em sua estrutura um ou mais átomos ligados a quatro substituintes diferentes, originando uma orientação tridimensional bem definida (Davies, 2003). Os isômeros são diferentes compostos com a mesma fórmula molecular, e podem ser classificados em isômeros constitucionais, com mesma fórmula molecular mas diferentes conectividades, e estereoisômeros, isômeros que apresentam a mesma conectividade mas diferem no seu arranjo espacial. Os estereoisômeros podem ser subdivididos em enantiômeros e diasteroisômeros. Os enantiômeros são estereoisômeros cujas moléculas são imagens especulares não superponíveis, enquanto os diasteroisômeros são estereoisômeros cujas moléculas não são imagens especulares uma da outra (Smith, 2009). Os enantiômeros apresentam a mesma estrutura química e as mesmas propriedades físico-químicas, com exceção do desvio do plano da luz polarizada. Os enantiômeros que desviam o plano de luz polarizada no sentido horário recebem a denominação dextrógiro e o sinal (+) e aqueles que desviam no sentido anti-horário recebem a denominação levógiro e o sinal (-). Eles diferem em sua estrutura tridimensional, apresentando-se como imagens especulares não superponíveis. Os enantiômeros ocorrem apenas com compostos cujas moléculas são quirais (Solomons e Fryhle, 2005). A maioria dos fármacos utilizados na prática clínica são encontrados na forma de misturas racêmicas ou racematos, ou seja, misturas contendo dois enantiômeros complementares na proporção de 50:50. Esses fármacos geralmente apresentam o átomo de carbono como centro assimétrico, porém outros atómos como fósforo e enxofre também possam conferir assimetria à molécula (Leffingwell, 2003). O conhecimento aprofundado desses fármacos quirais é de grande importância, uma vez que a estereoquímica pode influenciar nas suas características farmacológicas, metabólicas e toxicológicas.

30 2 Os processos biológicos envolvem a interação do fármaco com macromoléculas quirais, originando, muitas vezes, propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas distintas entre enantiômeros. No processo de absorção há poucos exemplos de fármacos que apresentam características de enantioseletividade, já que para a maioria deles a transposição das membranas biológicas se dá por transporte passivo. Porém para os fármacos que apresentam absorção dependente de carreador podemse observar diferenças de absorção entre seus enantiômeros. Em relação aos demais processos farmacocinéticos, há relatos na literatura de numerosos casos onde ocorre ligação estereoseletiva com componentes do sangue ou plasma e proteínas dos tecidos, originando diferenças no volume de distribuição. Para os processos de excreção biliar e urinária, o transporte através de proteínas ou transportadores de cátions e ânions orgânicos pode levar a estereoseletividade no clearance e nos valores de concentração plasmática (Brocks, 2006). A biotransformação é, na maioria dos casos, a etapa mais afetada pela estereoseletividade, o que pode originar diferenças de clearance e concentrações plasmáticas entre enantiômeros. Além disso, a grande variabilidade individual também pode originar diferenças entre os enantiômeros, podendo levar a resultados indesejados e difíceis de prever, como a variação no intervalo terapêutico, a ausência de efeito terapêutico ou aparecimento de efeitos tóxicos em sub-populações específicas. Essas diferenças podem se dar devido ao polimorfismo genético, estado fisiológico e doenças, além de interação com outros fármacos. A indução e inibição enzimática são fatores que também podem afetar um fármaco quiral em diferentes extensões, especialmente quando os enantiômeros sofrem biotransformação através de diferentes enzimas ou pelas mesmas enzimas em velocidades diferentes (Tracy, 2002). Assim sendo, no caso de fármacos que se apresentam como misturas racêmicas, é possível que ocorram diferenças quantitativas e qualitativas de ação farmacológica entre os enantiômeros, bem como diferenças entre seus perfis de decaimento plasmático após a administração da mistura racêmica.

31 3 A maioria dos fármacos quirais obtidos por vias sintéticas são comercializados como racematos, muitas vezes devido à falta de tecnologia eficiente na síntese orgânica dos seus enantiômeros, ou por razões econômicas, já que é mais vantajoso produzir a mistura racêmica (Bonato, 2005). Devido a observação das diferentes formas de interação dos enantiômeros no organismo humano, a enantioseletividade passou a ser considerada no planejamento e síntese de novos produtos farmacêuticos, bem como em ensaios posteriores, como os de bioequivalência e biodisponibilidade relativa. As agências regulatórias da produção e comercialização de medicamentos, como o FDA (Food and Drug Administration), nos Estados Unidos, EMA (European Medicine Agency), na Europa, e os órgãos equivalentes no Japão e Canadá, destacam a necessidade de informaçãos acerca das propriedades físico-químicas, cinéticas e dinâmicas estereoseletivas dos fármacos quirais, a fim de garantir sua segurança e eficácia (Federsel, 2003). No Brasil, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) ainda não publicou recomendações específicas a esse respeito. Assim, é de suma importância o estudo dos fatores relacionados à via de administração e as diferentes velocidades de liberação do fármaco de sua forma farmacêutica para fármacos racêmicos, pois estes podem influenciar no seu processo de absorção, afetando a disposição cinética e a biodisponibilidade de cada enantiômero e, consequentemente, a segurança e a eficácia desses fármacos.

32 2. REVISÃO DA LITERATURA

33 5 2.1 Ensaios de bioequivalência para medicamentos contendo fármacos racêmicos Em função das diferenças farmacológicas observadas entre os enantiômeros, a quantificação de fármaco total em fluidos biológicos pode ocasionar falhas na interpretação de dados farmacocinéticos e farmacodinâmicos e de relação entre concentração e efeito farmacológico (Nation, Sansom, 1994). Conseqüentemente, o emprego de métodos estereosseletivos de quantificação de fármacos para avaliar a absorção, distribuição, metabolismo e excreção de enantiômeros presentes em uma mistura racêmica tornou-se prática comum em ensaios clínicos. Entretanto, o uso destes métodos em ensaios de bioequivalência ainda é controverso, e diversos argumentos favoráveis e desfavoráveis são citados pelos cientistas envolvidos com essa questão (Srinivas, 2004). Os ensaios de bioequivalência ganharam visibilidade no Brasil principalmente após a promulgação da Lei 9.787, em 10 de fevereiro de 1999, que instituiu o medicamento genérico no Brasil de acordo com as normas internacionais adotadas por países da Comunidade Européia, Estados Unidos e Canadá, além da OMS, e a publicação das Resoluções que estabeleceram os critérios técnicos para seu registro. A Lei e as resoluções que a regulamentam revolucionaram o mercado farmacêutico brasileiro e introduziram conceitos como equivalências farmacêutica e terapêutica, biodisponibilidade e bioequivalência. (Bueno, 2005). A intercambialidade, ou equivalência terapêutica, pode ser demonstrada por métodos convencionais como os ensaios clínicos de longa duração. Entretanto, com o objetivo de economizar recursos financeiros e tempo, e também em virtude de considerações éticas em relação ao elevado número de pacientes envolvidos em tais ensaios, a comparação clínica direta tem sido substituída por avaliações indiretas. Com base no princípio de que curvas semelhantes de decaimento sanguíneo de fármacos produzem o mesmo resultado em termos de eficácia e segurança, realizam-se ensaios de bioequivalência em que a biodisponibilidade do produto candidato a genérico ou similar é comparada à do produto referência. Neste contexto, a

34 6 bioequivalência pode ser considerada um substituto da equivalência terapêutica, desde que exista relação bem definida entre concentração do fármaco e efeito terapêutico e segurança (Porta, 1999; Gleiter et al., 1998; Herchuelz, 1996; Meredith, 1996; Nation, Sansom, 1994). Os ensaios de bioequivalência são realizados em humanos por meio da administração dos medicamentos a serem avaliados, seguida pela determinação das concentrações plasmáticas, séricas ou sangüíneas do fármaco ou metabólito ativo em função do tempo. A partir das curvas de concentração em função do tempo obtidas, determinam-se os parâmetros farmacocinéticos utilizados na avaliação da bioequivalência e que são, basicamente, a concentração sanguínea máxima do fármaco ou metabólito (C max ), e a área sob a curva de decaimento sanguíneo (ASC) (Porta, 1999). Assim, embora normalmente se considere que duas formulações bioequivalentes são terapeuticamente equivalentes, isto pode não ser verdade para alguns produtos contendo fármacos racêmicos: nestes casos, a quantificação de fármaco total, sem discriminação dos enantiômeros, pode não significar equivalência terapêutica (Mehvar, 1997). Embora exista consenso entre pesquisadores e entre agências reguladoras em relação ao planejamento, execução e interpretação de resultados de ensaios de bioequivalência em geral, o mesmo não acontece quando se trata de ensaios de bioequivalência de medicamentos contendo fármacos na forma de misturas racêmicas, uma vez que existe grande controvérsia em relação a qual substância deve ser quantificada nos fluidos biológicos dos voluntários (Nation, Sansom, 1994): todos os enantiômeros individualmente, por meio de método analítico estereosseletivo; apenas o enantiômero ativo, por meio de método analítico estereosseletivo;

35 7 o fármaco total sem distinção entre os enantiômeros, por meio de método analítico não estereosseletivo. Como reflexo desta situação, observa-se que as agências reguladoras apresentam visões distintas sobre a necessidade de se realizar ensaios de bioequivalência com quantificação de enantiômeros. Assim, enquanto a ANVISA não exige o emprego de métodos bioanalíticos estereosseletivos em nenhuma situação, a agência européia EMA (European Medicine Agency), estabelece que os estudos de bioequivalência de medicamentos contendo fármacos quirais devem empregar tais métodos, exceto nos casos em que os medicamentos teste e referência contêm o mesmo enantiômero estável ou ambos contêm o racemato e os enantiômeros apresentam farmacocinética linear. As agências Health Canadá, canadense, e FDA (Food and Drug Administration), americana, adotam posições intermediárias: o Health Canada recomenda a quantificação separada dos enantiômeros nos casos em que a velocidade de absorção do fármaco influencia a razão entre os enantiômeros in vivo, e o FDA faz esta exigência para estudos de bioequivalência em que todas as condições a seguir estejam presentes: os enantiômeros apresentam características farmacodinâmicas diferentes; os enantiômeros apresentam características farmacocinéticas diferentes; o enantiômero de menor concentração plasmática é o principal responsável pela eficácia e segurança do medicamento; a absorção é não-linear, caracterizada por alterações na razão entre os enantiômeros in vivo em decorrência de alterações na velocidade de absorção do fármaco. Midha e col. (1998) propuseram um algoritmo de decisão (Figura 1) para avaliação da necessidade de emprego ou não de métodos estereosseletivos de quantificação de fármacos em ensaios de bioequivalência. De acordo com esse algoritmo, seria necessário usar tais métodos nas seguintes situações:

36 8 Figura 1: Algoritmo de decisão para avaliação da necessidade de emprego ou não de métodos estereosseletivos de quantificação de fármacos em ensaios de bioequivalência (modificado de Midha et al., 1998). 1. nos casos em que o enantiômero ativo apresente alta taxa de biotransformação pré-sistêmica estereosseletiva e exista relação entre a velocidade de entrada do fármaco no organismo e a proporção entre as concentrações plasmáticas dos enantiômeros (quantificar fármaco total e enantiômero ativo); 2. nos casos em que o enantiômero ativo apresente baixa taxa de biotransformação pré-sistêmica estereosseletiva e a proporção específica entre as concentrações plasmáticas dos enantiômeros seja importante para atingir o efeito terapêutico ótimo (quantificar cada enantiômero separadamente).

37 9 De acordo com Srinivas (2004), outras informações, além daquelas relacionadas à biotransformação pré-sistêmica de fármacos racêmicos, são importantes no processo de decisão sobre a utilização ou não de métodos analíticos estereosseletivos: saturabilidade do processo de biotransformação pré-sistêmica; papel de outros mecanismos ativos ou passivos no processo de eliminação do fármaco (por exemplo, eliminação biliar ou renal) e sua saturabilidade; efeitos da ligação a proteínas plasmáticas e de alterações no equilíbrio fármaco livre/fármaco ligado na distribuição e eliminação dos enantiômeros. Por meio dessas informações é possível obter uma melhor compreensão da farmacocinética dos enantiômeros em diferentes dosagens (dentro da faixa terapêutica) e diferentes velocidades de entrada no organismo (comprimidos, cápsulas, soluções) (Srinivas, 2004). Em outro trabalho, Mehavar e Jamali (1997) recomendam a utilização de métodos enantiosseletivos em estudos com racematos de farmacocinética nãolinear ou cujos enantiômeros apresentem diferenças significativas de perfis farmacocinéticos, mesmo que a farmacocinética seja linear. Adicionalmente, os autores sugerem a mesma abordagem no caso de fármacos que sofrem inversão quiral (conversão de um enantiômero no outro) in vivo. Os métodos não estereosseltivos seriam empregados na avaliação de bioequivalência de medicamentos contendo fármacos racêmicos de farmacocinética linear e pouco estereosseletiva. As diferenças nas propriedades farmacodinâmicas dos enantiômeros tornam possível que a concentração total de fármaco, obtida por meio de método analítico não estereosseletivo, não apresente correlação com a intensidade do efeito farmacológico, ou com a eficácia do produto. Nestes casos, o ensaio de bioequivalência deveria ser conduzido utilizando-se métodos estereosseletivos (Sahajwalla, 2004). Entretanto, uma vez que os limites estabelecidos pelas agências reguladoras para fármacos

38 10 bioequivalentes são bastante amplos, permitindo uma variação de 20% entre os medicamentos testados, questiona-se se as eventuais diferenças entre enantiômeros não estariam incluídas nesses limites e, portanto, seria possível prescindir da utilização de métodos enantiosseletivos em ensaios de bioequivalência. Diversos ensaios de bioequivalência de medicamentos contendo fármacos racêmicos descritos na literatura indicam que as diferenças entre enantiômeros podem extrapolar os limites estabelecidos para a bioequivalência (Srinivas, 2004). Garcia-Arieta e colaboradores (2005) realizaram ensaio de bioequivalência de formulações contendo ibuprofeno racêmico com quantificação do fármaco total por método não estereosseltivo e dos dois enantiômeros (S-ibuprofeno e R-ibuprofeno) por método estereosseletivo. Os produtos testados foram bioequivalentes tanto para o fármaco total como para os enantiômeros, entretanto a proporção entre os dois enantiômeros (S/R) no plasma foi diferente para os dois produtos testados. Formulações contendo clorfeniramina, outro fármaco disponível na forma de mistura racêmica, foram submetidas a ensaio de bioequivalência descrito por Hiep e colaboradores (2000). Neste estudo, os autores comprovaram bioequivalência entre as formulações com o emprego de método não estereosseltivo de quantificação de clorfeniramina no plasma, mas ausência de bioequivalência com o emprego de método estereosseletivo. Esta diferença foi observada também por Srinivas e colaboradores (1996) em estudo de bioequivalência entre formulações contendo nadolol: o emprego de método não estereosseletivo levou à conclusão de bioequivalência entre as formulações, enquanto que o emprego de método estereosseletivo originou resultados que indicaram a ausência de bioequivalência entre as mesmas formulações. Os fármacos racêmicos sujeitos a processos saturáveis, especialmente durante a fase de absorção (absorção por transporte ativo, inversão quiral in vivo mediada por enzimas, biotransformação pré-sistêmica) e cujos enantiômeros apresentam diferenças farmacocinéticas, estão sujeitos a

39 11 alterações na proporção entre os enantiômeros no plasma em função da velocidade de introdução do fármaco no organismo. Boni e colaboradores (2000) avaliaram se os valores de C máx de (S) - e (R,S) - etodolac são afetados pela taxa de absorção, observando que o decréscimo na taxa de absorção diminui significativamente a razão de C max entre o enantiômero (S) - e fármaco total (R,S) -, devido a diferenças na saturação enantioseletiva da absorção e nas diferenças na ligação com as proteínas. Portando os processos farmacocinéticos de absorção no trato gastrintestinal, distribuição nos tecidos e filtração glomerular são dependentes das propriedades físico-químicas da molécula do fármaco. Uma vez que essas propriedades são as mesmas para ambos os enantiômeros, não observa-se enantioseletividade nesses processos. Entretando, em processos onde ocorre a interação com macromoléculas opticamente ativas, como no caso de absorção mediada por transportadores, ligação às proteínas plasmáticas, excreções biliar e renal e nos processos de biotransformação, observa-se diferentes comportamentos para os enantiômeros (Tucker, 1990). A via de administração e velocidade de liberação do fármaco da forma farmacêutica são pontos relevantes nesse aspecto, já que no caso de moléculas que sofrem baixa biotransformação hepática, a enantioseletividade ocorre tanto após a administração oral quanto na intravascular, já que as diferenças no clearance intríseco são diretamente relacionadas ao do clearance hepático. Enquanto que para fármacos que sofrem alta biotransformação hepática, na administração intravascular o clearance hepático é dependente do fluxo de sangue hepático e não do clearance intrínseco. Então as diferenças observadas na razão entre os enantiômeros de fármacos com alta biotransformação hepática está relacionada à administração por via oral. Esse processo de biotransformação hepática é, portanto, um parâmetro farmacocinético crítico na enantioseletividade de um fármaco, e pode-se manisfestar tanto nas reações enzimáticas de fase I e fase II, quanto nas reações que levam à produção de metabólitos quirais a partir de fármacos não quirais (Mistry, 2002). Fármacos quirais com farmacocinética linear apresentam suas razões

40 12 enantioméricas de área sob a curva (ASC) constantes para diferentes doses e formas farmacêuticas, indicando que a extensão e velocidade de absorção dos enantiômeros estão diretamente relacionadas com as da forma racêmica. Porém os parâmetros de concentração plasmática máxima (C máx ) e de tempo para se atingir esta concentração (T máx ) pode diferir entre os enantiômeros e o fármaco total. Enquanto na farmacocinética não-linear, a razão entre os valores de ASC para os enantiômeros pode ser dependente da velocidade e extensão de absorção do fármaco (Kroemer, 1996). Essa farmacocinética não-linear pode ocorrer devido a enantioseletividade no processo de biotransformação ou excreção, resultando em razões enantioméricas de ASC distintas. No caso de enantioseletividade na ligação às proteínas plasmáticas essa razão enantiomérica pode ser afetada para o C máx, dependendo da velocidade de liberação do fármaco da forma farmacêutica (Tucker, 1990). Assim, a determinação dos parâmetros farmacocinéticos para os fármacos racêmicos e enatiômeros isolados é de grande importância para a farmacologia clínica, a fim de definir e controlar uma possível variabilidade das respostas dos indivíduos e nas definições dos parâmetros biofarmacotécnicos no desenvolvimento do produto farmacêutico. 2.2 Metoprolol O metoprolol [1-isopropilamino-3-[4-(2-metoxietil)fenoxi]propan-2-ol] é um antagonista seletivo do receptor β1 adrenérgico, que possue um centro assimétrico em sua cadeia (Figura 2), e é administrado na forma de mistura racêmica, sendo utilizado no tratamento de hipertensão arterial sistêmica, infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca (Mostafavi e Foster, 2000).

