IMPORTÂNCIA E DESAFIOS DA PADRONIZAÇÃO DE MÉTODOS DE BIOACESSIBILIDADE PARA A PESQUISA E INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

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1 IMPORTÂNCIA E DESAFIOS DA PADRONIZAÇÃO DE MÉTODOS DE BIOACESSIBILIDADE PARA A PESQUISA E INDÚSTRIA DE ALIMENTOS E.P. Lucena 1, G.A. Camargo 2 1- Estudante, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Bolsista FUNCAFÉ Universidade Estadual de Campinas, Campinas-SP, Brasil, erika.lucen@gmail.com 2- Pesquisadora, Instituto de Tecnologia de Alimentos, Campinas-SP, Brasil. Telefone: , camargo@ital.sp.gov.br RESUMO Este estudo tem como objetivo avaliar a importância e os desafios de empregar testes de bioacessibilidade no setor de Alimentos. Trata-se de uma revisão bibliográfica baseada na literatura especializada através de consulta a artigos científicos selecionados através de busca no banco de dados do scielo, science direct e outras. Os estudos encontrados apresentam divergências quanto aos resultados apresentados por diferentes métodos, pois o tipo da fonte, preparação e processamento do alimento são fatores importantes que alteram a bioacessibilidade dos mesmos. Isso dificulta uma padronização desses testes, tornando-se um grande desafio para pesquisa de compostos bioativos na indústria de alimentos, a qual deverá verificar qual o melhor método para determinar a bioacessibilidade de cada um de seus produtos e uma forma para padronizar a divulgação dos resultados. ABSTRACT This study aims to analyze the importance and challenges of employing bioaccessibility tests in the food sector. This is a literature review based on specialized literature found by looking at certain scientific articles in scielo, science direct and others databases. Studies have found differences in the results presented by different methods, since the type of source, preparation and food processing are important factors that alter the bioaccessibility thereof. This makes it difficult to standardize these tests, making it a major challenge for the Food Industry, which must find what the best method to determine the bioaccessibility of each of its products and a way to standardize the dissemination of results. PALAVRAS-CHAVE: bioacessibilidade; compostos bioativos; desafio. KEYWORDS: bioaccesibility; biactives compounds; challenge. 1. INTRODUÇÃO Nos últimos anos houve um crescente interesse da comunidade científica e da sociedade em geral a respeito de nutrição. Atualmente a questão não é simplesmente comer para sobreviver, mas ser bem informado sobre do que está se alimentando para desfrutar de uma melhor qualidade de vida. Desta forma, a dieta passou a ser reconhecida como importante, não só para a nutrição, mas também para a prevenção e tratamento de doenças, especialmente quando estas doenças são causadas por ingestão insuficiente, excessiva ou desequilibrada de alimentos (Muzquiz, 2012). Os problemas de saúde da população brasileira exigiram esforços do governo e setor produtivo para implantação de uma rotulagem nutricional de alimentos e bebidas, gerando melhorias da segurança e qualidade dos alimentos. Nessa rotulagem nutricional, regulamentada pela ANVISA, é

2 obrigatória a declaração do valor energético e de nutrientes (carboidratos, proteínas, gorduras totais, saturadas, gorduras trans, fibra alimentar e sódio). Já as vitaminas e sais minerais podem ser declarados opcionalmente, desde que cada porção do alimento contenha pelo menos 5% da Ingestão Diária Recomendada (IDR) (Ferreira, 2007). Por mais que essas medidas tenham atendido o seu objetivo de atuar em benefício do consumidor, oferecendo informações confiáveis acerca dos produtos, ela não é efetiva para a real indicação dos nutrientes que serão digeridos pelo organismo das pessoas, comprometendo o segmento de dietas e dos valores de Ingestão Diária Recomendada (IDR). Isso se deve ao fato de que a quantidade total de nutriente presente no alimento ingerido nem sempre reflete a quantidade que ele estará realmente acessível no organismo. Apenas certa quantidade estará biodisponível, ou seja, apenas uma fração do nutriente que é absorvido atinge a corrente sanguínea e se torna disponível para utilização nas funções fisiológicas ou para ser armazenado no corpo (Versantvoort, 2005). Para um nutriente estar biodisponível no organismo, é necessário que este se liberte do alimento ingerido através do processo digestivo ao longo do trato gastrointestinal, no qual apenas uma fração liberada fica bioacessível para ser absorvida pelo corpo. A determinação da bioacessibilidade