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1 (11) (21) PI A (22) Data de Depósito: 05/04/2005 (43) Data de Publicação: 30/10/2007 República Federativa do Brasil (RPI 1921) Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial (51) Int. CL: C12N 15/86 ( ) (54) Título: VÍRUS DE ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, VETOR DE VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, MÉTODOS PARA IMUNIZAR UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO CONTRA INFECÇÃO BACTERIANA E CONTRA INFECÇÃO VIRAL (30) Prioridade Unionista: 09/04/2004 US 60/561,214; 19/01/2005 US 60/644,902 (57) Resumo: VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, VETOR DE VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, MÉTODOS PARA IMUNIZAR UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO CONTRA INFECÇÃO BACTERIANA E CONTRA INFECÇÃO VIRAL. A presente invenção refere-se amplamente à atenuação sinérgica do vírus da estomatite vesicular (VSV). Mais particularmente, a invenção refere-se à identificação de classes de mutação combinadas que atenuam sinergicamente a patogenicidade dos vetores de VSV em mamíferos e às suas composições imunogênicas. (71) Depositante(s): Wyeth (US) (72) Inventor(es): David Kirkwood Clarke, Roger Michael Hendry, Stephen A. Udem, Christopher Lee Parks (74) Procurador: MOMSEN, LEONARDOS & CIA. (86) Pedido Internacional: PCT US2005/ de 05/04/2005 (87) Publicação Internacional: WO 2005/ de 20/10/ E 05 Alleeliellee._ 100E E e E+04 1 oor+ox g. i " 1 ODE 01 ro 4,7 ir-. -e- rvsvin -e- rvsvin-ct1-gag5 -A- rvsvin-n2ct1 -e- rvsvin-n3ct Tempo (hrs)

2 , il, o, *, "VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, VETOR DE VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR GENETICAMENTE MODIFICADO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, MÉTODOS PARA IMUNIZAR UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO CONTRA 5 INFECÇÃO BACTERIANA E CONTRA INFECÇÃO VIRAL" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral aos campos da virologia, microbiologia, doença infecciosa e imunologia. Mais particularmente, a invenção refere-se à atenuação sinérgica do vírus da 10 estomatite vesicular e aos seus vetores, por combinação de classes de mutação diferentes. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Vírus da estomatite vesicular (VSV), um membro da família Rhabdoviridae, possui um genoma de RNA de fita única, senso-negativo, 15 não-segmentado. Seu genoma de onde kb possui cinco genes que codificam cinco proteínas estruturais do vírus; a proteína de nucleocapsídeo (N), que é requerida em quantidades estequiométricas para encapsidação do RNA replicado; a fosfoproteína (P), que é um cofator da RNA polimerase dependente de RNA (L); a proteína matriz (M) e a glicoproteína de fixação 20 (G) (por exemplo, veja Gallione et al., 1981; Rose e Gallione, 1981; Rose e Schubert, 1987 e Schubert et al., 1985; Patente U.S ; Patente U.S ). VSV é um vírus proveniente de artrópode que pode ser transmitido a uma variedade de hospedeiros mamíferos, mais comumente 25 gado bovino, cavalos, porcos e roedores. Infecção por VSV de humanos é 1 incomum, e em geral é quer assintomática quer caracterizada por sintomas semelhantes à gripe suave que passam depois três a oito dias sem complicações. Devido ao fato de VSV não ser considerado um patógeno de humano, e a imunidade pré-existente ao VSV ser rara na população humana, o

3 2 desenvolvimento de vetores derivados de VSV tem sido um foco em áreas tais como composições imunogênicas e terapia genética. Por exemplo, estudos têm estabelecido que VSV pode servir como um vetor elevadamente efetivo para composições imunogênicas, expressando hemaglutinina do vírus da 5 influenza (Roberts et al., 1999), proteína H do vírus do sarampo (Schlereth et al., 2000) e proteínas gag e env de HIV-1 (Rose et al., 2001). Outras características de VSV que o tornam um vetor atrativo incluem: (a) a capacidade para se replicar robustamente em cultura celular; (b) a incapacidade para quer se integrar dentro do DNA da célula hospedeira quer 10 sofrer recombinação genética; (c) a existência de sorotipos múltiplos, permitindo a possibilidade de estratégias de imunização inicial - reforçadora; (d) genes estranhos de interesse podem ser inseridos no genoma de VSV e expressados abundantemente por transcriptase reversa; e (e) o desenvolvimento de um sistema elevadamente especializado para o resgate de 15 vírus infeccioso de uma cópia de cdna do genoma do vírus (Patente U.S ; Patente U.S ). Embora haja pouca evidência o envolvimento neurológico de VSV durante infecção natural, animais (por exemplo, primatas, roedores, animais de rebanho) que são inoculados intracerebralmente (e no caso de 20 roedores instranasalmente) com vírus de tipo selvagem, vírus de tipo selvagem passado em cérebro de camundongo ou vírus de tipo selvagem adaptado à cultura celular, podem desenvolver sinais clínicos de doença, e normalmente morrem dois a oito dias após a infecção. Por causa destas observações, e a necessidade de produzir um vetor para composições 25 imunogênicas para uso em humanos que possui um perfil de segurança excepcional, vetores de VSV sob desenvolvimento são testados em modelos estringentes de neurovirulência em animal pequeno e em primata. Estes testes são planejados para detectarem qualquer virulência residual em vetores de VSV atenuados antes da consideração para avanço em testes clínicos em