41 13 (R,S)-metoprolol Figura 2: Estrutura do fármaco metoprolol e seus enantiômeros. Fármacos β-bloqueadores ocupam os receptores β-adrenérgicos e reduzem, competitivamente, a ligação de catecolaminas e β-agonistas pelo receptor (Katzung, 2006). Parece provável que um conjunto de mecanismos contribua para o efeito benéfico dos β-bloqueadores na insuficiência cardíaca crônica (Papadoupoulos e Papademetriou, 2009). Os possíveis mecanismos mais importantes incluem a redução dos níveis circulantes de vasoconstritores; reduções na pressão arterial, frequência cardíaca e consumo de oxigênio pelo miocárdio; diminuição da densidade de receptores β1-adrenérgicos do miocárdio; redução na produção de genes de citocinas inflamatórias do miocárdio; efeitos favoráveis sobre a remodelação cardíaca; aumento da perfusão diastólica; e normalização da expressão de vários genes do miocárdio envolvidos no desenvolvimento de hipertrofia patológica (Kubon, 2011). O metoprolol reduz a pressão arterial elevada, e o aumento de pressão arterial que ocorre em resposta a exercícios físicos. O tratamento resulta, inicialmente, em aumentos na resistência vascular periférica, que durante a administração a longo prazo é normalizada ou, em alguns casos, reduzida.

42 14 Como para os demais beta-bloqueadores o mecanismo farmacológico antihipertensivo ainda não está completamente elucidado, no entanto, a redução da pressão arterial a longo prazo, observada com metoprolol, parece ser paralela ao decréscimo gradual na resistência periférica total. Nos pacientes com angina o metoprolol reduz a freqüência e a gravidade dos episódios isquêmicos e aumenta a capacidade de trabalho físico. Esse efeito benéfico pode ser causado pelo decréscimo na demanda de oxigênio do miocárdio que ocorre em resposta à redução da freqüência cardíaca e à contratilidade do miocárdio. Já em pacientes com taquicardia supraventricular, com fibrilação atrial, com extra-sístoles ventriculares ou outra arritmia ventricular, o metoprolol tem efeito regulador sobre a freqüência cardíaca. Sua atividade antiarrítmica deve-se, principalmente, à inibição da automaticidade das células marcapasso e ao prolongamento da condução atrioventricular (Regardh, 1980). Por seu efeito beta-bloqueador, o metoprolol é adequado para o tratamento de distúrbios cardíacos funcionais com palpitação, para prevenção de enxaqueca e tratamento coadjuvante do hipertireoidismo. O tratamento crônico com metoprolol pode reduzir a sensibilidade à insulina, no entanto, metoprolol interfere em menor grau na liberação de insulina e no metabolismo dos carboidratos, quando comparado aos beta-bloqueadores não seletivos. Estudos de curta duração demonstraram que o metoprolol pode alterar o perfil lipidico sanguíneo e levar a um aumento dos triglicérides e à diminuição dos ácidos graxos livres, porém em extensão menor do que o observado em betabloqueadores não seletivos. Em relação a sua farmacocinética, a absorção do metoprolol após administração por via oral é praticamente completa, apesar de a sua biodisponibilidade ser baixa, cerca de 40%, devido a sua significante eliminação pré-sistêmica (Goodman e Gilman, 2006). O metoprolol é principalmente eliminado pelo metabolismo hepático através de reações de α- hidroxilação (α-hidroximetoprolol) e de O-desmetilação (O-dimetilmetoprolol) e apenas 10 ± 3% do fármaco administrado são recuperados na urina de forma inalterada (Cerqueira, 2003). A formação da α-hidroximetoprolol e de parte do O-dimetilmetoprolol são dependentes da CYP2D6 (debrisoquina/esparteína), do complexo citocromo P450, responsável pelo polimorfismo oxidativo das

43 15 enzimas que divide a população caucasiana em metabolizadores extensos e em metabolizadores deficientes. O metoprolol possui tempo de meia vida de 3,2 ± 0,2 horas. A ligação do fármaco às proteínas plasmáticas é quase insignificante, com valores reportados de 11 ± 1%. Seu volume de distribuição é de 4,2 ± 0,7 L.Kg -1. As concentrações plasmáticas do fármaco podem variar amplamente (até 17 vezes), devido a diferenças geneticamente determinadas nas taxas de metabolismo já citadas. A concentração máxima atingida do metoprolol é de 99 ± 53 ng.ml -1 para metabolizadores extensos e de 262 ± 29 ng.ml -1 para metabolizadores deficientes em um tempo de concentração máxima de 2 e 3 horas, respectivamente. O metoprolol possui um clearance de 15 ± 3ml x min -1 x Kg -1 ( Mehvar, 2001 e Cerqueira, 1999) Dados disponíveis sobre a ação farmacológica de fármacos beta bloqueadores indicam que a interação desses agentes com betaadrenoceptores é altamente estereosseletiva (Mehvar e Brocks, 2001). Assim como a maioria dos betabloqueadores, a afinidade do metoprolol por receptores β1-adrenérgico é significantemente maior para o (S)-metoprolol (Lanchote, 2000) sendo este, portanto, o enantiômero ativo (Seeringer, 2008). No entanto, a estereosseletividade do fármaco pode ser melhor observada em relação ao seu metabolismo, que gera algumas diferenças farmacocinéticas entre os dois enantiômeros (Quadro 1). O metoprolol é predominantemente eliminado pelo metabolismo hepático. Nos humanos, as principais vias metabólicas são a O-desmetilação, a α-hidroxilação e a desaminação oxidativa. Estudos sugerem que há enantiosseletividade nas vias de metabolização O-desmetilação e α-hidroxilação sendo esta estereosseletiva para o (S)-metoprolol (Seeringer, 2008). A maior via metabólica, no entanto, é a O-desmetilação que favorece a metabolização do (R)-metoprolol, sendo assim, responsável pela estereosseletividade observada nas concentrações plasmáticas do metoprolol (Cerqueira, 2003; Mehvar e Brocks, 2001).

44 16 Quadro 1: Parâmetros farmacocinéticos dos enantiômeros do metoprolol após a administração do racemato. Parâmetros farmacocinéticos (R)-metoprolol (S)-metoprolol Cmáx (nm l -1 ) 235 ± ± 132 AUC 0- (ng h l -1 ) CL p.o. (l min -1 kg -1 ) T 1/2 (min) V d /F (l kg -1 ) O metoprolol apresenta diversas características que o colocam como fármaco para o qual é recomendável o emprego de método enantiosseletivo em ensaios de bioequivalência (Cerqueira, 2003, Sandberg 1993). Seus enantiômeros exibem diferenças farmacodinâmicas, uma vez que a afinidade do enantiômero (S)-metoprolol pelo receptor de subtipo β 1 -adrenérgico é significativamente maior (cerca de 500 vezes) que a do (R)-metoprolol (Wahlund et al, 1990). Além da afinidade estereoseletiva pelo receptor, são observadas também diferenças em relação ao clearance, ligação às proteínas e tecidos, metabolismo e interação com outros fármacos. Sendo assim, podemos considerar que a utilização clínica do racemato é equivalente à administração de dois fármacos com diferenças farmacocinéticas e farmacodinâmicas (Kim et al, 2000). Para fármacos com metabolismo pré-sistêmico, como acontece com o metoprolol, a razão entre os valores de ASC de cada enantiômero pode ser afetada pela velocidade de absorção do fármaco. Se os enantiômeros de um fármaco quiral são absorvidos pelo trato gastrintestinal por um mecanismo saturável, como absorção através de carreadores, os resultados de estudos de bioequivalência com quantificação do fármaco total não podem ser extrapolados para os enantiômeros individuais, já que esse tipo de absorção é enantiosseletivo (Mehvar et al, 1997). Além disso, a ausência de linearidade na

45 17 ligação enantiosseletiva de um fármaco às proteínas plasmáticas ou teciduais pode resultar em alterações nas razões enantioméricas de concentrações plasmáticas dependendo da velocidade de liberação do fármaco da formulação farmacêutica (Mistry, Leslie e Eddington, 2002). Alguns trabalhos apontam as diferenças quirais observadas para o metoprolol, como em um estudo de bioequivalência realizado por Menon e colaboradores, onde eles compararam uma formulação teste de 50 mg do enantiômero ativo (S)-metoprolol com uma formulação referência de 100 mg de metoprolol racêmico. O enantiômero (S)-metoprolol foi quantificado utilizano método quiral por LC/MS/MS. O estudo foi realizado utilizando 24 voluntários homens, o valor de C máx (ng/ml), T máx (h), ASC 0-t (ng/ml.h) e ASC 0- (ng/ml.h) para as formulações de referência e teste foram 50,03 e 53,76; 1,86 e 2,17; 352,24 e 387,92 e 363,75 e 402,55, respectivamente para (S)-metoprolol. A proporção de médias ajustadas para C máx, ASC 0-t e ASC 0- foram de 98,96%, 103,38% e 103,88% respectivamente. Como resultado observaram que as duas formulações teste e referência foram bioequivalentes (Menon, et al 2011). Wormke e colaboradores realizaram um estudo de bioequivalência a fim de avaliar duas formulações de liberação prolongada, contendo 190 mg de succinato de metoprolol racêmico. As formulações de liberação prolongada exibiram uma taxa de absorção reduzida, e foram bioequivalentes entre si (Wromke, et al 2012). Estão disponíveis, no mercado brasileiro, medicamentos genéricos e similares contendo metoprolol na forma de mistura racêmica. Como não é exigida pela ANVISA a realização de ensaios com métodos enantiosseletivos de quantificação de fármacos para avaliar a bioequivalência entre essas formulações, existe a possibilidade de diferenças entre as concentrações plasmáticas de (S)-metoprolol e (R)-metoprolol serem maiores que as estabelecidas pelos limites de bioequivalência. Esta pode ser, inclusive, uma possível explicação para diferenças de ação entre medicamentos referência e genérico relatadas por alguns pacientes e médicos. Desta forma, justifica-se a realização de investigação científica para avaliar a influência de diferenças farmacotécnicas, como a velocidade de liberação do fármaco da formulação,

46 18 na farmacocinética do metoprolol total e de seus enantiômeros, (S)-metoprolol e (R)-metoprolol e na avaliação de bioequivalência entre diferentes formulações. 2.3 Métodos enantioméricos de quantificação de fármacos Para uma análise eficiente e precisa das diferenças biológicas observadas entre os enantiômeros de um fármaco quiral, é necessário o desenvolvimento de metodologias analíticas adequadas para a determinação das concentrações desses enantiômeros em fluidos biológicos ou em preparações farmacêuticas. As técnicas mais utilizadas são a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e eletroforese capilar (EC) (Bonato e Jabor, 2005). A técnica de cromatografia líquida é a mais empregada para a separação dos enantiômeros, e ela ocorre pelo uso de fases móveis contendo aditivos quirais, pelo uso de fases estacionárias quirais, ou por processo de derivatização com reagentes quirais e posterior análise por método não quiral (Schimid e Gubitz, 2011). Nas colunas quirais, os enantiômeros são retidos de formas distintas, e a separação depende da formação de diastereoisômeros transitórios na superfície da fase estacionária. Aquele que formar o diastereoisômero mais estável ficará mais retido na fase estacionária, enquanto o outro formará um diastereoisômero menos estável e será eluído mais rapidamente. As forças responsáveis por essa separação são muito fracas e requerem otimização por ajustes de fase móvel e temperatura para obter uma melhor seletividade (Beesley, 2011). As interações intermoleculares envolvidas no reconhecimento quiral são do tipo polares/iônico, pi-pi, ligações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio. Essas interações podem ser aumentadas pela formação de complexos de inclusão e de ligação a sítios específicos, como peptídeos (Gubitz, 1990). O

47 19 analista pode, ainda, maximizar essas interações através de fases móveis adequadas ou ajustes de ph. O controle da temperatura é outro fator importante na separação quiral, sendo que temperaturas mais baixas aumentam o reconhecimento quiral (Srinivas, 2004). O tipo de fase estacionária utilizada para separar uma classe de enantiômeros é muitas vezes específica, e combinada ao alto custo dessas colunas quirais fazem da decisão de qual coluna utilizar uma etapa muito importante. As colunas quirais são classificadas de acordo com o mecanismo de interação com o analito, e podem ser dos tipos brush (Pirkle), celulose, ciclodextrina, antibióticos macrocíclico, proteínas, cavidade de inclusão, entre outras (Ahuja, 2000). Nos últimos tempos, inúmeros seletores quirais foram desenvolvidos, sendo avaliados tanto para verificar suas habilidades de resolução quiral, quanto para serem empregadas no preparo de fases estacionárias quirais. As fases mais promissoras estão disponíveis comercialmente e são empregadas para aplicações diversas. As fases estacionárias quirais pode ser classificadas de acordo com seu mecanismo de interação com o analito (Li, 2006). Elas podem ser classificadas como: - Tipo I, que são aqueles que diferenciam os enantiómeros pela formação de complexos com base em interações intermoleculares, como pontes de hidrogênio e interações dipolo-dipolo. - Tipo II, que são aquelas que envolvem uma combinação de interações intermoleculares e complexos de inclusão para produzir uma melhor separação. Esse tipo de fase são derivados de celulose. - Tipo III, possuem cavidades quirais onde o analito é retido formando um complexo de inclusão. - Tipo IV, a separação se dá por meio de formação de complexos diastereoméricos com metais.

48 20 - Tipo V, são derivadas de proteínas e a separação é dependente de uma combinação de interações hidrofóbicas e polares. Todos esses fatores combinados permitem o desenvolvimento de um método sensível e seletivo para a determinação quantitativa e qualitativa dos enantiômeros, sendo assim uma importante ferramenta para realização de estudos dos fármacos quirais e seus metabólitos. Vários trabalhos foram realizados utilizando cromatografia quiral para analise de metoprolol e demais beta bloqueadores, como Ali e colaboradores, que realizaram a análise quiral de vários beta bloqueadores, alprenolol, carazolol, metoprolol e oxprenolol, em plasma humano. Foi utilizada coluna do tipo celulose, CelluCoat, com fase móvel composta por n- heptano:etanol:dietilamina (v/v/v), o método foi eficiente para a resolução quiral de todos os analitos, e tinha como finalidade a utilização em ensaios farmacocinéticos e de desenvolvimento de novos fármacos quirais (Ali, 2011). Um outro método quiral foi desenvolvido por Jesen e colaboradores, utilizando LC/MS/MS, para quantificar os enantiômeros do metoprolol em plasma humano na faixa de 0,5 a 50 µg.ml -1. A separação dos enantiômeros foi realizando utilizando coluna Chirobiotic T, com fase móvel constituida de metanol:ácido acético:amônia (100:0,15:0,15; v/v/v). O método se mostrou eficiente na quantificação dos enantiômeros do metoprolol em plasma humano, para aplicação em ensaios clínicos (Jesen, 2008). Svensson e colaboradores, avaliaram a influência da concentração de metanol, temperatura da coluna e pressão na coluna, no método quiral comparando as colunas Chiralcel OD e Chiralpak AD, utilizando fluído supercrítico. Eles observaram que a temperatura da coluna teve um maior efeito sobre a enanteosselectividade que o teor de metanol. Mudanças no sistema de pressão do sistema de fluído supercrítico não teve influência significativa sobre enantiosseletividade. Singh e colaboradores desenvolveram um método quiral para quantificação de atenolol e metoprolol, utilizando uma coluna Chiralcel OD,

49 21 com fase móvel constituída por hexano:etanol:dietilamina:ácido acético (60:40:0,2:0,2, v/v/v/v). O metódo se mostrou eficiente para a quantificação dos fármacos em comprimidos, para controle de qualidade das formas farmacêuticas (Singh, 2001).

50 3. OBJETIVOS

51 Objetivo O presente estudo tem como objetivo investigar a influência da velocidade de liberação do metoprolol a partir da forma farmacêutica sobre o processo de absorção do fármaco total e dos enantiômeros (S)-metoprolol e (R)-metoprolol sobre a relação entre as concentrações plasmáticas destes enantiômeros. 3.2 Objetivos específico Desenvolver método bioanalítico para a quantificação de (R,S) metoprolol em amostras de plasma humano, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência; Desenvolver método enantioseletivo para quantificação dos enantiômeros R-metoprolol e S-metoprolol em amostras de plasma humano, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência; Realizar análise farmacocinética para o fámaco (R,S) metoprolol e seus enantiômeros e comparar os parâmetros farmacocinéticos obtidos após administração oral do metoprolol; Verificar se diferentes tratamentos simulando velocidades de liberação diferentes, do fármaco metoprolol, causam influência nas relações entre as concentrações plasmáticas de (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros.

52 4. MATERIAIS E MÉTODOS

53 Materiais Substância química padronizada Metoprolol: (±) tartarato de metoprolol, lote 018k0760, teor 99%, Sigma-Aldrich. Enantiômero (R) metoprolol, lote I2011, Santa Cruz Biotechnology. Enantiômero (S) metoprolol, lote I2311, Santa Cruz Biotechnology Medicamento Foram utilizados utilizados comprimidos de tartarato de metoprolol. Produto: Lopressor - comprimido 100 mg de tartarato de metoprolol Laboratório: Novartis Lote: Z0026 Fabricação: 02/2011 Validade: 01/ Reagentes e solventes Foram empregados, no desenvolvimento do presente estudo, os seguintes reagentes e solventes: Padrão secundário de atenolol; Padrão secundário de propranolol; Padrão secundário de fluoresceína; Padrão secundário de ofloxacino;

54 26 Acetonitrila grau HPLC, Merck; Metanol grau HPLC, Merck; Hexano grau HPLC, Merck Etanol grau HPLC, Carlo Erba Trietilamina ps., Vetec; Ácido trifluoroacético pa, Merck; Ácido fosfórico 85,0% pa, Synth; Fosfato de potássio monobásico, Merck; Dietilamina, Merck Água purificada obtida em equipamento de osmose reversa, Gehaka ; Água ultrapura obtida em equipamento Millipore, modelo MilliQ Academic; Unidades filtrantes Millipore, tipo HV Milex em polietileno com membrana de PVDF, 0,45 µm de poro, 13 mm de diâmetro, N. AJO-4287, C 18 4 x 3,0 mm Coluna cromatográfica Phenomenex, C18 modelo Gemini (150 x 4,6 mm, 5 µ di); Coluna cromatográfica Phenomenex, Phenyl-2 modelo Hypersil (150 x 4.6 mm, 5 µ di); Coluna cromatográfica Kinetex C18 (100 x 4,6 mm, 2.6 µ di); Pré-coluna C18/14, n.ajo-4287, C 18 4 x 3,0 mm; Coluna quiral Chiralcel OD-R (150 mm x 4,6 mm, 5 µ di), Daicel Chemical Industries LTD; Nitrogênio White Martins Equipamentos

55 27 Cromatógrafo líquido de alta eficiência Merck Hitachi, composto por uma bomba L7100, injetor automático de amostras L7200, detector UV L7400 e FL L7485, e forno de coluna L7300; Balança analítica modelo AX200, Shimadzu; phmetro HI221, Hanna instruments; Banho ultrassônico USC 2800, Unique; Banho-maria Agitador de tubos tipo vórtex Sistema de filtração a vácuo, Sartorius; Pipetas atomáticas Transferpette, Brand; Centrífuga Materiais Balões volumétricos de vidro Pirex ; provetas de vidro Pirex ; tubos de ensaio de vidro de 10 ml com rolha esmerilhada; tubos cônicos de vidro de 10 ml; frascos de polipropileno de 4 ml; ponteiras de polipropileno descartáveis Brand para pipetas automáticas; Material médico-hospitalar: o seringas descartáveis BD de 5 e 10 ml; o agulhas descartáveis BD 25x7 mm o escalpe BD 21 G

56 28 o cateteres intravenosos periféricos Safe-t-intima 20G, 22G e 24G; o cateteres intravenosos periféricos Gelco 20G, 22G e 24G; o heparina sódida frasco-ampola 5000 UI Ariston; o algodão hidrófilo não estéril Cremer; o soro fisiológico 0,9 % de 250 e 500 ml; o álcool 70 de 100 ml; o coletores para artigos descartáveis Descartex 3 e 7 litros; o luvas para procedimento não estéreis Supermax ; o tubos para coleta de sangue Vacutainer de 10 ml contendo heparina.