que um nutriente tem em um determinado alimento pode ser considerada como um indicador para a biodisponibilidade máxima desse nutriente (Ferreira, 2014). Desta forma, testes in vivo e in vitro são os métodos mais utilizados para determinar a bioacessibilidade de um nutriente específico num determinado alimento (Tognon, 2012). Os testes in vivo são realizados com animais ou humanos, e são muito usados nas áreas biomédica e farmacêutica, para determinar a biodisponibilidade efetiva de medicamentos ao serem administrados diretamente na dieta de cobaias. (Bosso, 2008). Eles são determinados por estudos de balanço de matéria ou de concentração tecidual, que permitem a determinação da quantidade absorvida de um nutriente em uma matriz alimentar. O estudo de balanço de matéria determina a quantidade absorvida de um nutriente por medida da diferença entre a quantidade de nutriente ingerida e a quantidade deste mesmo nutriente eliminado nas excretas. Já o de concentração tecidual monitorase o aumento da concentração do nutriente de interesse no plasma sanguíneo. (Tognon, 2012) Por um lado os testes in vivo apresentam uma maior precisão, por outro, são estudos muito complexos, de alto custo e que envolvem questões éticas (Carbonell-Capella, 2014). Deste modo, houve um crescente interesse pelo uso de metodologias in vitro para estudar a biodisponibilidade oral humana de compostos a partir de alimentos. A maior parte dos modelos de digestão in vitro simulam de forma simplificada os processos de digestão na boca, estômago e intestino delgado, de modo a permitir a investigação da biodisponibilidade de compostos a partir da sua matriz alimentar durante o trânsito no trato gastrointestinal, não incluindo os microorganismos presentes no trato digestivo e desconsiderando os mecanismos de absorção que ocorrem no epitélio duodenal. Essas simulações ocorrem por aplicação de condições de base fisiológica, isto é, composição química de fluidos digestivos, ph e períodos de tempo de residência típico para cada compartimento (Versantvoort, 2005). O presente trabalho teve como objetivo estudar e compreender os principais fatores que afetam na divergência dos resultados de bioacessibilidade de alimentos e identificar os principais desafios da padronização desses métodos para a indústria. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Este estudo constitui-se de uma revisão da literatura especializada, realizada entre janeiro e junho de 2016, no qual foi feita uma consulta a artigos científicos selecionados através de busca no banco de dados do scielo, science direct e outras. As palavras-chave utilizadas na busca foram bioacessibilidade, alimento, in vitro e in vivo. Os critérios de inclusão para os estudos encontrados foram testes de bioacessibilidade in vitro e in vivo realizados sobre diferentes métodos. Foram

3 encontrados 5 artigos nas bases de dados consultadas que analisavam a bioacessibilidade de componentes em alimentos sob diferentes métodos. As publicações se concentraram no ano de 2005 a RESULTADOS E DISCUSSÕES REVISÃO BIBLIOGRÁFICA De acordo com uma pesquisa realizada por He et al (2016), observou-se os efeitos do processamento de homogeneização de alta pressão (HPHP), tratamento térmico (TT) e matriz de leite (soja, desnatado e leite integral) sobre a biodisponibilidade de compostos fenólicos e a atividade antioxidante de sucos (maçã, uva e laranja) mostrando uma forte dependência entre esses fatores. Os resultados indicaram que o TT foi mais eficaz do que HPHP em elevar a qualidade funcional do suco de fruta e do leite de vaca, além de ter sido mais adequado para utilização na formulação de bebidas de suco de fruta do que em leite de soja, devido à biodisponibilidade de compostos fenólicos (He, 2016). Já em outro estudo, foi analisado a bioacessibilidade de bifenilos policlorados (PCBs), dibenzodioxinas policloradas (PCDDs) e dibenzofuranos policlorados (PCDFs) nos alimentos (arroz, couve, leite em pó, ovo de galinha, carne e peixe de água doce) ao passarem por um método de cocção (fervura ou fritura), a partir de um modelo do trato gastrointestinal in vitro. Observou-se então que o método de preparação de alimentos é um fator importante na determinação da biosdisponibilidade de POSs, pois os alimentos preparados pela fritura em óleo apresentou uma biodisponibilidade maior em relação à de alimentos preparados por fervura (Shen, 2016). Em uma análise realizada por Versantvoort et al. (2005), o modelo in vitro de digestão foi útil para determinar a biodisponibilidade reprodutível de micotoxinas de