4 3 humanos. A atenuação de vetores de VSV-prototípicos resultou do acúmulo de múltiplas substituições de nucleotídeo através do genoma de vírus durante passagem serial in vitro e a síntese e a montagem do DNA genômico. 5 Estas mutações tiveram efeitos pleiotrópicos que tornaram o vírus menos patogênico em camundongos do que o vírus de laboratório do qual ele fora derivado (por exemplo, veja Roberts et al., 1998). Vetores de VSV prototípicos adicionalmente atenuados também foram desenvolvidos por truncação da região de cauda citoplásmica da proteína G de vírus, acarretando 10 mutantes de VSV que foram defectivos em brotamento da membrana plasmática de células infectadas (Schnell et al., 1998). Vetores de VSV correntemente conhecidos, putativamente atenuados ou não, têm tido níveis inaceitáveis de virulência residual quando testados em modelos de virulência e primata não-humano e em animal. O 15 desenvolvimento de um vetor de VSV para usos tais como um vetor para composições imunogênicas, um vetor de terapia genética e semelhantes, requererá vetores de VSV possuindo níveis mínimos ou não detectáveis de patogenicidade em modelos de virulência em animal. Assim, presentemente há uma necessidade na técnica de vetores virais para identificar mutantes de 20 VSV atenuados, geneticamente modificados possuindo patogenicidade em mamíferos significativamente reduzida (ou eliminada). SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção amplamente se refere à atenuação sinérgica de vírus da estomatite vesicular (VSV). Mais particularmente, a 25 invenção refere-se à identificação de classes de mutação combinadas que atenuam sinergicamente a patogenicidade de vetores de VSV em mamíferos e às suas composições imunogênicas. Assim, em certas modalidades, a invenção refere-se a um VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes

5 4 de mutações em seu genoma, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Em uma modalidade específica, a patogenicidade de VSV é adicionalmente definida como neurovirulência. Em outra modalidade, as classes de mutações são uma mutação sensível à 5 temperatura (ts), uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em uma modalidade específica, as duas mutações de VSV são 10 uma mutação de gene G truncado (daqui em diante, "G( co") e uma mutação de rearranjo de gene N (isto é, o gene N é movido para longe de sua primeira posição promotor-proximal 3' de tipo selvagem, para uma posição mais distal na ordem do gene de VSV). Em outra modalidade, a proteína G de VSV codificada pelo gene G truncado possui uma deleção nos últimos vinte 15 aminoácidos carbóxi-teiminais (daqui em diante, "G( ct_9)"). Em ainda outra modalidade, a proteína G de VSV codificada pelo gene G truncado possui uma deleção dos últimos vinte e oito aminoácidos carbóxi-terminais (daqui em diante, "G (ct_0"). Em ainda outra modalidade, o gene N de VSV é rearranjado para 3'-PNMGL-5' ou 3'-PMNGL-5', em relação ao genoma de 20 tipo selvagem 3'-NPMGL-5' de VSV de tipo selvagem, no qual N é o gene codificador da proteína de nucleocapsídeo, P é o gene codificador da fosfoproteína, M é o gene codificador de glicoproteína de fixação e L é o gene codificador da proteína RNA polimerase dependente de RNA. Em certas modalidades, o VSV compreende um genoma mutado de 3'-PNMG (ct _ i)l-5', 25 3'-PNMG(ct_9)L-5', 3'-PMNG( ct_i)l-5' ou 3'-PMNG(et_9)L-5', nos quais N é o gene codificador da proteína de nucleocapsídeo, P é o gene codificador da fosfoproteína, M é o gene codificador da proteína matriz, G( ct _ i) é o gene codificador da glicoproteína de fixação possuindo uma região de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido, G( ct_9) é o gene codificador da

6 5 glicoproteína de fixação possuindo uma região de cauda citoplásmica de nove aminoácidos e L é o gene codificador da proteína RNA polimerase dependente de RNA. Em uma modalidade específica, o genoma mutado é 3'- PMNG(et _ ol-5'. Em outra modalidade específica, o genoma mutado é 3'- 5 PNMG(ct _ i)l-5'. Em outra modalidade, o VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação G-stem, uma mutação de gene G, uma mutação de deleção de gene ou uma mutação não-citopática de gene M. 10 Em certas modalidades, o VSV modificado injetado intracranialmente em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em certas outras modalidades, o VSV intracranialmente 15 injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades, o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade 20 \ possui uma LD vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades, o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem 25 intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em outras modalidades da invenção, as duas mutações de VSV são uma mutação de gene G truncado e uma mutação não-citopática de gene M. Em certas modalidades, a proteína G codificada pelo gene G