57 Métodos Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação de (R,S) metoprolol em plasma humano O desenvolvimento de um método analítico envolve a otimização de várias etapas, como preparação da amostra e condições cromatográficas. O método de quantificação deve ser específico para cada analito, ou seja, apresentar separação cromatográfica livre de interferentes. A análise cromatográfica de substâncias presentes em matrizes biológicas (soro, plasma, sangue, urina), em geral, requer um pré-tratamento da amostra, devido à complexidade das matrizes biológicas. A existência de proteínas, que são incompatíveis com as colunas cromatográficas, e a necessidade de concentração das substâncias a serem analisadas, tornam necessário o desenvolvimento e otimização das técnicas de extração e/ou préconcentração, tornando possível a análise dos componentes de interesse. Estão descritos na literatura alguns métodos para a quantificação do metoprolol em plasma, por meio de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) com detecção ultravioleta e de fluorescência. A partir desses estudos, foram testadas as variáveis (padrão interno, fase móvel, método de detecção e coluna) e avaliados os resultados (tempo de retenção, resolução dos picos e seletividade). Para o desenvolvimento do metódo foi avaliado o efeito de diferentes fatores, como porcentagem de solvente orgânico - acetonitrila e/ou metanol - e composição da fase-móvel, ph, coluna e fluxo de fase-móvel. Foram testados os padrões internos propranolol, atenolol, fluoresceína e ofloxacino, bem como as colunas cromatográficas Phenomenex C18 modelo Gemini e Phenyl-2 modelo Hypersil, ambas com 150 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, contendo partículas de 5 µm; e a coluna Kinetex C18 com 100 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, contendo partículas de 2.6 µm.

58 30 Todas as condições foram testadas utilizando detecção por ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm e por fluorescência nos comprimentos de onda de 230 (excitação) e 305 nm (emissão) para o metoprolol. Para as análises foram utilizadas soluções preparadas em água:metanol (90:10), na concentração de 250 ng.ml -1 para o metoprolol, e na concentração de 100 ng.ml -1 para as substâncias testadas como padrão interno, atenolol, propranolol, fluoresceína e ofloxacino. A partir dos resultados dos ensaios realizados o método foi desenvolvido e validado para quantificação de metoprolol em plasma por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência, após extração por precipitação de proteínas, utilizando acetonitrila, e ofloxacino como padrão interno (PI) Preparo da solução estoque padrão e soluções de trabalho padrão de metoprolol Preparou-se solução estoque padrão de metoprolol na concentração de 250 µg.ml -1 em água:metanol (10:90, v/v). Esta solução foi acondicionada em frasco de vidro âmbar e armazenada em freezer à temperatura de -20ºC. As soluções de trabalho padrão de metoprolol foram preparadas a partir da solução estoque padrão, transferindo-se alíquotas adequadas para balões volumétricos e completando-se o volume com água:metanol (90:10, v/v), conforme descrito no Quadro 2 As soluções obtidas foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenada em geladeira à temperatura de 4ºC.

59 31 Quadro 2: Preparo das soluções de trabalho padrão de metoprolol. Solução de trabalho padrão Concentração da solução estoque padrão Volume de solução estoque padrão Volume final Concentração final CS1 250 µg.ml µl 1000 ml 25 ng.ml -1 CS2 250 µg.ml µl 250 ml 100 ng.ml -1 CS3 250 µg.ml µl 100 ml 250 ng.ml -1 CS4 250 µg.ml µl 50 ml 500 ng.ml -1 CS5 250 µg.ml µl 100 ml 1250 ng.ml -1 CS6 250 µg.ml µl 50 ml 2500 ng.ml Preparo de amostras de plasma padrão da curva de calibração As amostras de plasma padrão da curva de calibração foram preparadas diariamente a partir de soluções de trabalho padrão de 25 ng.ml -1, 100 ng.ml - 1, 250 ng.ml -1, 500 ng.ml -1, 1250 ng.ml -1 e 2500 ng.ml -1 de metoprolol em água:metanol (90:10, v/v). Tomaram-se alíquotas de 50 µl de solução de trabalho padrão de metoprolol e 20 µl de solução-padrão de ofloxacino a 100 ng.ml -1 em água:metanol (90:10, v/v). Adicionaram-se 200 µl de plasma branco e as amostras foram homogeneizadas em agitador de tubos tipo vórtex por 30 segundos. O Quadro 3 apresenta as diluições realizadas para obtenção das amostras de plasma padrão da curva de calibração.

60 32 Quadro 3: Preparo das amostras de plasma padrão da curva de calibração Amostra de plasma padrão Concentração da solução padrão Volume de solução padrão Volume de plasma branco Concentração final CC1 25 ng.ml µl 200 µl 5 ng.ml -1 CC2 100 ng.ml µl 200 µl 20 ng.ml -1 CC3 250 ng.ml µl 200 µl 50 ng.ml -1 CC4 500 ng.ml µl 200 µl 100 ng.ml -1 CC ng.ml µl 200 µl 250 ng.ml -1 CC ng.ml µl 200 µl 500 ng.ml Preparo das soluções de trabalho padrão de controle de qualidade As soluções de trabalho padrão de controle de qualidade foram preparadas a partir da solução estoque padrão de metoprolol na concentração de 250 µg.ml -1, transferindo-se alíquotas adequadas para balões volumétricos e completando-se o volume com água:metanol (90:10, v/v), conforme descrito no Quadro 4. As soluções obtidas foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenada em geladeira à temperatura de 4ºC. Quadro 4: Preparo das soluções padrão de controle de qualidade (CQ) de metoprolol. Solução de trabalho padrão Concentração da solução estoque padrão Volume de solução estoque padrão Volume final Concentração final CQA 250 µg.ml µl 50 ml 2000 ng.ml -1 CQM 250 µg.ml µl 100 ml 1000 ng.ml -1 CQB 250 µg.ml µl 1000 ml 50 ng.ml -1

61 Preparo de amostras de plasma de controle de qualidade Para preparação das amostras de plasma de controle de qualidade alto (CQA, 400 ng.ml -1 ), médio (CQM, 200 ng.ml -1 ) e baixo (CQB, 10 ng.ml -1 ) transferiram-se alíquotas de soluções de trabalho padrão de metoprolol em água:metanol (90:10, v/v), nas concentrações de 50 ng.ml -1, 1000 ng.ml -1 ou 2000 ng.ml -1, conforme descrito no Quadro 4, para balões volumétricos de 25 ml. A seguir, adicionou-se lentamente o plasma branco e homogeneizou-se gentilmente para evitar a formação de espuma. Após completar o volume agitou-se vigorosamente para garantir a homogeneização. Após o preparo, estas soluções foram aliquotadas em frascos de polipropileno de 2 ml e armazenadas em freezer a - 20 C. Quadro 5: Preparo das amostras de plasma de controle de qualidade Amostra de plasma de controle de qualidade Concentração da solução de trabalho padrão Volume de solução de trabalho padrão Volume de plasma branco Concentração final CQA 2000 ng.ml -1 5 ml 25 ml 400 ng.ml -1 CQM 1000 ng.ml -1 5 ml 25 ml 200 ng.ml -1 CQB 50 ng.ml -1 5 ml 25 ml 10 ng.ml Tratamento das amostras de plasma para quantificação de metoprolol Para o procedimento de purificação das amostras de plasma branco, amostras de plasma padrão da curva de calibração, amostras de plasma de controle de qualidade e amostras de plasma de voluntários após administração

62 34 oral de metoprolol foi utilizado o método de precipitação de proteínas com acetonitrila. Às amostras de plasma padrão da curva de calibração (preparadas conforme indicado no item ) foram adicionados 3mL de acetonitrila. Para as demais amostras foram adicionados, em tudo de ensaio, 250 µl de plasma e 20 µl da solução do padrão interno (ofloxacino 100 ng.ml -1 ). Em seguida, todas as amostras foram homogeneizadas em agitador de tubos tipo vórtex por 1 minuto. Após centrifugação por 10 minutos a 3500 rpm, as amostras foram filtradas, transferidas para tubos cônicos e evaporadas em corrente de nitrogênio a 45 C em banho maria. As amostras foram ressuspendida em 250 µl de fase móvel para injeção em CLAE Condições cromatográficas para quantificação (R,S)- metoprolol em plasma humano Empregou-se para separação coluna cromatográfica Phenomenex C18 modelo Gemini 150 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, contendo partículas de 5 µm. A fase móvel foi composta por uma mistura de água e metanol (70:30, v/v), contendo 0,1% de ácido trifluoroacético. A fase móvel foi filtrada em membrana de acetato de celulose 0,45 µm e degaseificada em banho de ultrassom por 15 minutos. Utilizou-se o fluxo de 1,2 ml.min -1, com tempo total de corrida de 10 minutos. A temperatura da coluna foi de 30 C. Foram injetados 50 µl da amostra e empregaram-se para detecção por fluorescência os comprimentos de onda de 230 nm (excitação) e 305 nm (emissão) para o metoprolol, e de 338 nm (excitação) e 425 nm (emissão) para o padrão interno ofloxacino.

63 Validação do método para quantificação de (R,S)- metoprolol em plasma humano A validação foi realizada através da determinação de especificidade, recuperação, limite de quantificação, linearidade, precisão, exatidão e estabilidade, conforme estabelecido pela RE 899 da ANVISA (Brasil, 2003) Especificidade Especificidade é a capacidade de um método analítico de diferenciar e quantificar o analito na presente de outros componentes da amostra. Tal parâmetro foi investigado pela análise de, no mínimo, seis amostras de plasma branco para verificação da existência de interferência por parte de componentes endógenos, sendo uma amostra de plasma lipêmico, uma amostra de plasma hemolisado e quatro amostras de plasma normal, obtidas de voluntários sadios e isentas de fármaco e padrão-interno. Interferentes no tempo de retenção do padrão e padrão interno foram aceitos desde que sua resposta representasse no máximo 20% da área do pico correspondente ao limite de quantificação inferior para o padrão e 5% da área do pico do padrãointerno Recuperação A recuperação é a medida da eficiência de extração de um método analítico, expressa como a porcentagem da quantidade conhecida de um analito, obtida da comparação dos resultados analíticos de amostras branco acrescidas de padrão e submetidas ao processo de extração, com os resultados analíticos de soluções padrão não submetidas ao processo de extração.

64 36 Foi determinada comparando-se resultados de análises de amostras de plasma adicionado de padrão de metoprolol e padrão-interno, submetidas ao processo de extração, a resultados de análises de amostras de metoprolol e padrão interno, não submetidas a esse processo, em três diferentes concentrações para o metoprolol (alta: 400 ng.ml -1, média: 200 ng.ml -1 e baixa: 10 ng.ml -1 ) e seis repetições Limite de Quantificação Limite de quantificação é a menor concentração de um analito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis. O limite de quantificação foi determinado utilizando-se concentrações decrescentes do fármaco, em seis repetições, até o menor nível quantificado. A exatidão deve estar entre ± 20 % do valor nominal da concentração, com coeficiente de variação de, no máximo, 20 % Linearidade A linearidade corresponde à capacidade do método de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito. A curva de calibração representa a relação entre a resposta do instrumento (representada pela razão da área do pico do padrão/ área do pico do PI) e a concentração conhecida do analito. Para avaliar a linearidade da curva de calibração de metoprolol foram utilizadas amostras de plasma padrão em oito concentrações diferentes, de 5, 20, 50, 100, 250 e 500 ng.ml -1. Estabeleceu-se correlação linear entre a concentração, considerada variável independente (x) e a relação entre as áreas do pico do metoprolol e do padrão interno (P/PI), considerada variável dependente (y). Os parâmetros da correlação foram estimados através do

65 37 método dos mínimos quadrados. A linearidade foi avaliada pelo valor do coeficiente de correlação linear (r 2 ), que deve ser superior a 0, Precisão A precisão de um método representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises individuais, quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma amostra homogênea, em idênticas condições de ensaio. Este parâmetro possibilita medir o erro aleatório e expressá-lo em porcentagem como coeficiente de variação (C.V. %). DP CV (%) = 100, CMD onde: CV (%) = coeficiente de variação DP = Desvio Padrão CMD = Concentração média determinada Esse parâmetro foi determinado pela análise de amostras de plasma de controle de qualidade em três diferentes concentrações (alta: 400 ng.ml -1, média: 200 ng.ml -1 e baixa: 10 ng.ml -1 ). O valor do coeficiente de variação (CV%) não deve ser superior a 15%. Foram avaliadas a precisão intra-dia, por meio de análises realizadas no mesmo dia em réplicas de seis, e inter-dias, por meio de análises realizadas em três dias diferentes em réplicas de seis por dia Exatidão A exatidão do método representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados e um valor aceito como referência. O cálculo da exatidão pode ser efetuado pela relação entre a concentração média

66 38 determinada e a concentração teórica correspondente, conforme representado na equação abaixo: CMD Exatidão (%) = 100, CT onde, CMD= concentração média determinada CT = concentração teórica O referido parâmetro foi determinado pela análise de amostras de plasma de controle de qualidade em três diferentes concentrações (alta: 400 ng.ml -1, média: 200 ng.ml -1 e baixa: 10 ng.ml -1 ). A exatidão deve estar entre ± 15% do valor nominal da concentração. Foram avaliadas a exatidão intra-dia, por meio de análises realizadas no mesmo dia em réplicas de seis, e inter-dias, por meio de análises realizadas em três dias diferentes em réplicas de seis por dia Estabilidade A estabilidade é o parâmetro que visa determinar se um analito mantémse quimicamente inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em determinados intervalos de tempo (Brasil, 2003c). Determinou-se a estabilidade das soluções padrão de trabalho utilizadas para preparação diária da curva de calibração, de amostras de plasma mantidas a -20 C, de amostras de plasma submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento, além da estabilidade de curta duração (estabilidade de amostras de plasma à temperatura ambiente durante 4 horas) e estabilidade pós-processamento (estabilidade de amostras de plasma processadas e mantidas por 24 horas à temperatura ambiente). Os desvios em

67 39 relação a amostras recém-preparadas devem estar entre ± 15% e o coeficiente de variação não deve ser superior a 15%. A determinação da estabilidade de longa duração excedeu o intervalo de tempo compreendido entre a coleta da primeira amostra na etapa clínica e análise da última na etapa analítica Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento Para determinar este parâmetro foram utilizadas três amostras de plasma de controle de qualidade em três concentrações ((alta: 400 ng.ml -1, média: 200 ng.ml -1 e baixa: 10 ng.ml -1 ), submetidas às seguintes condições: congelamento a 20 C por 24 horas, descongelamento e recongelamento por mais 24 horas e assim sucessivamente até completar três ciclos. A concentração do fármaco nas amostras de plasma de controle de qualidade foi determinada nos três ciclos, inclusive no tempo zero (recém-preparadas), correspondente à preparação das amostras de plasma de controle de qualidade e análise das mesmas sem submetê-las ao congelamento Estabilidade de curta duração Foram utilizadas três amostras de plasma de controle de qualidade em três concentrações (alta: 400 ng.ml -1, média: 200 ng.ml -1 e baixa: 10 ng.ml -1 ), submetidas a descongelamento natural e mantidas a temperatura ambiente durante 4 horas. Após este período, as amostras foram analisadas e os resultados comparados com os das amostras no tempo zero (recémpreparadas).

68 Estabilidade pós-processamento Este parâmetro avaliou a estabilidade das amostras processadas, contemplando o período de espera no auto-injetor do cromatógrafo. Conjuntos de amostras de controle de qualidade processados foram analisados após 24 horas a 4 C e os resultados comparados com os das amostras no tempo zero (recém-preparadas) Estabilidade das soluções padrão de trabalho Para avaliar a estabilidade das soluções padrão, estas foram preparadas e analisadas imediatamente após preparo, mantidas em temperatura ambientes durante 6 horas, e analisadas novamente. A estabilidade das soluções de trabalho de metoprolol e ofloxacino (padrão-interno) mantidas a 4 C foi determinada pela análise diária das mesmas durante as corridas analíticas das amostras de plasma dos voluntários. Os resultados foram comparados com os das soluções-padrão recém-preparadas. Admitiu-se desvios entre ± 15% com coeficiente de variação não superior a 15% Quantificação de (R,S)-metoprolol nas amostras de plasma humano As amostras de plasma de voluntários que receberam metoprolol foram analisadas utilizando o processo de purificação e o método cromatográfico descritos nos itens e , respectivamente, paralelamente a curva de calibração com seis pontos (5, 20, 50, 100, 250 e 500 ng.ml -1 ) e a amostras de plasma de controle de qualidade em triplicata, e em três concentrações (10, 200 e 400 ng.ml -1 ). As amostras de plasma de controle de qualidade foram distribuídas regularmente ao longo das corridas analíticas.

69 41 A validação das corridas analíticas foi realizada por meio da análise das curvas de calibração, obtidas a partir das amostras de plasma padrão da curva de calibração, e das amostras de plasma de controle de qualidade. Os resultados das amostras de plasma de controle de qualidade serviram de base para aceitação ou rejeição da corrida analítica.