alimentos. A bioacessibilidade de aflatoxina B 1 e ocratoxina A a partir de produtos alimentares foram elevadas, em média de 94% para a aflatoxina B 1 e 100% de ocratoxina A, indicando que todas as micotoxinas são libertadas a partir da matriz alimentar. A biodisponibilidade de compostos de alimentos nem sempre é elevado e pode ser fortemente dependente da fonte de alimento. Por exemplo, a biodisponibilidade de carotenóides pode ser entre 5% (licopeno) e 30-60% (luteina), ferro entre 51% e 98% e entre 11% e 60% e de cálcio entre 17% e 54% e entre 22% e 47% (Versantvoort, 2005). Esses estudos reforçam a ideia de que dependendo do tipo da fonte, preparação e processamento do alimento, a biodisponibilidade dos componentes presentes pode ser diferente, mesmo que os alimentos apresentem a mesma quantidade de nutrientes na sua matriz alimentar. Desta forma, em determinadas condições, a presença de um nutriente pode exercer um efeito benéfico enquanto em outro alimento a mesma quantidade poderá não causar qualquer efeito (Ferreira, 2014). Um estudo realizado para determinar a bioacessibilidade de ácido perfluorooctanóico (PFOA) na presença de 17 alimentos foi realizado empregando-se um método in vivo, utilizando rato, e três in vitro (UBM, PBET e IVD). Quando comparados os testes in vivo e in vitro, observou-se uma forte correlação com o método UBM, onde provavelmente a sua capacidade de lipólise mais elevada e a presença de Ca 2+ e Mg 2+ no seu fluido gastrointestinal resultou numa baixa formação de micelas estáveis em comparação com os métodos PBET e IVD, gerando uma melhor absorção. Deste modo, os resultados indicaram que a biodisponibilidade relativa do PFOA foi afetada principalmente pelo teor de lipídios nos alimentos e que o método UBM tem maior potencial para determinar a bioacessibilidade de ácido perfluorooctanóico em amostras de alimentos (Li, 2015). Os métodos utilizados nos estudos foram o Oomen et al. (2003), presente em mais de uma análise, Wootton-Barba et al. (2011), UBM, PBET e IVD. Além desses, há vários outros métodos desenvolvidos para a determinação da bioacessibilidade, como mostra a Tabela 1:

4 Tabela 1 Principais métodos de bioacessibilidade, tipo de experimento, constituintes das soluções simuladas, ph e tempo de contato de cada simulação. Todos os testes são executados em temperatura controlada (37 C), na proporção sólido:líquido (S/L). O último (TIM) é realizado em fluxo. Método Solução simulada ph S/L Tempo (h) SBET Gástrica Glicina 1,5 1/100 1 PBET Gástrica Pepsina, ac. málico, ac. acético, ac. lático e ac. cítrico 2,5 1/100 1 Intestinal Pancreatina, sais de bile e NaHCO3 7,0 3 IVG Gástrica Pepsina e NaCl 1,8 1/150 1 Intestinal Pancreatina, extrato de bile e NaHCO3 5,5 1 U.S.P. Gástrica Pepsina e NaCl 1,2 1/100 2 MB & SR Saliva Mucina, uréia, Na₂HPO4, CaCl₂, KCl, NaCl 5,5 1/160 5s Gástrica Pepsina, mucina 1,5 1/ Intestinal NaHCO3 7,0 1/ DIN SHIME RIVM TIM Gástrica Pepsina, mucina Intestinal Tripsina, pancreatina e extrato de bile Gástrica Pectina, Nutrilon plus, mucina, amido, cellobiose, glucose, proteose peptona e leite Intestinal Pancreatina, bile bovina e NaHCO3 Saliva Mucina, amilase, uréia, ac. úrico, NaOH, NaCl, KCl, Na₂SO4, NaSCN Gátrica Pepsina, glucose, ac. glucorônico, glucoseamina, BSA, mucina Intestinal Lípase, pancreatina, uréia, BSA e extratos de bile Saliva Não especificada Gástrica Lípase, pepsina Intestinal Pancreatina, extrato de bile, NaHCO3 2,0 7,5 5,2 6,5 6,5 1,1 5,5 5,0 2,0 7,2 1/15 1/50 1/100 1/2,5 1/4 1/15 1,40 1/100 1/5 1/30 1/ min min 1,5 6 SBET Simple Extraction Bioaccessibility Test; PBET Physiologically Based Extraction Test; IVG In vitro Gastrointestinal model; U.S.P U.S. Pharmacopoeia model; MB & SR Mass Balance and Soil Recapture; DIN Static gastrointestinal model; SHIME Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystems of Infants; RIVM In Vitro Digestion model; TIM Dynamic Gastrointestinal model. Fonte: Bosso, 2008 A escolha de um determinado método in vitro baseia-se na sua validação, em geral, com base na comparação de resultados com testes in vivo, na fidelidade da simulação das condições fisiológicas humanas e na adequação à infraestrutura disponível (Bosso, 2008). Essa gama de testes desenvolvidos e a necessidade de modificar os métodos às suas necessidades podem gerar um empecilho para a comparação de resultados com outras pesquisas, tendo em vista a dificuldade de se obter um padrão para a análise de resultados. A maior parte das pesquisas obtidas das análises de bioacessibilidade são do ano de 2016, o que mostra ser um tema novo e atualmente muito discutido. Os estudos atuais encontram divergências quanto aos resultados apresentados por diferentes métodos, pois o tipo da fonte, preparação e processamento do alimento são fatores importantes que alteram a bioacessibilidade dos mesmos, dificultando a sua padronização. Os testes in vitro se tornam mais indicados para serem realizados pela indústria, tendo em vista que são mais rápidos, de baixo custo e não envolvem questões éticas. Mas a