7 6 truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G( ct_o) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G(ct-9)). Em outras modalidades, a mutação não-citopática de gene M (daqui em diante, "M (ncp)") é uma mutação de metionina para alanina 5 na posição 33 (M33A) e uma mutação de metionina para alanina na posição 51 (M51A) da proteína M. Em uma modalidade específica, o VSV compreende um genoma mutado de 3'-NPM( ncp)g(ct_i)l-5' ou 3'-NPM(ncp)G(ct- 9)L-5'. Em outra modalidade, o vírus compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma 10 mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação de deleção de gene, uma mutação de inserção de gene, uma mutação de inserção de gene G, uma mutação G-stem, ou uma mutação pontual. Como descrito abaixo na Seção A.3, uma mutação ts de qualquer um dos genes G, M, N, P ou L de VSV é uma "classe de mutação" 15 separada da invenção. Assim, em certas modalidades da invenção, as duas mutações de VSV são uma mutação ts de gene N (daqui em diante, "N (ts)") e uma mutação ts de gene L (daqui em diante, "L( ts)"). Em uma modalidade específica, o VSV compreende um genoma mutado de 3'-N (ts)pmgl(ts)-5'. Em certas outras modalidades, o VSV compreende adicionalmente uma 20 terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G ou uma mutação de deleção de gene. 25 Em certas modalidades, as duas mutações de VSV são uma mutação G-stem (daqui em diante, "G(stem)") e uma mutação de rearranjo de gene. Em outras modalidades, o VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação

8 7 não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em outra modalidade, a invenção refere-se a um vetor de VSV 5 geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA estranho como uma unidade transcricional separada inserida dentro ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Como definido 10 daqui em diante, uma seqüência de "RNA estranho" é qualquer seqüência de polinucleotídeo que não é endógena ao genoma do VSV de tipo selvagem. Em uma modalidade específica, patogenicidade de vetor é adicionalmente definida como neurovirulência. Em certas outras modalidades, o RNA estranho é definido como uma estrutura de leitura aberta (ORF). Em certas 15 outras modalidades, as classes de mutações são selecionadas do grupo consistindo de uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. 20 Em uma modalidade específica, as duas mutações de vetor de VSV são uma mutação de gene G truncado e uma mutação de rearranjo de gene N. Em outra modalidade, a proteína G codificada pelo gene G truncado possui uma deleção dos últimos vinte aminoácidos carbóxi-terminais ou uma deleção dos últimos vinte e oito aminoácidos carbóxi-terminais. Em certas 25 outras modalidades, o gene N do vetor de VSV está rearranjado para 3'- PNMGL-5' ou 3'-PMNGL-5', relativo ao genoma 3'-NPMGL-5' de VSV de tipo selvagem. Em uma modalidade específica, o vetor de VSV compreende um genoma mutado de 3 ' -PNMG( ct _ i )L-5', 3' -PNMG( ct_9)l-5', 3' -PMNG (c,_ DL- 5' ou 3' -PMNG (c,9)l-5'. Em uma modalidade específica, o genoma de vetor

9 8 mutado é 3'-PMNG (ct_ i)l-5'. Em outra modalidade, o genoma de vetor mutado é 3'-PNMG (ct _ i)l-5'. Em ainda outras modalidades, o vetor de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a 5 mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação G-stem, uma mutação de gene G, uma mutação de deleção de gene ou uma mutação não-citopática de gene M. Em certas modalidades, o VSV modificado injetado intracranialmente em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD vezes 10 maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em certas outras modalidades, o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos 15 fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades, o VSV intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss- Webster de 4 semanas de idade. Em ainda outras modalidades, o VSV 20 intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss-Webster de 4 semanas de idade possui uma LD vezes maior do que a de VSV de tipo selvagem intracranialmente injetado em camundongos fêmeas Swiss- Webster de 4 semanas de idade. Em certas outras modalidades, o RNA estranho inserido dentro 25 ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene de CMV, um gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de Varicela- Zoster, um gene de vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus

10 9 do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de alfavírus, um gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de 5 vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus pneumoniae, um gene de Streptococcus Neisseria gonorrheae, um gene de Corynebacteria diphtheria, um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de 10 Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um gene de Escherichia coli, um gene de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em outra modalidade 15 específica, o gene de HIV é gag, no qual o gene gag é inserido no genoma de VSV na posição um ou na posição cinco. Em modalidades específicas, o genoma do vetor de VSV mutado é 3 '-gag i -PNMG(ct _ i)l-5 ', 3 '-gagi-pnmg(ct- 9)-5 ', 3 '-gag i -PMNG(ct_oL-5 ', 3 '-gag i -PMNG(e6t _9)L-5 ', 3 ' -PNMG( ct _ i )L-gag s - 5 ', 3 '-PNMG(et_9)L-gag5-5', 3 '-PMNG(ct_oL-gag5-5 ' ou 3 ' -PMNG (ct_9)l-gag '. Em outra modalidade, o RNA estranho expressa um antígeno específico de tumor ou antígeno associado a tumor, para indução de uma resposta imune protetora contra um tumor (por exemplo, um tumor maligno). Tais antígenos específicos de tumor e associado a tumor incluem, mas não são 25 limitados a, antígeno de pan-carcinoma KS 1/4; antígeno de carcinoma ovariano (CAl25); fosfato ácido prostático; antígeno específico de próstata; antígeno p9'7 associado a melanoma; antígeno p75 de melanoma; antígeno de melanoma de peso molecular alto e antígeno de membrana específico de próstata.