70 Desenvolvimento e validação de método bioanalítico quiral para quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma humano O método analítico enantioseletivo por cromatografia líquida para quantificação dos enantiômeros do metoprolol foi desenvolvido empregando-se coluna cromatográfica quiral. Para que a separação quiral aconteça é necessário a formação de diastereoisômeros na superfície da coluna, pois esses estereoisômeros possuem propriedades físico-químicas diferentes. O composto que formar o diastereoisômero mais estável terá um tempo de eluição maior, enquanto aquele menos estável será eluído primeiro. As forças que regem essa interação são fracas e requerem uma otimização cuidadosa por ajuste da fase móvel e de temperatura, a fim de maximizar a seletividade do método. O efeito da temperatura é importante na separação quiral: baixas temperaturas aumentam o reconhecimento quiral, mas com a desvantagem de que elas podem alterar a cinética da transferência de massa, e também prejudicar a separação por causar alargamento dos picos. Estão descritos na literatura alguns métodos quirais para a quantificação dos enantiômeros do metoprolol em plasma, por meio de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) com detecção de fluorescência. Os principais utilizam a coluna quiral do tipo Chiralcel OD derivada de carbamato de celulose tris- 3,5-dimetilfenil, com fase móvel constituída de hexano, etanol e dietilamina, variando suas proporções. Para o desenvolvimento do metódo foi avaliado o efeito de diferentes fatores, tais como proporção dos solventes orgânicos, ph e fluxo da fase móvel, e temperatura do forno. Todas as condições foram testadas utilizando detecção por fluorescência nos comprimentos de onda de 230 (excitação) e 305 nm (emissão) para o metoprolol. Para as análises foram utilizadas soluções preparadas em água:metanol (90:10), na concentração de 250 ng.ml -1 para cada enantiômero do metoprolol. A partir dos resultados observados o método enantioseletivo foi desenvolvido e validado para quantificação dos enantiômeros do metoprolol em

71 43 plasma por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência, após extração por precipitação de proteínas utilizando acetonitrila, e ofloxacino como padrão interno (PI) Preparo das soluções estoque padrão e soluções de trabalho padrão dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)- metoprolol Prepararam-se soluções estoque padrão dos enantiômeros do metoprolol na concentração de 100 µg.ml -1 em água:metanol (10:90, v/v), cada um. Estas soluções foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas em freezer à temperatura de -20ºC. As soluções de trabalho padrão de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol foram preparadas a partir das respectivas soluções estoque padrão, transferindo-se alíquotas adequadas para balões volumétricos e completando-se o volume com água:metanol (90:10, v/v), conforme descrito no Quadro 6. As soluções de trabalho foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas em geladeira à temperatura de 4ºC. Quadro 6: Preparo das soluções de trabalho padrão de (R)-metoprolol e S metoprolol. Solução de trabalho padrão Concentração da solução estoque padrão Volume de solução estoque padrão Volume final Concentração final CS1 100 µg.ml µl 100 ml 50 ng.ml -1 CS2 100 µg.ml µl 50 ml 100 ng.ml -1 CS3 100 µg.ml µl 25 ml 200 ng.ml -1 CS4 100 µg.ml µl 25 ml 500 ng.ml -1 CS5 100 µg.ml µl 10 ml 1250 ng.ml -1 CS6 100 µg.ml µl 10 ml 2500 ng.ml -1

72 Preparo de amostras de plasma padrão da curva de calibração dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol As amostras de plasma padrão das curvas de calibração foram preparadas diariamente a partir de soluções de trabalho padrão de 50 ng.ml -1, 100 ng.ml -1, 200 ng.ml -1, 500 ng.ml -1, 1250 ng.ml -1 e 2500 ng.ml -1 para cada enantiômero de metoprolol em água:metanol (90:10, v/v). Tomaram-se alíquotas de 50 µl de solução de trabalho padrão de cada enantiômero de metoprolol e 20 µl de solução-padrão de ofloxacino a 100 ng.ml -1 em água:metanol (90:10, v/v). Adicionaram-se 200 µl de plasma branco e as amostras foram homogeneizadas em agitador de tubos tipo vórtex por 30 segundos. O Quadro 7 apresenta as diluições realizadas para obtenção das amostras de plasma padrão da curva de calibração. Quadro 7: Preparo das amostras de plasma padrão da curva de calibração para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol. Amostra de plasma padrão Concentração da solução de trabalho padrão Volume de solução de trabalho padrão Volume de plasma branco Concentração final CC1 50 ng.ml µl 200 µl 10 ng.ml -1 CC2 100 ng.ml µl 200 µl 20 ng.ml -1 CC3 200 ng.ml µl 200 µl 40 ng.ml -1 CC4 500 ng.ml µl 200 µl 100 ng.ml -1 CC ng.ml µl 200 µl 250 ng.ml -1 CC ng.ml µl 200 µl 500 ng.ml -1

73 Preparo das soluções de trabalho padrão de controle de qualidade para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)- metoprolol As soluções de trabalho padrão de controle de qualidade foram preparadas a partir das soluções estoque padrão dos enantiômeros (R)- metoprolol e (S)-metoprolol na concentração de 100 µg.ml -1, transferindo-se alíquotas adequadas para balões volumétricos e completando-se o volume com água:metanol (90:10, v/v), conforme descrito no Quadro 8. As soluções obtidas foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenada em geladeira à temperatura de 4ºC. Quadro 8: Preparo das soluções padrão de controle de qualidade (CQ) para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol. Solução de trabalho padrão Concentração da solução estoque padrão Volume de solução estoque padrão Volume final Concentração final CQA 100 µg.ml µl 25 ml 2000 ng.ml -1 CQM 100 µg.ml µl 50 ml 1000 ng.ml -1 CQB 100 µg.ml µl 500 ml 100 ng.ml Preparo de amostras de plasma de controle de qualidade para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)- metoprolol Para preparação das amostras de plasma de controle de qualidade alto (CQA, 400 ng.ml -1 ), médio (CQM, 200 ng.ml -1 ) e baixo (CQB, 20 ng.ml -1 ) transferiram-se alíquotas de soluções de trabalho padrão de metoprolol em

74 46 água:metanol (90:10, v/v), nas concentrações de 100 ng.ml -1, 1000 ng.ml -1 ou 2000 ng.ml -1, conforme descrito no Quadro 8, para balões volumétricos de 25 ml. A seguir, adicionou-se lentamente o plasma branco e homogeneizou-se gentilmente para evitar a formação de espuma. Após completar o volume agitou-se vigorosamente para garantir a homogeneização. Após o preparo, estas soluções foram aliquotadas em frascos de polipropileno de 2 ml e armazenadas em freezer a - 20 C. Quadro 9: Preparo das amostras de plasma de controle de qualidade para (R)- metoprolol e (S)-metoprolol. Amostra de plasma de controle de qualidade Concentração da solução de trabalho padrão Volume de solução de trabalho padrão Volume de plasma branco Concentração final CQA 2000 ng.ml -1 5 ml 25 ml 400 ng.ml -1 CQM 1000 ng.ml -1 5 ml 25 ml 200 ng.ml -1 CQB 100 ng.ml -1 5 ml 25 ml 20 ng.ml Tratamento das amostras de plasma para quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol Para o procedimento de purificação das amostras de plasma humando contendo os enantiômeros do metoprolol foi utilizado o mesmo método desenvolvido para quantificação do (R,S)-metoprolol, descrito no item , utilizando precipitação de proteínas com acetonitrila. Ao final do procedimento as amostras foram ressuspendidas em 250 µl de fase móvel para injeção em CLAE.

75 Condições cromatográficas para quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma humano Para a quantificação dos enantiômeros (S)-metoprolol e (R)-metoprolol empregou-se coluna cromatográfica quiral Chiralcel OD-R com 150 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, contendo partículas de 5 µm. A fase móvel foi composta por uma mistura de hexano:etanol:dietilamina, na proporção de 90:10:0,1 (v/v). A fase móvel foi degaseificada em banho de ultrassom por 15 minutos. Utilizou-se o fluxo de 1,0 ml/min. A temperatura do forno foi de 25 C. Foram injetados 50 µl da amostra e os comprimentos de onda para detecção por fluorescência para o metoprolol foram de 230 nm (excitação) e 305 nm (emissão) e de 338 nm (excitação) e 425 nm (emissão) para o padrão interno ofloxacino Validação do método enantioseletivo para quantificação de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma A validação foi realizada através da determinação de especificidade, recuperação, limite de quantificação, linearidade, precisão, exatidão e estabilidade para cada enantiômero, conforme estabelecido pela RE 899 da ANVISA (Brasil, 2003) e da mesma forma que descrito para a validação do método para quantificação de (R,S)-metoprolol (item ) Quantificação de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol nas amostras de plasma dos voluntários As amostras de plasma de voluntários que receberam metoprolol foram analisadas utilizando o processo de purificação e o método cromatográfico descritos nos itens e , respectivamente. O procedimento

76 48 realizado foi o mesmo que para o método descrito para análise de (R,S)- metoprolol, descrito no item , com a diferença de que para cada corrida cromatográfica foram incluídas curvas de calibração para cada enantiômero e grupos de amostras de controle de qualidade também para cada enantiômero Ensaios de Biodisponibilidade Foi realizado o ensaio in vivo de biodisponibilidade com o objetivo de investigar a influência da velocidade de liberação do fármaco metoprolol a partir da forma farmacêutica na velocidade de absorção do (R,S) metoprolol e de cada um de seus enantiômeros e também sobre as concentrações plasmáticas de (S)-metoprolol e de (R)-metoprolol e sobre a relação entre estas concentrações (S/R); Os protocolos dos estudos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP e pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário da USP Administração do medicamento Foram administradas as seguintes soluções contendo metoprolol: Solução oral contendo 100 mg de tartarato de metoprolol / dose (Tratamento 1); Solução oral contendo 50 mg de tartarato de metoprolol / dose (Tratamento 2); Solução oral contendo 20 mg de tartarato de metoprolol / dose (Tratamento 3). Os comprimidos contendo metoprolol foram triturados, pesados e fracionados, de acordo com a fase do estudo, seguindo os tratamentos 1, 2 e 3. As frações foram acondicionados em recipientes e no momento da

77 49 administração, para cada voluntário, foram dissolvidas em 25 ml de veículo aquoso edulcorado. As frações dissolvidas foram administradas juntamente com 200 ml de água Casuística Foram selecionados 20 voluntários saudáveis de ambos os sexos, sendo 10 do sexo feminino e 10 do sexo masculino, que foram devidamente informados sobre as características da pesquisa e assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. A idade, altura e peso médio dos voluntários que concluíram a etapa clínica foram 27 anos, 171 cm e 66 kg, respectivamente (Quadro 10). Todos os voluntários satisfizeram os critérios de inclusão: não fumantes ou fumantes até 10 cigarros/dia; bom estado de saúde, idade entre 21 e 45 anos, e peso dentro do ideal ± 15 %, calculado pela fórmula PI = (H 100) para homens e PI = 0,9 x (H 100) para mulheres, em que PI é o peso ideal (kg) e H, a altura do voluntário (cm); ausência de patologias cardíacas, renais, gastrintestinais, neurológicas ou metabólicas; sem antecedentes de hipersensibilidade a medicamentos; não estavam em tratamento com medicamentos; voluntárias do sexo feminino não estavam em estado de gravidez (comprovado através de exame laboratorial) ou em período de amamentação. A inclusão dos indivíduos foi baseada também em resultados dos seguintes exames clínicos e laboratoriais, além do eletrocardiograma. hemograma completo; uréia;

78 50 creatinina; fosfatase alcalina; glicemia; bilirrubina total; proteínas totais e albumina; transaminase oxalacética e pirúvica (TGO e TGP); ácido úrico; colesterol total; triglicérides; urina tipo I; sorologia para HIV, hepatite B e hepatite C; β-hcg para mulheres; eletrocardiograma com doze derivações. Todos os exames laboratoriais, exceto a sorologia para HIV, hepatite B e hepatite C, foram repetidos no período pós-estudo.

79 51 Quadro 10 Características dos voluntários que concluíram a etapa clínica para o estudo clínico Voluntário Sexo Idade (anos) Altura (cm) Peso (kg) D.P.I. (%) 1 M ,4 2 F ,0 3 F ,8 4 M ,5 5 M ,4 6 M ,4 7 M ,0 8 F ,5 9 F ,4 10 F ,0 11 M ,2 12 F ,7 13 M ,1 14 F ,6 15 M ,1 16 M ,1 17 F ,1 18 F ,8 19 F ,5 20 M ,5 Média... 26,9 171,15 66,5 2,66 D.P.... 4,04 6,23 7,88 2,44 D.P.I. = desvio do peso ideal; D.P. = desvio padrão

80 Procedimento do ensaio de biodisponibilidade Delineamento do estudo No estudo clínico os voluntários receberam os três tratamentos empregados em sequência (Fase 1, Fase 2 e Fase 3). As soluções de metoprolol foram administradas em três regimes diferentes, que simulam diferentes velocidades de liberação do fármaco a partir de uma forma farmacêutica. Durante a Fase 1 do estudo, os voluntários receberam uma dose única de 100 mg de tartarato de metoprolol (Tratamento 1). Na Fase 2 a dose única de 100 mg foi administrada em duas tomadas de 50 mg de tartarato de metoprolol com intervalo de 30 minutos entre elas (Tratamento 2). Finalmente, na Fase 3 os voluntários receberam a dose única de 100 mg de tartarato de metoprolol em cinco tomadas de 20mg a cada 30 minutos (Tratamento 3). Entre as três fases do estudo houve um período de wash out adequado, correspondente a, no mínimo, 10 vezes o valor da meia-vida de eliminação do metoprolol Local, forma de internação dos voluntários e alimentação As internações dos voluntários selecionados para os estudos clínico aconteceram no período de agosto a setembro de Os voluntários do estudo clínico foram internados às 6:30h da manhã de cada fase do ensaio no Hospital Universitário da USP. Todos compareceram em jejum de pelo menos 8 horas. A administração das soluções contendo metoprolol ocorreu a partir das 7:00 horas. Os voluntários permaneceram 4 horas em jejum após a administração do medicamento, totalizando 12 horas de jejum. O tempo de permanência no local do ensaio foi de aproximadamente 9

81 53 horas, para coletas até a oitava hora após o início da administração do medicamento. Durante o período de internação foram oferecidos aos voluntários duas refeições padronizadas (almoço e lanche). Os voluntários foram orientados a não ingerir bebidas alcoólicas, café e outras bebidas ou alimentos contendo xantinas a partir de 48 horas antes da administração do medicamento em cada uma das fases. Durante o período de internação estas bebidas e alimentos não foram oferecidos. Além disso, foram orientados a não tomarem qualquer medicamento uma semana antes do estudo ou durante sua realização Coleta, processamento e armazenamento das amostras Foram coletadas amostras de 5 ml de sangue em tubo heparinizado a 0:00, 0:30, 1:00, 1:30, 2:00, 2:30, 3:00, 3:30, 4:00, 5:00, 6:00, 7:00, 8:00 horas após o início da administração do medicamento. As amostras de sangue coletadas foram centrifugadas a 3500 rpm por 15 min e o plasma obtido foi transferido a tubos de polipropileno e congelados a -20 C em congelador até a realização do ensaio para quantificação do metoprolol e seus enantiômeros Avaliação da Biodisponibilidade Após a quantificação do metoprolol total e seus enantiômeros nas amostras de plasma provenientes do estudo clínico, a biodisponibilidade foi determinada através da avaliação dos parâmetros farmacocinéticos de absorção do fármaco (Ritschel, 1992; Shargel, Yu, 1992):

82 54 Os parâmetros avaliados foram: Parâmetros relacionados à velocidade de absorção do fármaco: C máx : concentração plasmática máxima que o fármaco atinge após a administração, determinada diretamente a partir das curvas de concentração plasmática versus tempo; T máx : tempo necessário para C máx, determinado diretamente a partir das curvas de concentração plasmática versus tempo. Parâmetros relacionados à quantidade de fármaco absorvida: ASC 0-t : área parcial sob a curva concentração plasmática versus tempo do tempo zero ao tempo da última concentração quantificável, determinada pelo método dos trapezóides; ASC 0-inf : área total sob a curva concentração plasmática versus tempo do tempo zero extrapolada ao infinito, determinada pelo método dos trapezóides, do tempo zero ao tempo da última concentração quantificável, e por extrapolação do tempo da última concentração quantificável a infinito, ou seja, ASC 0-t + C t /k el, no qual C t é a última concentração quantificável experimentalmente e k el é a constante de eliminação da fase terminal. Parâmetros farmacocinéticos relativos à eliminação: t (1/2)el : meia-vida de eliminação plasmática do fármaco, determinada a partir da fórmula: t( 1/ 2) el = 0,693 k el

83 55 k el : constante de velocidade de eliminação do fármaco (β), determinada a partir de equação que define a parte terminal de decaimento plasmático em função do tempo. t (1/2)el : meia-vida de eliminação plasmática do fármaco; k el : constante de velocidade de eliminação do fármaco Analise estatística As concentrações plasmáticas de (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros e os parâmetros farmacocinéticos obtidos para os diferentes tratamentos empregados foram comparados utilizando analise de variância (ANOVA) com intervalo de confiança de 95% (I.C. 95 %). Os testes estatísticos foram realizados com o auxílio do software STATISTICA (StatSoft. Inc., USA). Foi realizada análise de variância (ANOVA), para os parâmetros farmacocinéticos C máx, T máx, t (1/2) e ASC 0-t para (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros referentes aos três esquemas de administração, seguindo o modelo não compartimental. Foi considerado nível de significância (p) menor que 0,05. Os parâmetros farmacocinéticos foram adicionalmente analisados por teste post hoc (método de Scheffé) para discernir diferenças específicas entre os tratamentos empregados..

84 5. RESULTADOS

85 Desenvolvimento e validação de método bioanalítico para quantificação de (R,S)-metoprolol em plasma humano O método desenvolvido para quantificação de metoprolol total em amostras de plasma apresentou especificidade, recuperação, limite de quantificação, linearidade, precisão e exatidão dentro dos limites estabelecidos Especificidade O método desenvolvido demonstrou-se específico para o fármaco metoprolol e o padrão interno ofloxacino, obtendo-se boa separação destes entre si e dos componentes do plasma, com tempos de retenção de 8,0 e 4,0 minutos respectivamente (Figura 3 e 4). Figura 3: Cromatograma referente a amostra de plasma branco.

