Terapia Génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento
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- Dalila Medina Canto
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1 Encontro de Ciência em Portugal Fundação Calouste Gulbenkian Lisboa, 12 e 13 de Abril de 2007 Terapia Génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento Luís Pereira de Almeida luispa@ci.uc.pt lpereiradealmeida@gmail.com Departamento de Vectores e Terapia Génica Head: Mª Conceição Pedroso de Lima
2 Estratégias de administração para o sistema nervoso central Terapia génica in vivo Transplantação de células Terapia génica ex vivo Células encapsuladas Vectores virais Bombas osmóticas Sistemas poliméricos Aebischer and Ridet TINs; 2000 LPAlmeida
3 Transferência de genes com vectores lentivirais HIV-1 VPR VPU VIF LTR GAG PRO POL Genoma do vector ENV TAT REV NEF LTR Terceira geração - Seguros Sem capacidade de replicação LTR GAG RRE SD y SA PGK Transgene WHV SIN Transdução de células que não se dividem Neurotropismo Célula alvo Expressão prolongada Ausência de resposta imunitária LPAlmeida
4 Transferência de genes para diferentes regiões do sistema nervoso central do rato RNA genome integrase RNA genome reverse transcriptase integrase reverse transcriptase RNA genome integrase reverse transcriptase surface glycoprotein transmembrane proteins matrix capsid nucleocapsid matrix capsid nucleocapsid surface glycoprotein transmembrane proteins matrix capsid nucleocapsid surface glycoprotein transmembrane proteins estriado SN Medula espinal a células com o gene de interesse LPAlmeida
5 (CAG)n Doença de Huntington 8-29 normal >40 Doença de Huntington huntingtin gene Gene da Huntingtina - 67 exões kb - cromossoma 4 Neurónios Gabaérgicos transcrição tradução NH 2 Huntingtina - 350kDa Movimentos involuntários descoordenados, demencia, depressão, psicose morte anos após manifestação Sem terapia Modelos transgénicos com neurodegeneração, quando existente, muito ligeira striatum LPAlmeida
6 Vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas Gene mutado 1 vector lentiviral 5 LTR Promotor Gene da doença 3 LTR Injecção no cérebro 3 2 Produção de vectores lentivirais Modelos animais 4 - Doença de Huntington - Doença de Machado-Joseph - Doença de Parkinson - Doença de Alzheimer LPAlmeida
7 Produção de um modelo da doença de Huntington utilizando vectores lentivirais Huntingtina controlo 19 Q Ausência de agregados de huntingtina Vectores Huntingtina mutante Vectores controlo transgene Vectores Huntintina mutante transgene Huntingtina mutante 82 Q Agregados de huntingtina 50 µm Ausência de lesão neuronal Lesão neuronal 100 µm Injecção estereotáxica no cérebro do rato 0.5mm LPAlmeida
8 Utilização de vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas Novos modelos genéticos Transponíveis para outras espécies Estudo dos mecanismos moleculares da doença in vivo Avaliação de terapias
9 Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 ou doença de Machado Joseph (CAG)n n= 61 a 84 doença gene da ataxina-3-14q32.1 gene SCA3/MJD1 n= normal transcrição translação NH 2 Ataxina 3 42 kda Doença neurodegenerativa Maior incidência em Portugal (Ilha das Flores) Principal sintoma: ataxia - descoordenação dos movimentos musculares voluntários Taroni F & DiDonato Nat Rev Neurosci Aug;5(8): LPAlmeida
10 Nova estratégia para o tratamento da doença de Machado-Joseph silenciamento da expressão da ataxina-3 mutante com vectores lentivirais Ataxina mutante + sequencias controlo Ataxina mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante AGCAGCAGGGGGACCTATC shatax wt TCGTCGTCCCCCTGGATAG T T C A A A G A G AGCAGCAGCGGGACCTATC shatax mut TCGTCGTCGCCCTGGATAG T T C A A A G A G
11 Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante Ataxina-3 mutante + sequencias controlo Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32 1H9 DARPP-32 Dupla marcação Ataxina-3 mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante 1H9 DARPP-32 Ausência de agregados e de perda de DARPP-32 3 semanas LPAlmeida
12 Vectores lentivirais: plataforma tecnológica de administração no Sistema Nervoso Central Gerar novos modelos animais de doenças do Sistema Nervoso Central Validar alvos terapêuticos Therapeutic gene Therapy Terapia/validação / validation de of alvos molecular moleculares targets Mutant gene Modelos Models of de doença disease Terapia génica para o Sistema Nervoso Central LPAlmeida
13 Agradecimentos MIRCen Nicole Déglon Philippe Hantraye Emmanuel Brouillet Raymonde Hassig Nöelle Dufour Veronica Colomer Johns Hopkins School of Medicine, USA Sebastian Kugler Gottingen University, DE Patrick Aebischer Ruth Luthi-Carter Étienne Regulier Philippe Colin Valérie Perrin Sandro Alves Isabel Ferreira Ana Luísa Carvalho Conceição Pedroso Lima Sérgio Simões João Nuno Moreira
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22 Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante Ataxina-3 mutante + sequencias controlo Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32 1H9 DARPP-32 Dupla marcação Ataxina-3 mutante + sequências para silenciamento ataxina-3 mutante 1H9 DARPP-32 Ausência de agregados e de perda de DARPP-32 3 semanas LPAlmeida
23 Vectores lentivirais que expressam RNAs curtos de cadeia dupla permitem silenciar a expressão da ataxina-3 mutante envolvida na doença de Machado-Josephpotencial interesse terapêutico
24 Huntingtina controlo 19 Q Huntingtina mutante 82 Q Lentiviral-based Model of Huntington s disease in adult rats transgene transgene Agregados de huntingtina Lesão neuronal Vectores controlo Vectores Huntingtina mutante 50 µm 100 µm 0.5mm de Almeida et al. (2002) J. Neurosci. 22:
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