11 10 Em certas outras modalidades, as duas mutações de vetor de VSV são uma mutação G(co e uma mutação M (n,p). Em certas modalidades, a proteína G codificada por gene G truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G( ct_o) ou um domínio de cauda 5 citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G(ct-9)). Em ainda outras modalidades, a mutação M(ricp) é uma mutação de metionina para alanina na posição 33 (M33A) e uma mutação de metionina para alanina na posição 51 (M51 A) da proteína M. Em uma modalidade específica, o genoma mutado é 3'-NPM(ncp)G(ct_i)L-5' ou 3'-NPM( r,cp)g(ct_9)l-5'. Em outra modalidade, o vetor 10 compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G, e uma mutação de deleção de gene. Em certas modalidades, o vetor de VSV compreende um gene de HIV selecionado do 15 grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em uma modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o genoma mutado é 3'- g ag i -NPM(n,p)G(c, i)l-5 ', 3 ' -gag i -NPM(ncp)G(c,9)L-5 ', 3 ' -NPM (ncp)g(c,_ DL-gag 5-5 ' ou 3 '-NPM(ncp)G(ct _9)L-gag 5-5'. Em ainda outras modalidades, as duas mutações de vetor de 20 VSV são uma mutação de gene N (ts) e uma mutação de gene L( ts). Em uma modalidade específica, o vetor compreende um genoma mutado de 3'- N(ts)PMGL(ts)-5 3. Em outras modalidades, o vetor compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, 25 uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em certas modalidades, o vetor de VSV compreende um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em uma modalidade específica, o gene de

12 11 HIV é gag, no qual o genoma mutado é 3'-gag i -N(ts)PMGL(t s-5' ou 3'- N(ts)PMGL(ts)-gag5-5'. Como descrito abaixo na Seção A.1, a inserção de uma seqüência de ácido nucleico estranho (por exemplo, gag de HIV) no genoma 5 de VSV 3' a qualquer um dos genes N, P, M, G ou L efetivamente resulta em uma "mutação de rearranjo de gene". Assim, em certas modalidades, as duas mutações de vetor de VSV são mutação G(stem) e uma mutação de rearranj o de gene. Em uma modalidade, o genoma de vetor mutado é 3'-gagr NPMG(stem)L-5'. Em outras modalidades, o vetor de VSV compreende 10 adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambisentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. 15 Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo uma dose imunogênica de um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA estranho como uma unidade transcricional separada inserida em ou substituindo uma 20 região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Em outra modalidade, as classes de mutações são selecionadas do grupo consistindo de uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação 25 de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em certas modalidades, as duas mutações são uma mutação de gene G truncado e uma mutação de rearranjo de gene N. Em modalidades específicas, a proteína G codificada pelo gene G truncado possui um domínio

13 12 de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G(ct-i)) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G( ct_9)). Ainda em outras modalidades, o gene N é rearranjado em 3'-PNMGL-5' ou 3'- PMNGL-5', em relação ao genoma 3'-NPMGL-5' de genoma de VSV de tipo 5 selvagem. Em certas modalidades, o vetor de VSV da composição imunogênica compreende um genoma mutado de 3'-NMG (ct _ i)l-5', 3'- PNMG(ct_9)L-5', 3 '-PMNG (ct _01,5' ou 3 '-PMNG (ct _9)L-5 '. Em uma modalidade específica, o genoma de vetor mutado da composição imunogênica é 3'-PMNG(ct _ i)l-5'. Em outra modalidade, o genoma de vetor 10 mutado é 3'-PNMG (ct_ i)l-5'. Em outras modalidades, o vetor de VSV da composição imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação pontual, uma mutação G-stem, uma mutação de inserção de gene G, uma mutação de deleção de gene ou uma 15 mutação não-citopática de gene M. Em certas outras modalidades, o RNA estranho inserido no vetor de VSV geneticamente modificado da composição imunogênica é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene 20 de CMV, um gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de Varicela- Zoster, um gene de vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de 25 alfavírus, um gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus pneumoniae, um gene de Streptococcus Neisseria gonorrheae, um gene de Corynebacteria diphtheria,