86 58 Figura 4: Cromatograma referente a amostra de plasma fortificada com os padrões de metoprolol (8 min) e ofloxacino (4 min) Recuperação A recuperação média do processo de purificação utilizado para quantificação de metoprolol em amostras de plasma foi de 71,26% para o metoprolol (analito) com precisão e exatidão dentro dos limites especificados, conforme detalhado na Tabela 1. Tabela.1 Recuperação média de processo de purificação das amostras de plasma para metoprolol. Cada valor representa a média de seis determinações Amostra de plasma CQ Concentração de Metoprolol Recuperação CQB 10 ng.ml -1 67,30 % CQM 200 ng.ml -1 70,40 % CQA 400 ng.ml -1 76,10 %

87 Limite de Quantificação O limite de quantificação do método foi 5 ng.ml -1, com precisão e exatidão de 10,13 % e 88,81 %, respectivamente Linearidade O método mostrou-se linear entre as concentrações de 5 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. A Figura 5 e a Tabela 2 apresentam a curva de calibração e seus parâmetros, respectivamente. 20,0 15,0 Razão P/PI 10,0 5,0 y = 0,0349x + 0,5796 R² = 0,9993 0,0-5, Concentração (ng.ml -1 ) Figura.5 Curva de calibração do metoprolol total em plasma na faixa de concentração de 5 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Cada valor representa uma média de seis determinações

88 60 Tabela 2 Parâmetros relativos a curva de calibração do método bioanalítico para quantificação de metoprolol total em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência na faixa de concentração de 5 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Parâmetro Valor Inclinação (a) 0,0349 Intercepto (b) 0,5796 Coeficiente de determinação (r 2 ) 0, Precisão A precisão variou entre 3,76 a 5,71% para amostras analisadas no mesmo dia (intra-dia) e entre 3,76 a 6,06 % para amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias), conforme apresentado na Tabela 3. Tabela 3 Precisão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação de metoprolol total em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de determinações para precisão intra-dia e para inter-dias. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Intra-dias Precisão Inter-dias CQB 10 ng.ml -1 5,71 6,06 CQM 200 ng.ml -1 3,76 4,49 CQA 400 ng.ml -1 3,78 3,76

89 Exatidão A exatidão variou entre 90,28 a 95,67 % para amostras analisadas no mesmo dia (intra-dia) e entre 91,29 a 96,68 % para amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias), conforme apresentado na Tabela 4. Tabela 4 Exatidão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação de metoprolol total em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de seis determinações para exatidão intra-dia e dezoito determinações para inter-dias. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Intra-dias Exatidão Inter-dias CQB 20 ng.ml -1 90,28 91,29 CQM 200 ng.ml -1 95,67 96,68 CQA 400 ng.ml -1 94,02 95, Estabilidade Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento As amostras de plasma de controle de qualidade mantiveram-se estáveis por até três ciclos de congelamento a - 20 C e descongelamento à temperatura ambiente, como observado nas Tabelas 5, 6 e 7.

90 62 Tabela 5 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após um ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 1). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng.ml -1 ) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Ciclo 1 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 10 9,55 1,84 95,55 9,35 2,06 93,51 0,19 CQM ,96 6,42 99,48 196,08 5,93 98,04 11,63 CQA ,14 5,91 95,28 377,11 5,82 94,28 11,93 Tabela 6 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após dois ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 2). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng.ml -1 ) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Ciclo 2 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 10 9,55 1,84 95,55 9,18 9,72 91,81 0,89 CQM ,96 6,42 99,48 199,88 1,72 99,94 3,45 CQA ,14 5,91 95,28 403,43 15,28 100,86 1,63

91 63 Tabela 7 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após três ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 3). Cada resultado representa a média de três determinações Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0 horas) Ciclo 3 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 10 9,55 1,84 95,55 9,18 4,09 91,83 0,38 CQM ,96 6,42 99,48 181,75 5,76 90,87 0,47 CQA ,14 5,91 95,28 389,27 0,66 97,32 2, Estabilidade de curta duração As amostras de plasma de controle de qualidade apresentaram estabilidade adequada para a condução do estudo como observado na Tabela 8.

92 64 Tabela 8 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade submetidas ao processo de purificação imediatamente após o preparo (tempo 0h) e submetidas ao processo de purificação 4 horas após o descongelamento (tempo 4h). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Estabilidade de curta (Tempo 4h) Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 10 9,55 1,84 95,55 9,32 5,89 93,23 0,55 CQM ,96 6,42 99,48 189,58 5,39 94,79 10,21 CQA ,14 5,91 95,28 393,92 3,07 98,48 2, Estabilidade pós-processamento Os resultados obtidos para a estabilidade pós-processamento são apresentados na Tabela 9, podendo-se observar resultados satisfatórios para a finalidade do estudo.

93 65 Tabela 9 Estabilidade do metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o processo de purificação (tempo 0h) e 24h após o processo de purificação. Cada resultado representa a média de três determinações Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Estabilidade de curta (Tempo 4h) Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 10 9,55 1,84 95,55 9,30 10,08 93,00 0,94 CQM ,96 6,42 99,48 201,86 2,06 100,93 4,15 CQA ,14 5,91 95,28 409,47 15,46 102,37 3, Estabilidade das soluções padrão de trabalho As soluções padrão de trabalho de metoprolol mantiveram-se estáveis após 6 horas de seu preparo e durante toda a etapa analítica. Os resultados obtidos apresentaram-se dentro dos limites especificados, com desvio médio de 2,46 % para o metoprolol, após 6 horas de seu preparo.

94 Desenvolvimento e validação de método quiral para quantificação de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em plasma humano O método enantioseletivo desenvolvido para a quantificação quiral do metoprolol em amostras de plasma apresentou boa separação para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol, como observado na Figura 6. O método apresentou especificidade, recuperação, limite de quantificação, linearidade, precisão e exatidão dentro dos limites estabelecidos (Brasil, 2003c). Figura 6: Cromatograma referente a amostra de plasma branco, obtida por método quiral.

95 Especificidade O método desenvolvido demonstrou-se específico para ambos os enantiômeros do fármaco metoprolol, obtendo-se boa separação destes entre si e dos componentes do plasma, com tempos de retenção de 6,0 minutos para (R)-metoprolol e 8,0 minutos para (S)-metoprolol (Figura 7). Figura 7 Cromatograma referente a separação quiral, mostrando (R)-metoprolol em 6,0 minutos e (S)-metoprolol em 8,0 minutos Recuperação A recuperação média do processo de purificação utilizado para quantificação de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em amostras de plasma foi de 66,33 % e 66,00% respectivamente, com precisão e exatidão dentro dos limites especificados, conforme detalhado nas Tabelas 10 e 11.

96 68 Tabela.10 Recuperação média de processo de purificação das amostras de plasma para o enantiômero (R)-metoprolol. Cada valor representa a média de seis determinações. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Recuperação CQB 20 ng.ml -1 62,3 % CQM 200 ng.ml -1 66,2 % CQA 400 ng.ml -1 70,5 % Tabela.11 Recuperação média de processo de purificação das amostras de plasma para o enantiômero (S)-metoprolol. Cada valor representa a média de seis determinações. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Recuperação CQB 20 ng.ml -1 63,0 % CQM 200 ng.ml -1 64,4 % CQA 400 ng.ml -1 70,6 %

97 Limite de Quantificação O limite de quantificação do método foi 10 ng.ml -1 para ambos os enantiômeros, com precisão de 11,80 % e 11,54 % e exatidão de 74,88 % e 77,66% para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente Linearidade O método mostrou-se linear entre as concentrações de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1, para ambos os enantiômeros. As Figura 8 e 9 apresentam as curvas de calibração para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente, e as Tabelas 12 e 13 mostram os parâmetros obtidos a partir das curvas para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol, respectivamente. 25,00 20,00 Razão P/PI 15,00 10,00 5,00 0,00-5,00 y = 0,0414x + 0,6496 R² = 0, Concentração (ng.ml -1 ) Figura 8 Curva de calibração para o (R)-metoprolol em plasma na faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Cada valor representa uma média de seis determinações

98 70 Tabela 12 Parâmetros relativos a curva de calibração do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência na faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Parâmetro Valor Inclinação (a) 0,0414 Intercepto (b) 0,6496 Coeficiente de determinação (r 2 ) 0, ,0 20,0 Razão P/PI 15,0 10,0 5,0 0,0-5,0 y = 0,0427x + 0,8025 R² = 0, Concentração (ng.ml -1 ) Figura 9 Curva de calibração para o (S)-metoprolol em plasma na faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Cada valor representa uma média de seis determinações

99 71 Tabela 13 Parâmetros relativos a curva de calibração do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência na faixa de concentração de 10 ng.ml -1 a 500 ng.ml -1. Parâmetro Valor Inclinação (a) 0,0427 Intercepto (b) 0,8025 Coeficiente de determinação (r 2 ) 0, Precisão Para o enantiômero (R)-metoprolol a precisão variou entre 5,6 % a 8,69 % para amostras analisadas no mesmo dia (intra-dia) e entre 5,99 % a 8,33 % para amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias), conforme apresentado na Tabela 14, já para o enantiômero (S)-metoprolol a precisão variou entre 4,75 % a 9,01 % para amostras analisadas no mesmo dia (intradia) e entre 5,25 % a 10,07 % para amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias), conforme apresentado na Tabela 15.

100 72 Tabela 14 Precisão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de determinações para precisão intra-dia e para inter-dias. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Intra-dias Precisão Inter-dias CQB 20 ng.ml -1 8,69 8,33 CQM 200 ng.ml -1 6,72 6,85 CQA 400 ng.ml -1 5,6 5,99 Tabela 15 Precisão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de determinações para precisão intra-dia e para inter-dias. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Intra-dias Precisão Inter-dias CQB 20 ng.ml -1 9,01 10,07 CQM 200 ng.ml -1 7,18 7,37 CQA 400 ng.ml -1 4,75 5,25

101 Exatidão Para o enantiômero (R)-metoprolol a exatidão variou entre 84,62 % a 86,69 % para amostras analisadas no mesmo dia (intra-dia) e entre 84,63 % a 86,70 % para amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias), conforme apresentado na Tabela 16, já para o enantiômero (S)-metoprolol a exatidão variou entre 82,68 % a 84,84 % para amostras analisadas no mesmo dia (intradia) e entre 82,63 % a 84,85 % para amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias), conforme apresentado na Tabela 17. Tabela 16 Exatidão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de seis determinações para exatidão intra-dia e dezoito determinações para inter-dias. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Intra-dias Exatidão Inter-dias CQB 20 ng.ml -1 84,90 84,91 CQM 200 ng.ml -1 86,69 86,70 CQA 400 ng.ml -1 84,62 84,63 Tabela 17 Exatidão intra-dia e inter-dias do método bioanalítico para quantificação do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. Cada valor representa a média de seis determinações para exatidão intra-dia e dezoito determinações para inter-dias. Amostra de plasma CQ Concentração de metoprolol Intra-dias Exatidão Inter-dias CQB 20 ng.ml -1 82,68 82,63 CQM 200 ng.ml -1 84,84 84,85 CQA 400 ng.ml -1 84,33 84,33

102 Estabilidade Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento As amostras de plasma de controle de qualidade de ambos os enantiômero mantiveram-se estáveis por até três ciclos de congelamento a - 20 C e descongelamento à temperatura ambiente, e são observados nas tabelas 18, 19 e 20, e 21, 22 e 23 respectivamente. Tabela 18 Estabilidade do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após um ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 1). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng.ml -1 ) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Ciclo 1 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 20,86 10,93 104,35 21,89 3,80 109,45 3,80 CQM ,09 14,27 88,54 175,75 8,81 87,87 10,48 CQA ,48 9,77 83,87 345,60 0,80 86,40 2,77

103 75 Tabela 19 Estabilidade do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após dois ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 2). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng.ml -1 ) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Ciclo 2 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 20,86 10,93 104,35 20,44 3,37 102,20 0,69 CQM ,09 14,27 88,54 183,84 4,27 91,92 7,85 CQA ,48 9,77 83,87 348,72 3,98 87,18 3,90 Tabela 20 Estabilidade do enantiômero (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após três ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 3). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0 horas) Ciclo 3 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 20,86 10,93 104,35 18,09 7,86 90,45 7,89 CQM ,09 14,27 88,54 173,21 5,64 86,60 5,64 CQA ,48 9,77 83,87 327,88 7,23 81,97 7,23

104 76 Tabela 21 Estabilidade do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após um ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 1). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng.ml -1 ) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Ciclo 1 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 16,25 3,95 81,26 15,10 2,75 75,53 0,42 CQM ,97 4,40 93,98 176,36 11,93 88,18 1,04 CQA ,16 3,26 91,54 358,66 0,81 89,66 2,92 Tabela 22 Estabilidade do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após dois ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 2). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng.ml -1 ) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Ciclo 2 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 16,25 3,95 81,26 15,74 4,96 78,74 0,78 CQM ,97 4,40 93,98 180,84 14,75 90,42 6,67 CQA ,16 3,26 91,54 362,38 6,18 90,60 2,41

105 77 Tabela 23 Estabilidade do enantiômero (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o preparo (tempo 0h) e após três ciclo de congelamento/descongelamento (ciclo 3). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0 horas) Ciclo 3 Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 16,25 3,95 81,26 16, ,28 1,63 CQM ,97 4,40 93,98 176,75 5,83 88,37 10,30 CQA ,16 3,26 91,54 339,97 7,35 84,99 5, Estabilidade de curta duração A estabilidade de curta duração para os enatiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol foram determinadas mantendo-se amostras de plasma de controle de qualidade descongeladas à temperatura ambiente por 4 horas. Após este período as amostras foram processadas e analisadas. Os resultados obtidos foram comparados aos das amostras recém-preparadas (tempo 0h), admitiram-se desvios entre + 15% (Tabela 24 e 25 respectivamente).

106 78 Tabela 24 Estabilidade do (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade submetidas ao processo de purificação imediatamente após o preparo (tempo 0h) e submetidas ao processo de purificação 4 horas após o descongelamento (tempo 4h). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Estabilidade de curta (Tempo 4h) Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 20,86 10,93 104,35 16,58 7,57 82,92 1,26 CQM ,09 14,27 88,54 176,96 10,60 88,48 8,76 CQA ,48 9,77 83,87 327,27 6,17 81,82 0,21 Tabela 25 Estabilidade do (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade submetidas ao processo de purificação imediatamente após o preparo (tempo 0h) e submetidas ao processo de purificação 4 horas após o descongelamento (tempo 4h). Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Estabilidade de curta (Tempo 4h) Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 16,25 3,95 81,26 16,77 3,39 83,88 10,09 CQM ,97 4,40 93,98 171,95 8,76 85,97 5,06 CQA ,16 3,26 91,54 330,40 4,26 82,60 0,57

107 Estabilidade pós-processamento A estabilidade pós-processamento de ambos os enantiômeros foi determinada por meio da comparação dos resultados de análises de amostras de controle de qualidade submetidas ao processo de purificação e mantidas à temperatura de 4ºC antes do início da análise cromatográfica por 24 horas (tempo 24h) com os resultados de amostras submetidas à análise cromatográfica imediatamente após o processo de purificação (tempo 0h). Admitiram-se desvios entre ± 15%. Tabelas 26 e 27 para os resultados obtidos para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente. Tabela 26 Estabilidade do (R)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o processo de purificação (tempo 0h) e 24h após o processo de purificação. Cada resultado representa a média de três determinações Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Estabilidade de curta (Tempo 4h) Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 20,86 10,93 104,35 16,43 10,74 82,19 1,77 CQM ,09 14,27 88,54 179,53 5,39 89,77 9,68 CQA ,48 9,77 83,87 325,59 4,51 81,40 4,69

108 80 Tabela 27 Estabilidade do (S)-metoprolol em amostras de plasma de controle de qualidade analisadas imediatamente após o processo de purificação (tempo 0h) e 24h após o processo de purificação. Cada resultado representa a média de três determinações. Amostra de plasma de CQ Conc. nominal (ng/ml) Amostras recém-preparadas (Tempo 0h) Estabilidade de curta (Tempo 4h) Desvio (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) Conc. det. (ng/ml) Precisão (%) Exatidão (%) CQB 20 16,25 3,95 81,26 16,01 2,62 80,09 0,42 CQM ,97 4,40 93,98 174,67 4,82 87,33 8,41 CQA ,16 3,26 91,54 342,51 3,39 85, Estabilidade das soluções padrão As soluções padrão de trabalho dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)- metoprolol mantiveram-se estáveis após 6 horas de seu preparo e durante toda a etapa analítica. Os resultados obtidos apresentaram-se dentro dos limites especificados, com desvio médio de 3,24 e 2,96 % respectivamente, após 6 horas de seu preparo.

109 Quantificação de (R,S)-metoprolol em amostras de plasma humano As amostras de plasma provenientes do estudo clínico do metoprolol foram analisadas nas condições determinadas na validação do método Concentrações plasmáticas médias de (R,S)-metoprolol As concentrações plasmáticas médias de (R,S)-metoprolol após administração oral do fármaco estão apresentadas nas tabelas a seguir. Na Fase 1 foi administrada a dose total de metoprolol em uma única tomada (Tabela 26), na Fase 2 a dose total de metoprolol foi particionada em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas (Tabela 27), e para a Fase 3 houve a partição da dose de metoprolol em 5 tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas (tabela 28).

110 82 Tabela 26 Concentrações plasmáticas médias do metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado Concentrações plasmáticas de metoprolol (ng.ml -1 ) - Fase 1 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0, ,50 147,93 21,93 14,82 1,00 213,94 17,03 7,96 1,50 210,42 40,18 19,10 2,00 169,12 31,72 18,76 2,50 132,76 19,52 14,70 3,00 108,87 15,29 14,04 3,50 87,02 13,16 15,13 4,00 68,53 12,40 18,10 5,00 46,62 10,23 21,94 6,00 24,11 8,61 35,71 7,00 8,34 2,44 29,27 8,00 NQ 0,0 0,0

111 83 Tabela 27 Concentrações plasmáticas médias do metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de metoprolol (ng.ml -1 ) - Fase 2 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 75,29 9,66 12,83 1,00 150,99 20,00 13,25 1,50 229,18 29,63 12,93 2,00 220,91 37,32 16,89 2,50 167,53 27,25 16,27 3,00 130,59 16,84 12,89 3,50 111,18 11,31 10,17 4,00 95,15 10,67 11,21 5,00 71,41 11,31 15,83 6,00 51,91 7,43 14,31 7,00 26,36 5,06 19,21 8,00 NQ 0,0 0,0

112 84 Tabela 28 Concentrações plasmáticas médias do metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de metoprolol (ng.ml -1 ) - Fase 3 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 24,61 5,36 21,79 1,00 68,40 8,65 12,64 1,50 104,81 15,41 14,71 2,00 145,07 39,89 27,50 2,50 193,78 19,57 10,10 3,00 165,41 21,78 13,17 3,50 135,23 22,29 16,48 4,00 105,98 11,75 11,09 5,00 85,91 11,16 12,99 6,00 65,29 8,50 13,01 7,00 43,33 7,46 17,22 8,00 18,68 6,83 36,59

113 Curvas médias de decaimento plasmático versus tempo para (R,S)-metoprolol As curvas médias de decaimento plasmático referentes as Fases 1, 2 e 3 estão apresentadas nas figuras 10, 11 e 12 respectivamente. Concentração (ng.ml -1 ) Metoprolol (Fase 1) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Tempo (h) Figura 10 Curva média de concentração plasmática do metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios.

114 86 Concentração ng.ml -1 ) Metoprolol (Fase 2) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Tempo (h) Figura 11 Curva média de concentração plasmática do metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Concentração (ng.ml -1 ) Metoprolol (Fase 3) ,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Tempo (h) Figura 12 Curva média de concentração plasmática do metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios.

