Células Estaminais. Identificação de Mecanismos com Potencial Impacto em Regeneração de Tecidos
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- Valdomiro Camarinho Raminhos
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1 Células Estaminais Identificação de Mecanismos com Potencial Impacto em Regeneração de Tecidos Perpétua Pinto do Ó NewTherapies Group, INEB Laboratório Associado IBMC-INEB Ciência Encontro com a Ciência em Portugal, Fundação Calouste Gulbenkian, 2 de Julho de 2008
2 Concepção abordagens terapêuticas mais eficientes O que precisamos saber? Auto-replicação Matriz Extracelular (não-proteica) Célula estaminal (SC)? Diferenciação Células do nicho Extrínseca Intrínseca como activar SC in situ como aumentar o número de SC ex vivo a assinatura molecular característica das SC do orgão/tecido o nicho na condição normal versus patológica
3 Implementação de terapia celular para restabelecimento da função cardíaca: - análise funcional de populações celulares de potencial benefício terapêutico num quadro clínico de enfarte do miocárdio Financiamento: Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Out Out 2010 Investigador Responsável: Perpétua Pinto do Ó Instituições Participantes: IMM/IPO-Lisboa, CHN, FMUP/HSJ, CHVNG, IPO-Porto
4 Quimerismo do Coração Transplantado Autópsia: presença do cromossoma Y em células que expressam proteína sarcomérica indicaram eventual origem extracardíaca destes cardiomiócitos
5 Ensaios Clínicos Estas observações constituíram a fundação para o conceito de terapia celular cardíaca e levaram a: Bone marrow or blood-derived progenitors Intracoronary infusion Bone marrow or blood-derived progenitors or skeletal muscle cells Catheter-based intramyocardial needle injection Bone marrow or blood-derived progenitors or skeletal muscle cells Direct intramyocardial injection during surgery Coronary artery Infusion balloon Adaptado J. Clin. Invest. 115: (2005)
6 entretanto Novo Paradigma: o coração é um orgão com potencial intrínseco para regeneração! O nicho das células estaminais cardíacas (CSC): o miocárdio contem SC residentes que após activação originam cardiomiócitos (CM) e estruturas vasculares representadas por células musculares lisas (SM) e células endoteliais (EC)
7 Que células devemos utilizar para regenerar/reparar o tecido cardíaco? c-kit c-kit MDR1 Sca-1 c-kit + MDR1 + Sca-1+? HSC c-kit CD45 Kit MDR1 Sca-1 MDR1 Sca-1
8 Objectivos I- Identificar o perfil funcional das células estaminais/progenitoras residentes no tecido cardíaco II- Determinar a interacção de populações fenotípicamente distintas de células cardíacas com presumível potencial de células estaminais/progenitoras III- Caracterizar a base molecular para a mobilização e função das células progenitoras do endotélio (EPC) em indíviduos com patologia cardíaca associada a enfarte do miocárdio
9 I. Identificar o perfil funcional das células estaminais/progenitoras residentes no tecido cardíaco Heart Digestion Magnetic Cell Sorting Proteome Profiling + c-kit/ Sca-1 c-kit/sca-1 α-sarcomeric actin MI- enfarte do miocárdio
10 Modelo Experimental de Enfarte do Miocárdio (MI) Laqueação da artéria coronária descendente anterior em murganho Adapted from NHI Homepage Stem Cells ~0,5cm MI 2x C 2x
11 II. Determinar a interacção de populações fenotípicamente distintas de células cardíacas com presumível potencial de células estaminais/progenitoras Modelo in vitro de Cardioesferas (Cs) 1mm 50µm Explantes cardíacos Cultura Cs Clonagem de Cs (monocamada fibroblastos embrionários) marcação retroviral de populações purificadas de Sca-1 + c-kit + e Sca-1 + c-kit - follow-up da progenia (clonal) in vivo e in vitro (Southernblot, ICC, singlecell RT-PCR, reclonagem de células transplantadas) EC SM CM Ensaios de Diferenciação Model
12 Cardioesferes (Cs): modelo in vitro de cardiogénese? CD45.1 GFPtg? - Vybrant CFDA-SE cell tracers - Marcação retroviral Hibridização in situ / ICC Ensaios de co-cultura Função de proteínas (neutralização c/ anticorpos, RNAi) Regulação de destino celular (screening de factores secretados) X Transplantação CD45.2 TNFα -/- Potencial de indução cardiogénica das Cs: co-cultura com EC/ MSC/ células monocíticas/ inflamatórias (directa e em sistema transwell) Função in vivo (transplantação ortotópica / heterotópica) SCID Outros modelos genéticos
13 Caracterização de linhas imortalizadas de células estaminais /progenitoras cardíacas (c-tert) Lin neg Sca Sca-1 pos Ensaios in vitro: diferenciação Proteoma c-tert versus c-tert diferenciada fibroblastos cardíacos linha celular cardiomiocitica Ensaio trasnformação tumoral (Nude) Ensaios in vivo: transplantação no modelo experimental de MI Colaboração: Paolo Di Nardo, University Tor Vergata, Roma
14 Gathering it A ound a hunch for round Objectivo: validação de modelos in vitro para identificação de mecanismos celulares/moleculares com potencial interesse em medicina de regeneração de tecidos Financiamento interno (INEB),
15 As leis da Física e/ou Cardiospheres! Mimetização do nicho de origem Nascimento D et al., (preliminary data) Embryoid bodies Pinto do Ó P et al., EMBO J 1998 Sousa M et al., (unpublished data) Dontu G, Genes Dev 2003
16 Agradecimentos Sérgio Dias Carla Real Afonso Vasco Gama M J Vaz da Silva Adelino L Moreira CHNORTE Helena Alves Susana Oliveira Sofia Correia* Picture by Erika Aoyama, IPO-Porto Porto Susana Roncon Vladimir Zachar Paolo Di Nardo Giancarlo Forte Diana Nascimento Isabel Carvalho Paula Sampaio Rui Fernandes Sofia Correia * Mónica Sousa Catarina Miranda Joana Paredes
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