14 13 um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um gene de Escherichia coli, um gene de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade 5 específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em outra modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o gene gag é inserido no genoma de VSV na posição um ou na posição cinco. Em modalidades específicas, o genoma do vetor de VSV mutado é 3'-gagi-PNMG(ct_01,-5', 3'-gagi-PNMG(ct- 10 9)-5', 3 ' -gag i -PMNG(ct_ 01,-5 ', 3 ' -g agi-pmng(c6t-9)1,5 ', 3 ' -PNMG(ct _ i)l-gag 5-5 ', 3 ' -PNMG( ct_9)l-gag5-5 ', 3 '-PMNG(ct _ i)l-gag 5-5' ou 3 '-PMNG( ct_9)l-gag5-5'. Em certas outras modalidades, o vetor de VSV da composição imunogênica compreende uma mutação G( co e uma mutação M(ncp). Em outra 15 modalidade, a proteína G codificada pelo gene G truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G( ct_o) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G(ct-9)) Em outra modalidade, a mutação 1\4( cp) é uma mutação de metionina para alanina na posição 33 (M33A) e uma mutação de metionina para alanina na posição (M51A) da proteína M. Em uma modalidade específica, a composição imunogênica compreende o genoma de VSV mutado de 3'-NPM (ncp)g(ct _ i)l-5' ou 3'-NPM(ncp)G(ct-9)1,-5' - Em ainda outras modalidades, o vetor de VSV da composição imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação 25 pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em ainda outras modalidades, o RNA estranho inserido no vetor de VSV geneticamente modificado da composição imunogênica é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um

15 14 gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene de CMV, um gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de Varicela-Zoster, um gene de vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de 5 rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de alfavírus, um gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um 10 gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus pneumoniae, um gene de Streptococcus Neisseria gonorrheae, um gene de Co7ynebacteria diphtheria, um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um gene de Escherichia coli, um gene 15 de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em outra modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o genoma mutado é 3'-gag NPM -(ncp)g(ct_i )L -5, 3'-gag - NPM(ncp)G(ct-9) '- 20 NPM( cp)g(ct _ o-l-gag 5-5 ' ou 3 ' -NPM (n,p)g-(ct _9)L-gag 5-5 '. Em certas outras modalidades, a composição imunogênica compreende uma mutação de gene N (ts) e uma mutação de gene L (ts). Em uma modalidade específica, a composição imunogênica compreende um genoma VSV mutado de 3'-N (ts)pmgl9,$)-5'. Em outras modalidades, a composição 25 imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em

16 15 ainda outras modalidades, o RNA estranho inserido no vetor de VSV geneticamente modificado da composição imunogênica é selecionado do grupo consistindo de um gene de HIV, um gene de HTLV, um gene de SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene de CMV, um 5 gene de vírus Epstein-Barr, um gene de vírus de Varicela-Zoster, um gene de vírus da caxumba, um gene do vírus do sarampo, um vírus do gene de influenza, um gene de poliovírus, um gene de rinovírus, um gene de vírus de hepatite A, um gene de vírus de hepatite B, um gene de vírus de hepatite C, um gene de vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene de alfavírus, um 10 gene de vírus da rubéola, um gene de vírus da raiva, um gene de vírus Marburg, um gene de vírus Ebola, um gene de papilomavírus, um gene de poliomavírus, um gene de metapneumovírus, um gene de coronavírus, um gene de Vibrio chlolera, um gene de Streptococcus pneumoniae, um gene de Streptococcus Neisseria gonorrheae, um gene de Corynebacteria diphtheria, 15 um gene de Clostridium tetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene de Helicobacter pylori, um gene de Haemophilus, um gene de Chlamydia, um gene de Escherichia coli, um gene de citocina, um epítopo auxiliar T, um epítopo CTL, um gene adjuvante e um gene co-fator. Em uma modalidade específica o RNA estranho é um gene de HIV selecionado do grupo 20 consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em outra modalidade específica, o gene de HIV é gag, no qual o genoma mutado é 3'-gagr N(ts)PMG(ts)L-5 ' ou 3 '-1\1 (ts)pmgl(ts)-gag5-5'. Em certas outras modalidades, a composição imunogênica compreende uma mutação G(stem) e uma mutação de rearranjo de gene. Em 25 uma modalidade específica, a composição imunogênica compreende um genoma mutado de 3'-gagi-NPMG(stem)L-5'. Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação não-citopática

17 16 de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em ainda outra modalidade, uma composição imunogênica da 5 invenção é administrada por qualquer rota convencional selecionada do grupo consistindo de intravenosa, intradermal, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, oral, retal, intranasal, bucal, vaginal e ex vivo. Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método de imunizar um indivíduo mamífero contra infecção por HIV compreendendo 10 administrar ao indivíduo um dose imunogênica de um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA de HIV como uma unidade transcricional separada inserida em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas 15 mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV e o RNA de HIV codifica um antígeno selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev e vpu. Em certas modalidades, o vetor de VSV é 3'-gag1- PNMG(ct_ 1)L-5', 3'-gag i -PNMG(ct..9)L-5', 3'-gag 1 PMNG(ct _ 1)L-5', 3'-g ag i (ct _9)L-5', 3 1-PNMG(ct_1)L-gag5-5', 3I-PNMG( ct_9)l-gagá-5', 3 1-PMNG(ct- -PMNG 20 0L- gag 5-5', 3'-PMNG(ct _9)L-gag á-5', 3'-gag,-NPM( ncp)g(ct_ 1 )L-5', 3 I-gagi- NPM(nep)G(ct _9)L-5', 3'-NPM (ncp)g(ct_ 1) L-gag 5-5', 3'-NPM (ncp)g(ct _ 9) L-gag 5-5', 3'- gag 1 -N(ts)PMGL (ts)-5' ou 3'- N ( )PMGL(ts)-gag 5-5'. Em certas outras modalidades, a invenção refere-se a um método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção bacteriana 25 compreendendo administrar uma dose imunogênica de um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo (a) pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma, as mutações selecionadas do grupo consistindo de uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene

18 17 M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV e (b) pelo menos uma seqüência de RNA estranho inserida em ou substituindo 5 uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual o RNA codifica uma proteína bacteriana selecionada do grupo consistindo de proteína de Vibrio cholerae, uma proteína de Streptococcus pneumoniae, uma proteína de Streptococcus pyogenes, uma proteína de Streptococcus agalactiae, uma proteína de Helionacter pylori, uma proteína de Neisseria meningitidis, uma 10 proteína de Neisseria gonorrheae, uma proteína de Corynebaceria diphtheriae, uma proteína de Clostridium tetani, uma proteína de Bordetella pertussis, uma proteína de Haemophilus, uma proteína de Chlamydia e uma proteína de Escherichia coli. Em uma modalidade específica, as duas mutações são uma 15 mutação G (co e uma mutação de rearranjo de gene N. Em certas modalidades, a proteína G codificada pelo gene G truncado possui um domínio de cauda citoplásmica consistindo de um aminoácido (G(ct_o) ou um domínio de cauda citoplásmica consistindo de nove aminoácidos (G( ct_9)). Em certas outras modalidades, o gene N é rearranjado para 3'-PNMGL-5' ou 31-PMNGL-5', 20 em relação ao genoma 3'-NPMGL-5' de VSV de tipo selvagem. Em outras modalidades, o genoma de VSV mutado é 3'-PNMG( ct_dl-5', 3'-PNMG(ct _9)L- 5, 3'-PMNG( ct_1)l-5' ou 3'-PMNG( ct_9)l-5'. Em uma modalidade específica, o genoma mutado é 3 '-PMNG (ct _ 01,-5 ' ou 3 '-PNMG( ct _ i)l-5 '. Em outras modalidades, o VSV compreende adicionalmente 25 uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de deleção de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de inserção de gene G, uma mutação de inserção de gene ou uma mutação não-citopática de gene M.

19 18 Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção viral compreendendo administrar uma dose imunogênica de um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo (a) pelo menos duas classes diferentes de 5 mutações em seu genoma, as mutações selecionadas do grupo consistindo de uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene, no qual as duas 10 mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV e (b) pelo menos uma seqüência de RNA estranho inserida em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual o RNA codifica uma proteína bacteriana selecionada do grupo consistindo de uma proteína de HIV, uma proteína de HTLV, uma proteína de SIV, uma proteína de RSV, uma 15 proteína de PIV, uma proteína de HSV, uma proteína de CMV, uma proteína de vírus Epstein-Barr, uma proteína de vírus Varicela-Zoster, uma proteína de vírus da caxumba, uma proteína de vírus do sarampo, uma proteína do vírus de influenza, uma proteína de poliovírus, uma proteína de rinovírus, uma proteína de vírus da hepatite A, uma proteína de vírus da hepatite B, uma 20 proteína de vírus de hepatite C, uma proteína de vírus Norwalk, uma proteína de togavírus, uma proteína de alfavírus, uma proteína de vírus da rubéola, uma proteína de vírus da raiva, uma proteína de vírus Marburg, uma proteína de vírus Ebola, uma proteína de papilomavírus, uma proteína de poliomavírus, uma proteína de metapneumovírus e uma proteína coronavírus. 25 Em uma modalidade específica, o RNA é um gene de HIV selecionado do grupo consistindo de gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev ou vpu. Em certas modalidades, as duas mutações são uma mutação G(ct) e uma mutação de rearranjo de gene N. Em uma modalidade específica, o genoma de VSV mutante é 3'.-PNMG( ct_01,-5', 3'-PNMG (ct _ 9)L-5', 3'-