115 Parâmetros farmacocinéticos para o (R,S)-metoprolol As Tabelas 29, 30 e 31 apresentam os parâmetros farmacocinéticos C máx, T máx, t (1/2)el, ASC 0-t e ASC 0-inf e a relação percentual entre os valores de ASC 0-t e ASC 0-inf para o metoprolol total, Fase 1, 2 e 3 respectivamente.

116 88 Tabela 29 Parâmetros farmacocinéticos para o metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. metoprolol (FASE 1) Voluntários C max t max T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ngxh.ml -1 ) (ngxh.ml -1 ) 1 218,84 1,00 0,94 690,07 700,80 98, ,61 1,50 0,83 687,02 693,93 99, ,89 1,50 1,21 700,10 720,41 97, ,76 1,50 0,91 764,84 772,52 99, ,38 1,00 0,92 694,52 704,63 98, ,19 1,00 1,53 577,19 609,03 94, ,14 1,00 1,21 607,19 625,62 97, ,68 1,50 0,76 793,17 800,62 99, ,69 1,00 1,03 697,85 712,78 97, ,60 1,00 1,13 601,15 616,64 97, ,76 1,00 0,89 669,57 677,99 98, ,47 1,50 0,81 673,59 680,67 98, ,49 1,50 1,02 659,22 672,99 97, ,49 1,50 1,03 764,59 778,59 98, ,63 1,00 0,80 592,17 597,46 99, ,00 1,00 0,96 543,89 552,28 98, ,04 1,00 1,10 618,62 631,61 97, ,36 1,00 0,99 699,61 714,40 97, ,83 1,00 1,00 649,86 664,00 97, ,56 1,00 0,96 577,31 585,88 98,54 Média 232,82 1,18 1,00 663,08 675,64 98,11 D.P 25,97 0,24 0,18 67,68 66,58 1,00 C.V. (%) 11,15 20,82 17,70 10,21 9,85 1,02

117 89 Tabela 30 Parâmetros farmacocinéticos para o metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. metoprolol (FASE 2) Voluntários C max t max T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ngxh.ml -1 ) (ngxh.ml -1 ) 1 232,86 1,50 1,51 766,99 823,21 93, ,39 1,50 1,90 894,76 917,84 97, ,57 1,50 1,65 720,45 742,50 97, ,26 1,50 1,72 707,47 717,10 98, ,17 2,00 1,37 791,41 809,67 97, ,53 2,00 1,89 690,71 711,06 97, ,63 2,00 1,51 738,59 750,58 98, ,23 1,50 1,97 811,10 828,56 97, ,47 1,50 1,73 833,47 846,27 98, ,12 2,00 1,56 805,36 826,35 97, ,71 1,50 1,32 795,25 807,65 98, ,46 1,50 1,48 730,56 744,49 98, ,76 1,50 1,51 710,29 733,31 96, ,72 1,50 1,63 662,21 682,61 97, ,06 1,50 1,56 714,99 756,52 94, ,86 2,00 1,69 748,59 755,56 99, ,14 2,00 1,30 828,92 836,69 99, ,51 1,50 1,74 765,49 790,32 96, ,39 1,50 1,83 791,40 808,40 97, ,84 2,00 1,70 840,69 849,79 98,93 Média 247,73 1,68 1,63 767,43 786,92 97,51 D.P 24,00 0,24 0,19 59,08 58,27 1,47 C.V. (%) 9,69 14,61 11,64 7,70 7,40 1,50

118 90 Tabela 31 Parâmetros farmacocinéticos para o metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. metoprolol (FASE 3) Voluntários C max t max T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ngxh.ml -1 ) (ngxh.ml -1 ) 1 167,47 2,50 1,82 601,72 633,42 95, ,34 2,50 1,77 694,51 719,00 96, ,47 2,50 2,14 730,13 803,74 90, ,42 2,50 2,09 644,49 712,70 90, ,19 2,50 2,03 682,19 731,36 93, ,30 2,00 2,27 689,91 761,82 90, ,88 2,00 3,32 713,70 814,76 87, ,09 2,50 2,02 715,86 744,15 96, ,87 2,50 2,27 704,88 733,41 96, ,61 2,50 2,12 737,63 822,11 89, ,45 2,50 2,17 692,89 765,33 90, ,00 2,50 2,27 757,47 821,50 92, ,88 2,50 2,48 704,77 810,24 86, ,13 2,50 2,50 706,84 766,05 92, ,76 2,50 2,72 666,69 743,94 89, ,82 2,50 2,88 691,99 763,10 90, ,98 2,00 3,00 658,73 723,46 91, ,23 2,50 2,03 716,72 737,98 97, ,88 2,50 2,99 766,86 859,52 89, ,67 2,50 2,54 762,11 874,27 87,17 Média 201,22 2,43 2,37 702,01 767,09 91,66 D.P 14,56 0,18 0,42 40,27 56,62 3,14 C.V. (%) 7,24 7,55 17,84 5,74 7,38 3,43

119 Quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)- metoprolol em amostras de plasma humano As amostras de plasma provenientes dos estudo clínico do metoprolol foram processadas e analisadas por dois métodos bianalíticos, um para a quantificação do fármaco total, utilizando método convencional por CLAE, e outro utilizando método enantioseletivo, também utilizando CLAE, nas condições determinadas na validação do método. Aseguir são observados os dados obtidos para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol e (S)-metoprolol As concentrações plasmáticas médias obtidas para (R)-metoprolol e (S)- metoprolol, após administração das soluções, estão apresentados nas tabelas a seguir. Na Fase 1 do estudo clínico a dose única de metoprolol foi administrada em uma única tomada (Tabelas 32 e 33), na Fase 2 a dose total de metoprolol foi particionada em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas (Tabelas 34 e 35), e para a Fase 3 houve a partição da dose de metoprolol em 5 tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas (Tabelas 36 e 37).

120 92 Tabela 32 Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de (R)- metoprolol(ng.ml -1 ) - Fase 1 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0, ,50 111,50 1,73 1,55 1,00 153,59 13,02 8,48 1,50 137,38 1,98 1,44 2,00 105,12 1,38 1,31 2,50 95,42 2,29 2,40 3,00 83,43 1,99 2,39 3,50 65,82 2,16 3,28 4,00 49,23 2,24 4,56 5,00 31,87 1,52 4,76 6,00 19,42 1,83 9,44 7,00 NQ NQ NQ 8,00 NQ NQ NQ

121 93 Tabela 33 Concentrações plasmáticas médias de (S)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de (S)- metoprolol(ng.ml -1 ) - Fase 1 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0, ,50 96,91 8,67 8,94 1,00 122,31 8,02 6,55 1,50 109,23 10,25 9,38 2,00 97,34 8,16 8,38 2,50 77,94 3,97 5,10 3,00 69,16 5,45 7,87 3,50 58,86 5,80 9,85 4,00 46,23 5,21 11,27 5,00 30,36 2,02 6,66 6,00 17,46 2,32 13,31 7,00 NQ NQ NQ 8,00 NQ NQ NQ

122 94 Tabela 34 Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de (R)- metoprolol(ng.ml -1 ) - Fase 2 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 56,69 1,76 3,11 1,00 91,95 1,53 1,67 1,50 153,31 19,71 12,86 2,00 147,06 14,47 9,84 2,50 108,31 1,79 1,66 3,00 87,40 2,01 2,30 3,50 79,65 1,58 1,98 4,00 69,18 2,02 2,91 5,00 51,12 1,63 3,18 6,00 32,50 1,44 4,42 7,00 18,49 1,61 8,69 8,00 NQ NQ NQ

123 95 Tabela 35 Concentrações plasmáticas médias de (S)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de (S)- metoprolol(ng.ml -1 ) - Fase 2 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 52,06 2,67 5,12 1,00 91,02 9,67 10,63 1,50 143,60 21,52 14,99 2,00 125,10 8,38 6,69 2,50 100,53 6,09 6,06 3,00 74,44 6,32 8,49 3,50 66,57 5,13 7,70 4,00 60,21 4,00 6,65 5,00 43,39 6,46 14,89 6,00 31,42 3,13 9,96 7,00 17,53 2,78 15,84 8,00 NQ NQ NQ

124 96 Tabela 36 Concentrações plasmáticas médias de (R)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de (R)- metoprolol(ng.ml -1 ) - Fase 3 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 12,21 1,59 13,03 1,00 40,40 1,55 3,84 1,50 61,81 1,56 2,52 2,00 63,74 1,75 2,74 2,50 114,23 1,69 1,48 3,00 103,05 1,54 1,49 3,50 72,84 1,51 2,07 4,00 61,45 1,95 3,17 5,00 41,68 1,48 3,55 6,00 32,93 1,83 5,56 7,00 18,93 1,98 10,45 8,00 NQ NQ NQ

125 97 Tabela 37 Concentrações plasmáticas médias de (S)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; NQ = não quantificado. Concentrações plasmáticas de (S)- metoprolol(ng.ml -1 ) - Fase 3 Tempo (h) Média DP CV% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 11,57 1,91 16,54 1,00 38,50 3,57 9,28 1,50 56,37 3,62 6,42 2,00 60,73 5,27 8,68 2,50 106,58 7,70 7,23 3,00 94,26 10,39 11,02 3,50 80,35 6,78 8,44 4,00 67,44 5,72 8,48 5,00 45,78 3,19 6,96 6,00 35,62 4,44 12,46 7,00 22,60 2,76 12,19 8,00 NQ NQ NQ

126 Curvas médias de decaimento plasmático versus tempo para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol As curvas médias de decaimento plasmático referentes as Fases 1, 2 e 3 estão apresentadas nas figuras 13, 15 e 17 para (R)-metoprolol e 14, 16 e 18 para (S)-metoprolol. Concentração (ng.ml -1 ) R-metoprolol (Fase 1) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Tempo (h) Figura 13 Curva média de concentração plasmática de (R)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios.

127 99 S-metoprolol (Fase 1) Concentração (ng.ml -1 ) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Tempo (h) Figura 14 Curva média de concentração plasmática de (S)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. Concentração ng.ml -1 ) R-metoprolol (Fase 2) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Tempo (h) Figura 15 Curva média de concentração plasmática de (R)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios.

128 100 S-metoprolol (Fase 2) Concentração ng.ml -1 ) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Tempo (h) Figura 16 Curva média de concentração plasmática de (S)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Concentração (ng.ml -1 ) R-metoprolol (Fase 3) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Tempo (h) Figura 17 Curva média de concentração plasmática de (R)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios.

129 101 Concentração (ng.ml -1 ) S-metoprolol (Fase 3) ,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Tempo (h) Figura 18 Curva média de concentração plasmática de (S)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios Parâmetros farmacocinéticos para os enantiômeros (R)- metoprolol e (S)-metoprolol As Tabelas 38, 40 e 42 apresentam os parâmetros farmacocinéticos C máx, T máx, t (1/2)el, ASC 0-t e ASC 0-inf e a relação percentual entre os valores de ASC 0-t e ASC 0-inf para o enantiômeros (R)-metoprolol, Fase 1, 2 e 3 respectivamente. As Tabelas 39, 41 e 43 apresentam os mesmos parâmetros farmacocinéticos citados acima para o enantiômeros (R)-metoprolol, Fase 1, 2 e 3 respectivamente.

130 102 Tabela 38 Parâmetros farmacocinéticos para o (R)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. (R)- metoprolol (FASE 1) Voluntários C máx T máx T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ng.h.ml -1 ) (ng.h.ml -1 ) 1 147,72 1,00 0,93 469,41 470,94 99, ,88 1,00 0,82 458,14 460,54 99, ,71 1,00 0,70 454,08 456,65 99, ,61 1,00 0,94 472,89 476,11 99, ,59 1,00 1,02 489,27 493,26 99, ,88 1,00 0,88 478,52 481,32 99, ,54 1,00 0,81 456,85 459,83 99, ,74 1,00 0,78 455,78 458,15 99, ,89 1,00 0,92 474,51 477,68 99, ,14 1,00 0,84 456,69 457,91 99, ,03 1,00 1,04 496,78 502,69 98, ,49 1,00 0,94 472,55 478,11 98, ,53 1,00 0,68 450,74 452,68 99, ,41 1,00 0,93 487,56 491,20 99, ,58 1,00 1,04 506,04 512,48 98, ,67 1,00 0,93 495,67 499,14 99, ,14 1,00 0,83 467,74 470,98 99, ,37 1,00 0,94 471,40 474,89 99, ,49 1,00 0,52 445,08 445,73 99, ,53 1,00 0,68 445,85 447,95 99,53 Média 153,70 1,00 0,86 470,28 473,41 99,35 D.P 13,03 0,00 0,14 17,75 18,96 0,29 C.V. (%) 8,48 0,00 15,73 3,78 4,00 0,29

131 103 Tabela 39 Parâmetros farmacocinéticos para o (S)-metoprolol na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. (S)- metoprolol (FASE 1) Voluntários C máx T máx T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ng.h.ml -1 ) (ngxh.ml -1 ) 1 124,620 1,000 1, , ,791 99, ,349 1,000 0, , ,615 99, ,998 1,000 0, , ,427 99, ,431 1,000 0, , ,018 98, ,707 1,000 1, , ,401 98, ,768 1,500 1, , ,941 99, ,601 1,500 1, , ,572 97, ,269 1,500 1, , ,408 98, ,818 1,000 0, , ,640 99, ,568 1,000 0, , ,766 99, ,587 1,000 1, , ,823 97, ,510 1,000 0, , ,203 99, ,822 1,000 0, , ,864 99, ,109 1,000 1, , ,482 97, ,862 1,000 1, , ,414 97, ,594 1,500 1, , ,734 98, ,808 1,500 1, , ,793 97, ,944 1,500 1, , ,102 97, ,571 1,000 0, , ,602 96, ,606 1,000 0, , ,804 96,450 Média 124,84 1,16 0,95 404,97 412,14 98,27 D.P 5,70 0,24 0,21 15,08 16,13 0,94 C.V. (%) 4,56 20,62 22,63 3,72 3,91 0,96

132 104 Tabela 40 Parâmetros farmacocinéticos para o (R)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. (R)- metoprolol (FASE 2) Voluntários C máx T máx T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ng.h.ml -1 ) (ng.h.ml -1 ) 1 158,42 1,50 1,55 522,40 531,29 98, ,78 1,50 1,56 503,57 510,47 98, ,55 1,50 1,66 506,34 513,06 98, ,13 1,50 1,58 517,46 525,73 98, ,49 1,50 1,69 543,96 559,36 97, ,83 1,50 1,46 522,35 536,06 97, ,75 1,50 1,57 501,30 511,56 97, ,22 2,00 1,54 505,29 509,46 99, ,50 1,50 1,63 522,89 534,32 97, ,19 1,50 1,54 500,43 506,70 98, ,97 1,50 1,66 551,61 566,36 97, ,77 1,50 1,54 519,03 529,28 98, ,73 1,50 1,59 488,38 494,70 98, ,99 1,50 1,64 553,41 565,37 97, ,71 1,50 1,72 576,99 596,94 96, ,99 1,50 1,52 544,28 558,91 97, ,10 2,00 1,53 500,44 511,36 97, ,75 2,00 1,64 537,63 548,93 97, ,49 2,00 1,48 477,60 481,72 99, ,13 2,00 1,40 479,38 485,76 98,69 Média 155,92 1,63 1,58 518,74 528,87 98,12 D.P 16,83 0,22 0,08 26,22 29,92 0,68 C.V. (%) 10,79 13,67 5,06 5,06 5,66 0,69

133 105 Tabela 41 Parâmetros farmacocinéticos para o (S)-metoprolol na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. (S)- metoprolol (FASE 2) Voluntários C máx T máx T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ng.h.ml -1 ) (ng.h.ml -1 ) 1 135,771 1,500 1, , ,074 98, ,625 1,500 1, , ,401 99, ,879 2,000 1, , ,876 99, ,309 1,500 1, , ,918 91, ,709 1,500 1, , ,819 97, ,314 1,500 1, , ,226 99, ,356 1,500 1, , ,518 98, ,598 1,500 2, , ,578 98, ,661 2,000 1, , ,208 91, ,754 2,000 1, , ,016 97, ,488 1,500 1, , ,470 97, ,201 1,500 1, , ,763 99, ,993 2,000 1, , ,566 98, ,540 1,500 1, , ,863 91, ,092 1,500 1, , ,763 97, ,102 1,500 1, , ,182 98, ,190 1,500 1, , ,003 98, ,358 1,500 2, , ,603 97, ,971 2,000 1, , ,971 92, ,662 2,000 1, , ,270 98,539 Média 146,52 1,66 1,71 466,92 481,68 96,99 D.P 20,03 0,24 0,26 24,16 25,97 2,83 C.V. (%) 13,67 14,40 14,91 5,17 5,39 2,91

134 106 Tabela 42 Parâmetros farmacocinéticos para o (R)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. (R)- metoprolol (FASE 3) Voluntários C máx T máx T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ng.h.ml -1 ) (ng.h.ml -1 ) 1 114,77 2,50 1,83 380,18 402,90 94, ,40 2,50 1,73 369,40 387,50 95, ,35 2,50 1,75 369,93 385,99 95, ,95 2,50 1,77 379,35 400,78 94, ,28 2,50 1,86 391,09 417,59 93, ,77 2,50 1,81 380,71 403,04 94, ,25 2,50 1,69 372,58 388,72 95, ,56 2,50 1,74 372,17 389,48 95, ,74 2,50 1,74 378,78 399,44 94, ,35 2,50 1,72 368,02 384,23 95, ,44 2,50 1,86 392,61 419,46 93, ,50 2,50 1,80 381,98 404,13 94, ,18 2,50 1,55 358,44 370,60 96, ,24 2,50 1,90 388,73 416,14 93, ,32 2,50 1,95 402,00 433,86 92, ,30 2,50 1,87 392,20 418,14 93, ,63 2,50 1,80 384,28 406,26 94, ,93 2,50 1,79 383,39 402,77 95, ,06 2,50 1,67 359,72 373,41 96, ,00 2,50 1,47 354,36 366,58 96,67 Média 114,30 2,50 1,77 378,00 398,55 94,89 D.P 1,69 0,00 0,11 12,47 17,76 1,13 C.V. (%) 1,48 0,00 6,40 3,30 4,46 1,19

135 107 Tabela 43 Parâmetros farmacocinéticos para o (S)-metoprolol na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. (S)- metoprolol (FASE 3) Voluntários C máx T máx T (1/2)β ASC 0-t ASC 0- % (ng.ml -1 ) (h) (h) (ng.h.ml -1 ) (ng.h.ml -1 ) 1 97,452 2,500 1, , ,681 93, ,919 2,500 2, , ,165 93, ,422 3,000 2, , ,163 93, ,284 2,500 1, , ,817 96, ,072 2,500 1, , ,230 92, ,405 2,500 2, , ,729 91, ,175 2,500 2, , ,221 95, ,864 2,500 1, , ,612 94, ,646 2,500 1, , ,347 96, ,820 2,500 1, , ,584 95, ,550 2,500 1, , ,420 93, ,161 2,500 1, , ,246 94, ,115 3,000 2, , ,710 93, ,844 2,500 1, , ,493 95, ,772 2,500 2, , ,649 92, ,095 2,500 2, , ,593 90, ,516 2,500 2, , ,811 95, ,003 2,500 1, , ,195 92, ,964 2,500 1, , ,171 97, ,068 2,500 1, , ,881 94,818 Média 107,93 2,55 1,94 384,98 408,69 94,26 D.P 7,25 0,16 0,30 16,88 22,29 1,78 C.V. (%) 6,72 6,18 15,42 4,38 5,45 1,89

136 Análise comparativa dos parâmetros farmacocinéticos de (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros Os perfis médios de concentração plasmática em função do tempo obtidos para o fármaco (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros, a partir dos três diferentes regimes de tratamento empregados, são apresentados nas Figuras 19, 20 e 21. A Tabela 44 mostra as razões entre os enantiômeros (R)- metoprolol e S-metropolol para os parâmetros farmacocinétidos C máx e ASC 0-t. Concentração (ng.ml -1 ) Fase 1 (R,S)-metoprolol R-metoprolol S-metoprolol 0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Tempo (h) Figura 19 Curva média de concentração plasmática em função do tempo para (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros na Fase 1 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco a 20 voluntários sadios.