5 escolha do melhor método in vitro a ser empregado deve vir de uma análise comparativa com o teste in vivo, por este ser mais preciso. Deste modo, a dificuldade de padronização dos métodos torna-se um grande desafio para a Indústria de Alimentos, a qual deverá verificar qual o melhor método para determinar a bioacessibilidade de cada um de seus produtos e uma forma para padronizar a divulgação dos resultados, tendo em vista a importância de informar o consumidor sobre o quanto dos nutrientes deste produto realmente será utilizado por seu organismo. 4. CONCLUSÃO - Por ser um tema novo, os estudos atuais encontram divergências quanto aos resultados apresentados por diferentes métodos, pois o tipo da fonte, preparação e processamento do alimento são fatores importantes que alteram a bioacessibilidade dos mesmos, dificultando a sua padronização; - Os testes in vitro se tornam mais indicados para serem realizados pela indústria, tendo em vista que são mais rápidos, de baixo custo e não envolvem questões éticas; - A escolha do melhor método in vitro a ser empregado deve vir de uma análise comparativa com o teste in vivo, por este ser mais preciso; - A dificuldade de padronização dos métodos é um grande desafio para a Indústria de Alimentos, a qual deverá verificar qual o melhor método para determinar a bioacessibilidade de cada um de seus produtos e uma forma para padronizar a divulgação dos resultados; - A divulgação dos resultados de testes de bioacessibilidade na rotulagem de alimentos é muito importante para informar o consumidor o quanto dos nutrientes deste produto realmente será utilizado por seu organismo, facilitando o segmento de dietas e dos valores de Ingestão Diária Recomendada (IDR). 5. AGRADECIMENTOS Agradecemos o Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) e a Embrapa Fundo de Defesa da Economia Cafeeira (Funcafé). 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bosso, S. T., & Enzweiler, J. (2008). Ensaios para determinar a (Bio)disponibilidade de chumbo em solos contaminados: revisão. Química Nova, 31(1). Carbonell-Capella, J. M., et al. (2014). Analytical Methods for Determining Bioavailability and Bioaccessibility of Bioactive Compounds from Fruits and Vegetables: A Review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 13(2), p Cozzolino, S. M. F (2012). Biodisponibilidade de nutrientes (4. ed.). Barueri: Manole Ltda. Ferreira, A. B., & Lanfer-Marquez, U. M. (2007). Legislação brasileira referente à rotulagem nutricional de alimentos. Revista de Nutrição, 20(1) Ferreira, M. M. C. (2014). Simulação in vitro do processo digestivo de patulina em sumos de fruta. Lisboa: Universidade de Lisboa, Departamento de Biologia Animal. Disponível em file:///c:/users/gabinete_ti/downloads/dissertacao_mestrado_andre_luiz_tognon.pdf

6 He, Z., et al. (2016). High pressure homogenization processing, thermal treatment and milk matrix affect in vitro bioaccessibility of phenolics in apple, grape and orange juice to different extents. Food Chemistry, 200, p Li, k., et al. (2015). In Vivo Bioavailability and In Vitro Bioaccessibility of Perfluorooctanoic Acid (PFOA) in Food Matrices: Correlation Analysis and Method Development. Environmental Science & Technology, 49(1), p Muzquiz, M., et al. (2012). Bioactive compounds in legumes: pronutritive and antinutritive actions. Implications for nutrition and health. Phytochemistry Reviews, 11(2), p Shen, H., et al. (2016). The bioaccessibility of polychlorinated biphenyls (PCBs) and polychlorinated dibenzo-p-dioxins/furans (PCDD/Fs) in cooked plant and animal origin foods. Environment International, 94, p Tognon, A. L. (2012). Quantificação e avaliação da bioacessibilidade in vitro de micro e macroelementos em frutas, hortaliças e cereais. Ribeirão Preto: Universidade de São Paulo, Departamento de Química. Disponível em file:///c:/users/gabinete_ti/downloads/dissertacao_mestrado_andre_luiz_tognon.pdf Versantvoort, C. H., et al. (2005). Applicability of an in vitro digestion model in assessing the bioaccessibility of mycotoxins from food. Food and Chemical Toxicology, 43(1), p