20 19 PMNG(ct _ i)l-5' ou 3'-PMNG( ct_9)l-5'. Em outra modalidade, o gene de MV é gag, no qual o gene gag é inserido no genoma de VSV na posição um ou na posição cinco, no qual o genoma mutado é 3'-gagi-PNMG(ct_i)L-5', 3'-gag1- PNMG(ct_9)L-5 ', 3' -g agi-pmng(ct_i)l-5 3 -gagi-pmng( c t_ i)l-5 ', 3 ' -PNMG(ct- 5 1)L-gag 5-5', 3'-PNMG (c,_9)l-gag á-5', 3'-PMNG(ct _ i)l-gag á-5', 3'-PMNG(ct _9)Lgag5-5'. Em outra modalidade, o VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação ts, uma mutação pontual, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de deleção de gene, uma mutação G-stem, uma mutação de inserção de gene 10 ts, uma mutação de inserção de gene ou uma mutação não-citopática de gene M. Em outras modalidades do método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção viral, as duas mutações de VSV são uma mutação G(ct) e uma mutação M( ricp). Em uma modalidade específica, o genoma de VSV 15 mutado é 3'..-NPM( ncp)g(ct-1)l-5 ou 3'-NPM( ncp)g(ct _9)L-5'. Em outra modalidade, o genoma mutado é 3'-gagi-NPM( c,-,p)g(ct _ i)l-5' ou 3'-gagi- NPM(cnp)G(ct _9)L-5', 3 9.-NPM(enp)G(ct_ 1 )1, -* gag5-5 9 ou 3 5-NPM(cnp)G(ct_9)L -gag5-5 '. Em outra modalidade, genoma de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação 20 ts, uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação listem, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em outras modalidades do método de imunizar um hospedeiro mamífero contra infecção viral, as duas mutações de VSV são uma mutação 25 de gene N(ts) e uma mutação de gene L( ts). Em uma modalidade específica, o genoma de VSV mutado é 3'-N (ts)pmgl(ts)-5', 3'-gag i-nts)pmgl( )-5' ou 3'- N(ts)PMGL(ts)-gag5-5'. Em outra modalidade, o genoma de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de gene, uma

21 20 mutação G-stem, uma mutação não-citopática de gene M, uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de gene G e uma mutação de deleção de gene. Em outras modalidades do método de imunizar um hospedeiro 5 mamífero contra infecção virai, as duas mutações e VSV são uma mutação G(stem) e ma mutação de rearranjo de gene. Em uma modalidade, o genoma de VSV compreende adicionalmente uma terceira classe de mutação em seu genoma, no qual a mutação é uma mutação pontual, uma mutação ts, uma mutação de rearranjo de gene, uma mutação não-citopática de gene M, uma 10 mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de gene G truncado, uma mutação de gene G e uma mutação de deleção de gene. Outras características e outros aspectos da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de suas modalidades preferidas e das reivindicações. 15 BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1 mostra a cinética de crescimento (pfu/ml versus tempo) de VSV de tipo selvagem (3'-NPMGL-5'), mutantes de VSV rearranjados N (3'-PNMGL-5' [N2], 3'-PMNGL-5' [N3] e 3'-PMGNL-5' [N4]), mutantes de VSV de truncação de cauda citoplásmica (ct) de proteína 20 G (3'-NPMG( ct_9)l-5' [CT9] e 3'-NPMG( ct_ol-gag á-5' [CT1-GAG5]) e mutantes de truncação de ct de proteína G / rearranjados N de VSV combinados (3 ' -PNMG( ct_ DL-5 ' [N2CT1], 3 '-PNMG (ct _9)L-5 ' [N2CT9], 3 - PMNG(ct _ 1)1,-5 ' [N3CT1] e 3'-PMNG(ct_9)L-5' [N3CT9]). A abreviação "in" mostrada na legenda da figura inserida representa a cepa indiana de VSV. 25 Figura 2 é uma comparação de cinética de crescimento de mutantes de VSV rearranjados N (3'-PNMGL-5', 3'-PMNGL-5'e 3'- PMGNL-5') em relação ao VSV de tipo selvagem (3'-NPMGL-5') e ao mutante de VSV de ct-1 de proteína G (3'-NPMG (ct _ 9)L-gag á-5'). Figura 3 mostra uma comparação das taxas de crescimento de

22 21 mutantes de ct-1 de proteína G / rearranjado N de VSV combinados (3'- PNMG(ct _ i)l-5', e 3-PMNG(ct _ ol-5') em relação ao VSV de tipo selvagem (3'- NPMGL-5') e a um mutante de VSV de ct-1 de proteína G (3'-NPMG (c, i)lgag 5-5'). 5 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção descrita aqui adiante atende à necessidade na técnica por vetores de vírus de estomatite vesicular (VSV) possuindo patogenicidade significativamente atenuada em mamíferos, particularmente neuropatogenicidade atenuada como revelado em modelos de neurovirulência 10 animal. Como descrito acima VSV possui muitas características que o tornam um vetor interessante para composições imunogênicas e/ou terapia genética. Por exemplo, infecção por VSV de humanos é incomum e é quer assintomática quer caracterizada por sintomas semelhantes à gripe suave que passam depois três a oito dias sem complicações, e como tal, VSV não ser 15 considerado um patógeno de humano. Outras características de VSV que o tornam um vetor atrativo incluem: (a) a capacidade para se replicar robustamente em cultura celular; (b) a incapacidade para quer se integrar dentro do DNA da célula hospedeira quer sofrer recombinação genética; (c) a existência de sorotipos múltiplos, permitindo a possibilidade de estratégias de 20 imunização inicial - reforçadora; (d) genes estranhos de interesse podem ser inseridos no genoma de VSV e expressados abundantemente por transcriptase reversa; e (e) o desenvolvimento de um sistema elevadamente especializado para o resgate de vírus infeccioso de uma cópia de cdna do genoma do vírus (Patente U.S ; Patente U.S ) e (f) pré-existência de 25 imunidade ao VSV na população humana é não freqüente. Vetores de VSV atenuados de uma classe inicial descritos na técnica referiram-se aos mutantes sensíveis à temperatura (ts), no qual os mutantes ts falharam em produzir vírions em uma temperatura restritiva. Por exemplo, vários mutante ts de VSV são conhecidos na técnica (veja, por