137 109 Concentração (ng.ml -1 ) Fase 2 (R,S)-metoprolol R-metoprolol S-metoprolol 0 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 Tempo (h) Figura 20 Curva média de concentração plasmática em função do tempo para (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros na Fase 2 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em duas tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios. Concentração (ng.ml -1 ) Fase 3 (R,S)-metoprolol R-metoprolol S-metoprolol 0 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 Tempo (h) Figura 21 Curva média de concentração plasmática em função do tempo para (R,S)-metoprolol e seus enantiômeros na Fase 3 do estudo clínico, após administração de dose única do fármaco, em cinco tomadas com intervalo de 30 minutos entre elas, a 20 voluntários sadios.

138 110 Tabela 44 Razão entre os parâmetros farmacocinéticos médios de ASC 0-t e C máx para os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol. ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) C máx (ng.ml -1 ) F 1 F 2 F 3 F 1 F 2 F 3 (R,S)-metoprolol 663,08 767,43 702,01 232,82 247,73 201,22 (R)-metoprolol 470,28 518,74 378,00 153,70 155,92 114,30 (S)-metoprolol 404,97 466,92 384,98 124,84 146,52 107,93 Razão R/S 1,16 1,11 0,98 1,23 1,06 1,06 % 16,1 11,1 1,8 23,1 6,4 5,9 5.6 Análise estatística Os resultados da análise de variância (ANOVA) com análise post hoc para os parâmetros farmacocinéticos de Cmax, Tmax, t(1/2) e ASC 0-t para o (R,S)-metoprolol e os enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol são mostrados nas Tabelas 45, 47 e 49 respectivamente, para os três diferentes regimes de tratamento empregados. As Tabelas 46, 48 e 50 monstram os dados de intervalo de confiança para (R,S)-metoprolol, (R)-metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente, para os três diferentes regimes de tratamento empregados. As Figuras 22, 23 e 24 apresentam os gráficos de C máx em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico e o gráfico de ASC em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico, para (R,S)-metoprolol, (R)- metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente, para os três diferentes regimes de tratamento empregados, com intervalo de confiança de 95%.

139 111 As Tabelas 51 e 53 mostram os resultados da análise de variância (ANOVA) com análise post hoc para os parâmetros farmacocinéticos de Cmax, Tmax, t(1/2) e ASC 0-t para as razões de (R,S)-metoprolol sobra (R)-metoprolol e (S)-metoprolol, respectivamente, para os três diferentes regimes de tratamento empregados. Nas Tabelas 52 e 54 são apresentados os dados de intervalo de confiança para as razões de (R,S)-metoprolol sobra (R)-metoprolol e (S)- metoprolol, respectivamente, para os três diferentes regimes de tratamento empregados. As Figuras 25 e 26 mostram os gráficos de Cmax em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico e o gráfico de ASC em função do tratamento empregado aos voluntários no estudo clínico, para as razões de (R,S)-metoprolol sobra (R)-metoprolol e (S)-metoprolol, respectivamente, para os três diferentes regimes de tratamento empregados, com intervalo de confiança de 95%.

140 112 Tabela 45 Parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. C máx (ng.ml -1 ) T máx (h) ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Tramento 1: tomada única de 100 mg Média 232,82 1,18 663,08 DP 25,97 0,24 67,68 CV% 11,15 20,82 10,21 Tramento 2: duas tomadas de 50 mg Média 247,73 1,68 767,43 DP 24,00 0,24 59,08 CV% 9,69 14,61 7,70 Tramento 3: três tomadas de 20 mg Média 201,22 2,43 702,01 DP 14,56 0,18 40,27 CV% 7,24 7,55 5,74 Análise de variância (ANOVA): valores de p, usando método de Scheffé* Tratamentos 1 e 2 0, , , Tratamentos 1 e 3 0, , , Tratamentos 2 e 3 0, , , Análise post hoc 2,1 > 3 3>2>1 1,3<2 *Diferenças significativas p<0,05

141 113 Tabela 46 Intervalo de confiança (IC 95%) para as diferenças entre os valores médios dos parâmetros farmacocinéticos para o (R,S)- metoprolol, considerando o regime de tratamento. Tratamento Diferenças IC C máx (ng.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 14,9128-2,6349 a 32,4604 Tratamento 1 e 3-31, ,1464 a -14,0512 Tratamento 2 e 3-46, ,0592 a -28,9639 ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 104, ,179 a 149,5363 Tratamento 1 e 3 38,9277-6,251 a 84,1065 Tratamento 2 e 3-65, ,609 a -20,2509 Figura 22 Gráfico de C máx em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (direita), para (R,S) metoprolol, com intervalo de confiança de 0,95.

142 114 Tabela 47 Parâmetros farmacocinéticos de (R)-metoprolol após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tramento 1: tomada única de 100 mg C máx (ng.ml -1 ) T máx (h) ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Média 153,70 1,00 470,28 DP 13,03 0,00 17,75 CV% 8,48 0,00 3,78 Tramento 2: duas tomadas de 50 mg Média 155,92 1,63 518,74 DP 16,83 0,22 26,22 CV% 10,79 13,67 5,06 Tramento 3: três tomadas de 20 mg Média 114,30 2,50 378,00 DP 1,69 0,00 12,47 CV% 1,48 0,00 3,30 Análise de variância (ANOVA): valores de p, usando método de Scheffé* Tratamentos 1 e 2 0, , , Tratamentos 1 e 3 0, , , Tratamentos 2 e 3 0, , , Análise post hoc 1,2>3 3>2>1 2>1>3 *Diferenças significativas p<0,05

143 115 Tabela 48 Intervalo de confiança (IC 95%) para as diferenças entre os valores médios dos parâmetros farmacocinéticos para o (R)- metoprolol, considerando o regime de tratamento. Tratamento Diferenças IC C máx (ng.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 2,2281-7,5702 a 12,0264 Tratamento 1 e 3-39, ,1930 a -29,5964 Tratamento 2 e 3-41, ,4211 a -31,8245 ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 48,460 32,841 a 64,079 Tratamento 1 e 3-92, ,900 a -76,662 Tratamento 2 e 3-140, ,360 a -125,122 dose; LS Means Cmax R-metoprolol Current effect: F(2, 57)=72,151, p=,00000 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals dose; LS Means AUC R-metoprolol Current effect: F(2, 57)=264,77, p=0,0000 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals cmax 130 AUC dose dose Figura 23 Gráfico de C máx em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (direita), para (R)- metoprolol, com intervalo de confiança de 0,95.

144 116 Tabela 49 Parâmetros farmacocinéticos de (S)-metoprolol após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tramento 1: tomada única de 100 mg C máx (ng.ml -1 ) T máx (h) ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Média 124,84 1,16 404,97 DP 5,70 0,24 15,08 CV% 4,56 20,62 3,72 Tramento 2: duas tomadas de 50 mg Média 146,52 1,66 466,92 DP 20,03 0,24 24,16 CV% 13,67 14,40 5,17 Tramento 3: três tomadas de 20 mg Média 107,93 2,55 384,98 DP 7,25 0,16 16,88 CV% 6,72 6,18 4,38 Análise de variância (ANOVA): valores de p, usando método de Scheffé* Tratamentos 1 e 2 0, , , Tratamentos 1 e 3 0, , , Tratamentos 2 e 3 0, , , Análise post hoc 2>1>3 3>2>1 2>1>3 *Diferenças significativas p<0,05

145 117 Tabela 50 Intervalo de confiança (IC 95%) para as diferenças entre os valores médios dos parâmetros farmacocinéticos para o (S)- metoprolol, considerando o regime de tratamento. Tratamento Diferenças IC C máx (ng.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 21, ,1838 a 31,1194 Tratamento 1 e 3-17, ,3875 a -7,4519 Tratamento 2 e 3-38, ,5391 a -28,6035 ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 60, ,2841 a 76,1316 Tratamento 1 e 3-21, ,1790 a -6,3316 Tratamento 2 e 3-82, ,8868 a -67,0394 cmax dose; LS Means Current Cmax effect: S-metoprolol F(2, 57)=47,447, p=,00000 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals dose AUC dose; LS Means AUC S-metoprolol Current effect: F(2, 57)=97,012, p=0,0000 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals dose Figura 24 Gráfico de C máx em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (direita), para (S)- metoprolol, com intervalo de confiança de 0,95.

146 118 Tabela 51 Razão entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S)-metoprolol e seu enantiômero (R)-metoprolol (R,S/R), após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tramento 1: tomada única de 100 mg C máx (ng.ml -1 ) T máx (h) ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Média 1,53 1,18 663,08 DP 0,21 0,24 67,68 CV% 13,93 20,82 10,21 Tramento 2: duas tomadas de 50 mg Média 1,61 1,05 767,43 DP 0,26 0,19 59,08 CV% 16,36 18,37 7,70 Tramento 3: três tomadas de 20 mg Média 1,76 0,95 702,01 DP 0,13 0,08 40,27 CV% 7,66 8,74 5,74 Análise de variância (ANOVA): valores de p, usando método de Scheffé* Tratamentos 1 e 2 0, , , Tratamentos 1 e 3 0, , , Tratamentos 2 e 3 0, , , Análise post hoc 1 < 2 < 3 1 > 2 > 3 1,2 < 3 *Diferenças significativas p<0,05

147 119 Tabela 52 Intervalo de confiança (IC 95%) para as diferenças entre as razões dos parâmetros farmacocinéticos de (R,S)-metoprolol e seu enantiômero (R)-metoprolol (R,S/R), considerando o regime de tratamento. Tratamento Diferenças IC C máx (ng.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 0, , a 0, Tratamento 1 e 3 0, , a 0, Tratamento 2 e 3 0, , a 0, ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 0, , a 0, Tratamento 1 e 3 0, , a 0, Tratamento 2 e 3 0, , a 0, ,9 dose; LS Means Cmax (R,S/R) metoprolol Current effect: F(2, 57)=6,4592, p=,00296 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 2,0 dose; LS Means Current effect: F(2, 57)=48,748, p=,00000 Effective hypothesis decomposition AUC (R,S/R) metoprolol Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 1,9 1,8 1,8 1,7 1,7 1,6 1,6 Cmax T/R 1,5 1,4 AUC T/R 1,5 1,4 1,3 1, dose Figura 25 Gráfico de C máx em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (direita), para as razões entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S)-metoprolol e seu enantiômero (R)-metoprolol (R,S/R), com intervalo de confiança de 0,95. 1,2 dose

148 120 Tabela 53 Razão entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S)-metoprolol e seu enantiômero (S)-metoprolol (R,S/S), após a administração de 100 mg de metoprolol racêmico em três diferentes regimes. Tramento 1: tomada única de 100 mg C máx (ng.ml -1 ) T máx (h) ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Média 1,87 1,07 470,28 DP 0,24 0,32 17,75 CV% 13,01 30,16 3,78 Tramento 2: duas tomadas de 50 mg Média 1,72 1,03 518,74 DP 0,27 0,20 26,22 CV% 15,48 19,65 5,06 Tramento 3: três tomadas de 20 mg Média 1,88 0,95 378,00 DP 0,15 0,08 40,27 CV% 8,21 8,77 3,30 Análise de variância (ANOVA): valores de p, usando método de Scheffé* Tratamentos 1 e 2 0, , , Tratamentos 1 e 3 0, , , Tratamentos 2 e 3 0, , , Análise post hoc 1, 2, 3 1, 2, 3 1, 2 < 3 *Diferenças significativas p<0,05

149 121 Tabela 54 Intervalo de confiança (IC 95%) para as diferenças entre as razões dos parâmetros farmacocinéticos de (R,S) metoprolol e seu enantiômero (S)-metoprolol (T/S), considerando o regime de tratamento. Tratamento Diferenças IC C máx (ng.ml -1 ) Tratamento 1 e 2-0, , a 0, Tratamento 1 e 3 0, , a 0, Tratamento 2 e 3 0, , a 0, ASC 0-t (ng.h.ml -1 ) Tratamento 1 e 2 0, , a 0, Tratamento 1 e 3 0, , a 0, Tratamento 2 e 3 0, , a 0, ,1 dose; LS Means Cmax (R,S/R) metoprolol Current effect: F(2, 57)=2,9735, p=,05911 Effective hypothesis decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals 2, 0 dose; LS Means Current AUC effect (R,S/R) : F(2, 57)=9,4855, metoprolol p=,00028 Effective hypothesis decom position Vertical bars denote 0,95 confidence interval s 2,0 1, 9 1,9 1, 8 1,8 Cmax T/S 1,7 1,6 AUC T /S 1, 7 1, 6 1, dose 1, dos e Figura 26 Gráfico de C máx em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (esquerda) e gráfico de ASC em função do tratamento aplicado aos voluntários no estudo clínico (direita), para as razões entre os parâmetros farmacocinéticos de (R,S)-metoprolol e seu enantiômero (S)-metoprolol (R,S/S), com intervalo de confiança de 0,95.

150 6. DISCUSSÃO

151 123 Atualmente existe uma grande discussão entre pesquisadores e agências regulatórias quanto à necessidade de avaliação de um fármaco quiral como mistura racêmica ou como enantiômero isolado para estudos de bioequivalência. Devido a essas contradições é díficil estabelecer um critério geral para avaliar estes fármacos, sendo assim necessário analisar cada caso individualmente. A utilização de métodos enantioseletivos pode fornecer dados mais precisos em relação a biodisponibilidade e bioequivalência de um determinado fármaco. Para determinar como um fármaco empregado na forma de mistura racêmica deve ser mensurado, se fármaco total ou enantiômeros isolados, é preciso levar em consideração as características de cada enantiômero, suas diferenças farmacocinéticas e farmacodinâmicas, além de características da população e custo do método enantioseletivo, que é mais dispendioso. Se um dos enantiômero apresentar diferentes características farmacodinâmicas e absorção não-linear, medidas do enantiômero isolado em estudos de bioequivalância podem ser recomendados (Torrado, 2010). Porém, se os enantiômeros não apresentarem diferenças significativas, com relação a essas suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, os métodos enantioseletivos são desnecessários. Quando se realizam estudos para novos fármacos é mais adequado a utilização de método enantiosseletivo para uma melhor avaliação dos parâmetros farmacocinéticos de cada um dos enantiômeros, uma vez que além de não se ter muitas informações a respeito desse fármaco, este pode também apresentar diferentes taxas de absorção entre seus enantiômeros, o que levaria a diferenças nas suas concentrações plasmáticas (Santoro, 2001). O metoprolol foi escolhido como fármaco modelo, para avaliar a diferença entre um estudo de biodisponibilidade relativa utilizando método de quantificação do fármaco total e método quiral de quantificação dos enantiômeros isolados, devido as diferenças observadas entre seus enantiômeros, como clearance, ligação à proteínas e tecidos, metabolismo e interação com outros fármacos, além da afinidade enantioseletiva para o receptor.

152 124 O metoprolol apresenta diversas características que o classificam como fármaco para o qual seria recomendado a análise dos enantiômeros isolados em um ensaio de bioequivalência (Cerqueira, 2003, Sandberg 1993). Seus enantiômeros exibem diferenças farmacodinâmicas, pois o enantiômero (S)- metoprolol exibe uma afinidade significativamente maior pelo receptor de subtipo β 1 -adrenérgico que a do (R)-metoprolol (Wahlund et al, 1990). Além da afinidade estereoseletiva pelo receptor, esse fármaco possue alta taxa de biotransformação (Seeringer, 2008). Nesse estudo foram quantificados o fármaco total e os seus enantiômeros isolados, a fim de estabelecer possíveis consequências das diferenças enantioseletivas na farmacocinética do metoprolol. Foi avaliado, também, a influência da velocidade e forma de entrada do fármaco no organismo, uma vez que esta pode causar interferência nos parâmetros farmacocinéticos de cada enantiômero. A etapa analítica para a análise das amostras provenientes do estudo de biodisponibilidade relativa compreendeu, primeiramente, o desenvolvimento e a validação de um método bioanalítico para quantificação de (R,S) metoprolol em amostras de plasma e desenvolvimento e a validação de um método enantioseletivo para quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)- metoprolol em amostras de plasma. A quantificação de fármacos em amostras biológicas em estudos de biodisponibilidade relativa, tanto para métodos convencionais quanto para métodos quirais, consideram os seguintes fatores: validação do método utilizado, considerando-se os parâmetros de sensibilidade, reprodutibilidade, linearidade, especificidade, precisão, exatidão e estabilidade; interação do fármaco com a matriz biológica das amostras; avaliação de interferentes presentes na amostra; estabelecimento de condições adequadas de armazenamento das amostras, determinando sua estabilidade.

153 125 Estão descritos na literatura diversos métodos convencionais (Jesen, 2008; Farca, 2003; Yilmaz, 2010) para quantificação de (R,S) metoprolol e métodos quirais (Boralli, 2005; Cerqueira, 2002; Krstulovic, 1988; Singh, 2001; Ching, 1989) para quantificação dos seus enantiômeros em plasma por cromatografia líquida com detector por fluorescência e UV. Estes trabalhos foram utilizados como ponto de partida para o desenvolvimento do método bioanálitico do presente trabalho. O método de detecção escolhido, para ambos os métodos, foi por fluorescência, por ter proporcionado maior sensibilidade e especificidade em relação à detecção por UV, com limite de detecção adequado à aplicação em estudos de farmacocinética. Outro parâmetro importante é a escolha do padrão interno. O padrão interno é geralmente um composto com características estruturais similares ao analito, e que, no caso do método em questão, seja detectado por fluorescência. Neste trabalho, utilizou-se o ofloxacino como padrão interno, pois este apresentou adequada seletividade nos métodos desenvolvidos, tempo de eluição adequado para a corrida cromatográfica e detecção por fluorescência. As amostras biológicas obtidas dos voluntários e destinadas aos estudos de biodisponibilidade passaram por tratamento prévio à análise cromatográfica, objetivando uma separação livre de interferentes. Na maioria dos trabalhos a purificação do metoprolol, a partir da matriz biológica, se deu por meio de precipitação de proteínas utilizando acetonitrila (Jesen, 2008; Farca, 2003; Yilmaz, 2010). Essa técnica de extração tem como vantagem o baixo custo e maior rapidez no processo. A precipitação de proteínas empregando acetonitrila foi a técnica de escolha para o estudo em questão por conta do volume de amostras a serem analisadas e por apresentar baixa quantidade de interferentes endógenos nos tempos de retenção do analito e padrão interno. Para o método de quantificação do metoprolol total o tempo de cada análise cromatográfica foi de 10 minutos, com tempos de retenção de 4,5 e 8,0 minutos para o ofloxacino e metoprolol respectivamente. Esse método

154 126 apresentou limite de quantificação de 5 ng.ml -1, com precisão e exatidão de 10,13 % e 88,81 %, respectivamente, o que possibilitou a quantificação de metoprolol na fase terminal de decaimento plasmático, onde são observadas baixas concentrações. A análise de regressão da curva de calibração demonstrou que o método é linear no intervalo de concentração de 5 a 500 ng.ml -1, com coeficiente de determinação (r 2 ) igual a 0,9993. A recuperação média foi de 73,5% para o metoprolol, sendo um valor satisfatório para as análises das amostras dos voluntários. Os valores obtidos para análise de amostras de metoprolol em plasma no mesmo dia (intra-dia) apresentaram precisão entre 3,76 a 5,71% e exatidão entre 90,28 a 95,67 %. Amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias) apresentaram precisão entre 3,76 a 6,06 % e exatidão entre 91,29 a 96,68 %. Para o método quiral de quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol foi utilizada uma coluna quiral do tipo Chiralcel OD derivada de carbamato de celulose tris-3,5-dimetilfenil, com fase móvel constituída de hexano, etanol e dietilamina, utilzada em diversos trabalhos para a quantificação de beta bloqueadores, entre eles o metoprolol (Boralli, 2005; Cerqueira, 2002; Krstulovic, 1988; Singh, 2001; Ching, 1989). Nesse tipo de coluna o reconhecimento quiral dos beta-bloqueadores ocorre através da ligação entre o hidrogênio do grupo OH da parte aminoálcool do composto e o grupo carboxila do derivado de fenilcarbamato. As interações entre as duplas ligações e a inclusão parcial dos enantiômeros na fase estacionária também são responsáveis pela separação enantiomérica. A coluna Chiralcel OD é uma coluna de fase normal, ou seja, utiliza solventes apolares como fase móvel. O pricipal solvente utilizado para essa condição é o hexano, juntamente com etanol e isopropanol como modificadores orgânicos. Foram realizados testes empregando hexano e etanol em diferentes proporções com e sem adição de dietilamina a fase móvel, a fim de obter uma separação adequada com tempo de análise reduzido. A adição de dietilamina à fase móvel promoveu uma melhor resolução dos picos e redução no tempo de

155 127 retenção Durante o desenvolvimento do método verificou-se que temperaturas mais baixas promoviam separação mais eficiente, definindo-se a temperatura de 25 C como ótima para o método desenvolvido. O tempo de cada corrida cromatográfica foi de 10 minutos, com tempos de retenção de 4,0; 6,0 e 8,0 minutos para o ofloxacino, (R)-metoprolol e (S)- metoprolol respectivamente. O método apresentou limite de quantificação de 10 ng.ml -1, com precisão de 11,80 % e 11,54 % e exatidão de 74,88 % e 77,66% para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente. A curva de calibração demonstrou que o método é linear no intervalo de concentração de 10 a 500 ng.ml -1, com coeficiente de determinação (r 2 ) igual a 0,9952 e 0,996 para (R)-metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente. A recuperação média foi de 67,57% e 67,97% para (R)-metoprolol e (S)- metoprolol respectivamente, sendo um valor satisfatório para as análises das amostras dos voluntários. Os valores obtidos para análise de amostras de metoprolol em plasma no mesmo dia (intra-dia) apresentaram precisão entre 5,6 % a 8,69 % e 4,75 % a 9,01 % e exatidão entre 84,62 % a 86,69 % e 82,68 % a 84,84 % para (R)- metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente. Amostras analisadas em dias diferentes (inter-dias) apresentaram precisão entre 5,99 % a 8,33 % e 5,25 % a 10,07 % e exatidão entre 84,63 % a 86,70 % e 82,63 % a 84,85 % para (R)- metoprolol e (S)-metoprolol respectivamente. De acordo com os resultados apresentados, os métodos mostraram-se específicos, sensíveis, lineares, precisos e exatos. Todos os parâmetros avaliados durante a validação do método bioanalítico para quantificação de metoprolol em plasma por cromatografia líquida de alta eficiência, utilizando detecção por fluorescência, estão de acordo com os critérios estabelecidos pela ANVISA (Brasil, 2003c). Todos os 20 indivíduos selecionados como voluntários completaram todas as fases do estudo clínico sem intercorrências. Durante a seleção desses voluntários foram observadas características antropométricas, como sexo, idade e relação peso-altura, estado físico, consumo de álcool, tabagismo e ausência de patologias cardíacas, gastrintestinais, neurológicas ou

156 128 metabólicas. Foram selecionados somente os voluntários considerados sadios, que não fumassem mais de 10 cigarros por dia, não etílicos e que estivessem na faixa de peso ideal ± 15%. Os voluntários selecionados foram devidamente informados sobre todos os aspectos que envolviam o estudo, dando seu consentimento de participação por escrito. A etapa clínica foi dividida em 3 fases, as soluções de metoprolol foram administradas em três regimes diferentes, que simulam diferentes velocidades de liberação do fármaco a partir de uma forma farmacêutica. Os voluntários receberam os três tratamentos empregados em sequência (Fase 1, Fase 2 e Fase 3). Na Fase 1, os voluntários receberam uma dose única de solução aquosa edulcorada de 100 mg de metoprolol. Na Fase 2 a mesma dose única de 100 mg foi administrada em duas tomadas de 50 mg de metoprolol com intervalo de 30 minutos entre elas. Finalmente, na Fase 3 os voluntários receberam a mesma dose única de 100 mg de metoprolol em cinco tomadas de 20mg a cada 30 minutos. Os comprimidos foram triturados, pesados e divididos nas doses determinadas. No momento da administração o fármaco foi disolvido em solução edulcorada e administrado, juntamente com 200 ml de água, aos voluntários no regime estabelecido para cada fase. Esse esquema de administração foi estabelecido com o intuito de simular uma liberação modificada do fármaco, eliminando também a etapa de dissolução da forma farmacêutica, a fim e avaliar apenas as diferenças de velocidade e extensão de absorção entre o metoprolol total e seus enantiômeros. Entre todas as fases houve o período de wash-out de 7 dias, período superior a 10 meias-vidas de eliminação do metoprolol, garantindo a completa eliminação do fármaco. O período de wash-out é definido como um intervalo de tempo suficientemente grande entre dois períodos de tratamento para que o efeito residual de uma formulação administrada num período de tratamento seja eliminado das unidades experimentais para o próximo tratamento. Fármacos racêmicos com farmacocinética não estereoseletiva apresentam razões de área sob a curva entre os enantiômeros com valores

157 129 próximos a 1 (ASC (S) / ASC (R) 1) e proporções de concentrações plasmáticas (S) / (R) constantes. Portanto, mudando a velocidade de liberação da forma farmacêutica não são esperadas alterações na velocidade de absorção. O metoprolol é um beta bloqueador que é comercializado como composto racêmico, com faixa terapêutica de 50 mg a 200 mg. Ele é quase completamente absorvido após a administração oral, com baixa taxa de ligação às proteínas plasmáticas, sua biodisponilidade sistêmica varia devido a extensa biotransformação pré-sistêmica. Picos de concentração plasmática são atingidos após 1,5 a 2 horas após a administração do fármaco. O enantiômero (S)-metoprolol expressa maior atividade no bloqueio do receptor β 1 -adrenérgico (Regardh, 1980). A maioria dos estudos realizados que estão relacionados a enantioseletividade na farmacocinética do metoprolol são obtidos a partir de administração de dose única aos voluntários sádios, porém um estudo realizado, por Cerqueira e colaboradores (2002), com administração de doses múltiplas de metoprolol a pacientes hipertensos mostrou haver enantioseletividade em sua farmacocinética, com acúmulo plasmático para (S)- metoprolol. Essa enantioseletividade é resultante da discriminação entre os enantiômeros na eliminação pré-sistêmica após a administração por via oral. Na etapa estatística, as concentrações plasmáticas de (R,S) metoprolol e seus enantiômeros isolados e os parâmetros farmacocinéticos obtidos para os diferentes tratamentos empregados foram comparados utilizando análise de variância (ANOVA) e determinação do intervalo de confiança 95% (I.C. 95 %) para as diferenças entre os valores médios dos parâmetros farmacocinéticos. A análise de variância (ANOVA) é uma coleção de modelos estatísticos no qual a variância amostral é particionada em diversos componentes devido a diferentes fatores (variáveis), que nas aplicações estão associados a um processo. Por meio desta partição, a ANOVA estuda a influência destes fatores na característica de interesse. Dessa forma, permite que vários grupos sejam comparados a um só tempo. Esses fatores podem ser de origem qualitativa ou quantitativa, entretanto, a variável dependente deverá necessariamente ser contínua (Zar, 1996).

158 130 Utilizou-se método de ANOVA com análise post hoc para os parâmetros farmacocinéticos de C máx, T máx, t (1/2) e ASC 0-t para (R,S) metoprolol e seus enantiômeros, bem como para as razões entre metoprolol total e cada enantiômero para os parâmetros de C max e ASC 0-t, referentes aos três esquemas de administração, seguindo o modelo não compartimental. Foi considerado nível de significância (p) menor que 0,05. O teste post hoc foi realizado utilizando método de Scheffé para discriminar diferenças específicas entre os tratamentos empregados. O método de Scheffé é um método utilizado para ajustar os níveis de significância em uma análise de regressão linear para comparações múltiplas. É particularmente útil em testes ANOVA, e na construção de intervalos de confiança simultâneos para regressões que envolvem funções de base. O método de Scheffé é um procedimento de comparação única de um único passo que aplica ao conjunto de estimativas de todos os contrastes possíveis entre as médias dos níveis, não apenas as diferenças de pares consideradas pelo método Tukey-Kramerse. O método estatístico empregado permitiu comparar os parâmetros farmacocinéticos, variáveis dependentes, com os diferentes tipos de administração do fármaco, variável preditora. Os dados farmacocinéticos utilizados para avaliar as diferenças na velocidade do processo de absorção, entre o metoprolol total e seus enantiômeros, foram de concentração plasmática máxima atingida após a administração da dose (C máx ) e de tempo para atingir essa concentração (T máx ), enquanto que para estimar as possíveis alterações na extensão de fármaco absorvido foram utilizados os dados de área sob a curva de concentrações plasmáticas do fármaco versus tempo (ASC 0-t ). A área sob a curva de concentrações plasmáticas do fármaco versus tempo (ASC 0-t ) corresponde ao principal parâmetro de biodisponibilidade, por representar a quantidade de fármaco absorvido, enquanto que a concentração plasmática máxima atingida após a administração da dosa (C máx ) é um parâmetro híbrido, ou seja, relacionado à quantidade absorvida e à velocidade do processo de absorção.

159 131 A comparação entre os três tratamentos utilizados por meio dos parâmetros C máx, ASC 0-t e T máx de (R,S)-metoprolol, (R)-metoprolol e (S)- metoprolol indicou a presença de diferenças significativas entre os tratamentos, conforme era esperado. Apenas não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos 1 e 2 para o parâmtero C máx de (R,S)-metoprolol e C máx de (R)-metoprolol, e entre os tratamentos 1 e 3 para o parâmetro ASC 0-t de (R,S)- metoprolol. O tratamento 1 apresentou valores menores de C máx em relação aos tratamentos 2 e 3 tanto para o metoprolol total quanto para os enantiômeros. Os tratamentos 1 e 2 foram equivalentes em relação ao C máx de (R,S)-metoprolol e de (R)-metoprolol, mas diferentes em relação ao C máx de (S)-metoprolol (o tratamento 1 apresentou C máx deste enantiômero menor que o tratamento 2). Em relação ao parâmetro T máx, observou-se que os três tratamentos foram diferentes entre si, com o tratamento 1 apresentando os menores valores de T máx e o tratamento 3 apresentando os maiores valores, tanto para o metoprolol total quanto para seus enantiômeros. Na comparação dos tratamentos pelo parâmetro de ASC 0-t, observou-se que o tratamento 2 apresentou os maiores valores de ASC 0-t tanto para o metoprolol total quanto para seus enantiômeros. Para os dois enantiômeros observou-se também que a ASC 0-t do tratamento 3 foi inferior à do tratamento 1, enquanto que para o metoprolol total não houve diferença significativa para ASC 0-t entre os tratamentos 1 e 3. Foram analisadas também as razões entre os valores de C máx e ASC 0-t de (R,S)-metoprolol e cada um de seus enantiômeros. A análise da relação entre C máx de metoprolol total e C máx de (R)- metoprolol (C máx R,S/ C máx R), indicou que os tratamentos 1 e 2, e 2 e 3 foram semelhantes, enquanto que os tratamentos 1 e 3 foram estatisticamente diferentes, sendo que a relação entre os valores de C máx foi menor no tratamento 1 e maior no tratamento 3 (1 < 2 < 3). A análise da relação entre C máx de metoprolol total e Cmax de (S)-metoprolol (C máx R,S/ C máx S) indicou que os três tratamentos foram semelhantes entre si (1,2,3). Portanto, não se observaram alterações significativas entre a razão (R,S)-metoprolol e (S)-metoprolol, enquanto que para a razão entre fármaco total e o enantiômero (R)-metoprolol foi observada uma diferença entre os

160 132 tratamento 1 e 3, o que justifica a aproximação entre curvas de decaimento plasmáticos dos enantiômeros (R)- e (S)-metoprolol observada para o tratamento 3. A análise da relação entre ASC 0-t de metoprolol total e seus enantiômeros indicou diferenças significativas entre os tratamentos 1 e 3 e entre os tratamentos 2 e 3 para os dois enantiômeros, mas não indicou diferença entre os tratamentos 1 e 2. Assim, não foram observadas diferenças entre os tratamento 1 e 2 tanto para as razões (R,S)-metoprolol sobre (R)-metoprolol, quanto para as razões (R,S)-metoprolol sobre (S)-metoprolol. Entretanto, foram observadas diferenças entre os tratamentos 1 e 3 para as razões de C máx entre (R,S)-metoprolol e (R)- metoprolol e para as razões de ASC 0-t entre (R,S)-metoprolol e (R)-metoprolol e entre (R,S)-metoprolol e (S)-metoprolol. Os tratamentos 2 e 3 também se diferenciaram em função das razões de ASC 0-t entre (R,S)-metoprolol e (R)- metoprolol e entre (R,S)-metoprolol e (S)-metoprolol. A avaliação dos resultados indica uma cinética enantioseletiva para o metoprolol, que pode ter ocorrido devido a diferenças inter-individuais com relação ao tipo de metobolizador expresso, já que o metoprolol extensa biotransformação. Essa estereoseletividade também se mostrou dependente da velocidade de entrada do fármaco no organismo, uma vez que os valores de ASC 0-t para (R,S)-metoprolol, (R)- e (S)-metoprolol foram estatisticamente diferentes entre os tratamentos empregados. Além disso, a biodisponibilidade do (S)-metoprolol foi menor em todos os tratamentos, que pode ter ocorrido devido a uma biotransformação présistêmica dose-dependente. Portanto, essas diferenças observadas na biodisponibilidade para o metoprolol total e seus enantiômeros entre os tratamentos indica que a afirmação de equivalência terapêutica deve ocorrer levando-se em consideração a velocidade de entrada do fármaco no organismo.

161 7. CONCLUSÕES

162 134 De acordo com os resultados apresentados no presente trabalho pode-se concluir que: O método bioanalítico desenvolvido e validado para quantificação de metoprolol em amostras de plasma humano, apresentou seletividade, linearidade, limite de quantificação, recuperação, precisão, exatidão e estabilidade adequados à sua finalidade; O método bioanalítico quiral desenvolvido para a quantificação dos enantiômeros (R)-metoprolol e (S)-metoprolol em amostras de plasma humano, apresentou separação adequada para os enantiômeros com seletividade, linearidade, limite de quantificação, recuperação, precisão, exatidão e estabilidade adequados para a análise das amostras obtidas; Verificou-se que os diferentes tratamentos administrados aos voluntários simularam adequadamente diferentes velocidades de liberação do fármaco metoprolol. A análise farmacocinética para o fármaco (R,S) metoprolol e seus enantiômeros e a comparação entre seus parâmetros farmacocinéticos obtidos após administração oral do metoprolol, indicam uma cinética enantioseletiva para o metoprolol, que pode ter ocorrido devido a uma biotransformação pré-sistêmica dose-dependente.

163 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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171 ANEXOS

172 ANEXO A Parecer do comitê de ética em pesquisa

173

174

175

176

177 ANEXO B Termo de consentimento livre e esclarecido

178 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO I DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU LEGAL RESPONSÁVEL 1. Nome do Voluntário... Documento de Identidade Nº :... Sexo: ( ) M ( ) F Data de Nascimento:.../.../... Endereço:...Nº:...Apto:... Bairro:...Cidade:... CEP:...Telefone: Responsável Legal:... Natureza (grau de parentesco, tutor, curador, etc.):... Documento de Identidade Nº:...Sexo: ( )M ( )F Data de Nascimento:.../.../... Endereço:...Nº:...Apto:... Bairro:...Cidade:...CEP:...Tel:... II DADOS SOBRE A PESQUISA 1. Título do Protocolo de Pesquisa: Investigação da influência da velocidade de liberação do fármaco metoprolol a partir da forma farmacêutica sobre seu processo de absorção e de seus enantiômeros 2. Pesquisador: Francinalva Dantas de Medeiros Cargo/Função: Doutorando Inscrição Conselho Regional Nº: CRF-SP Departamento da FCF/USP: Departamento de Farmácia 3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA Risco Mínimo (X) Risco Médio ( ) Risco Baixo ( ) Risco Maior ( ) 4. Duração da Pesquisa: 2 anos III REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA, CONSIGNANDO: 1. Justificativa, objetivos e procedimentos da pesquisa: Este estudo pretende avaliar o comportamento do remédio metoprolol no organismo humano a fim de estabelecer uma forma mais eficiente de comparar os medicamentos genéricos e similares, que contem metoprolol. O metoprolol é um remédio utilizado no tratamento de pressão alta e problemas do coração.