23 22 exemplo Holloway et al., 1970; Pringle et al., 1971; Evans et al. 1979; Pringle et al., 1981; Monta et al.; 1987; Gopalakrishna e Lenard, 1985). Em adição, outras classes de mutantes de VSV atenuados também têm sido descritas na técnica e incluem mutações de cauda citoplásmica (ct) truncada 5 de proteína G de VSV (Schnell et al., 1998), mutações de rearranjo de gene (ou de rearranjo de ordem de gene) (Wertz et al., 1998; Ball et al., 1999; Flanagan et al., 2001; Patente U.S ), mutações G-stem (Jeetendra et al., 2003; Jeetendra et al., 2002; Robinson e Whitt, 2000), mutações de proteína M não-citopática (Finke e Conzelmann, 1997; Finke e Conzelmann ). Contudo, como enunciado acima, vetores de VSV atenuados correntemente disponíveis retêm virulência residual quando testados em modelos animais, e como tais, não são provavelmente candidatos vetores para avanço em testes clínicos em humano. Como descrito aqui em detalhe, a presente invenção refere-se 15 às observações surpreendentes e inesperadas de que combinações de duas ou mais classes de mutações atenuantes (mutações de rearranjo de gene, mutações de truncação e de inserção de proteína G, mutações de RNA ambisentido, mutações de deleção de gene, e semelhantes) possuem um efeito sinérgico (em contraste com um efeito aditivo) sobre o nível resultante de 20 atenuação de patogenicidade alcançada. Por exemplo, é aqui demonstrado, que mutantes de truncação de proteína G de VSV, quando combinados com mutantes de gene N rearranjado, exerceram uma atenuação sinérgica de crescimento de VSV (Exemplo 2) e de neurovirulência (Exemplo 3). Em adição, certas modalidades da presente invenção referem-se às combinações 25 de outras classes de mutação, que também possuem um efeito sinérgico sobre a atenuação de VSV. Tais classes incluem, mas não são limitadas a mutações ts, mutações pontuais, mutações de rearranjo de gene (incluindo rearranjos de gene N, P, M, G e L), mutações G-stem, inserções de gene G, mutações nãocitopáticas de gene M, mutações de gene G truncado (por exemplo, um

24 23 mutante ct), mutações de RNA ambi-sentido e mutações de deleção de gene. Assim, em certas modalidades, a invenção refere-se a um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos uma seqüência de RNA 5 estranho como uma unidade transcricional separada inserida em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. Em certas outras modalidades, a invenção refere-se às composições imunogênicas compreendendo um vetor de VSV geneticamente modificado compreendendo 10 pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma e pelo menos u ( ma seqüência de RNA estranho como uma unidade transcricional separada inserida em ou substituindo uma região do genoma de VSV não-essencial para replicação, no qual as duas mutações atenuam sinergicamente a patogenicidade de VSV. 15 A. CLASSES DE MUTAÇÃO DE VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR Como enunciado acima, um vetor de VSV geneticamente modificado da invenção compreende pelo menos duas classes diferentes de mutações em seu genoma. Como defmidos aqui em diante, os termos "classe 20 de mutação" ou "classes de mutação" são usados intercambiavelmente, e referem-se às mutações conhecidas na técnica, quando usadas individualmente, para atenuar VSV. Por exemplo, uma "classe de mutação" da invenção inclui, mas não se limita a, uma mutação de gene N sensível à temperatura de VSV (daqui em diante, "N( ts)"), uma mutação de gene L 25 sensível à temperatura (daqui em diante, "L( ts)"), uma mutação pontual, uma mutação G-stem (daqui em diante, "G(stem)"), uma mutação não-citopática de gene M (daqui em diante, "M (icp)"), uma mutação de rearranjo ou de reorganização de gene, uma mutação de gene G truncado (daqui em diante, "G(c0"), uma mutação de RNA ambi-sentido, uma mutação de inserção de

25 24 gene G, uma mutação de deleção de gene e semelhante. Como definido aqui em diante, uma "mutação" inclui mutações conhecidas na técnica como inserções, deleções, substituições, modificações de reorganização ou de rearranjo de gene. Coin-o definido aqui adiante, o termo "atenuação sinérgica" 5 refere-se a um nível de atenuação de VSV que é mais do que aditiva. Por exemplo, uma atenuação sinérgica de VSV de acordo com a presente invenção compreende combinar pelo menos duas classes de mutação no mesmo genoma de VSV, resultando deste modo uma redução de patogenicidade de VSV muito maior do que um nível de atenuação aditiva 10 observado em cada classe de mutação de VSV sozinha. Assim, em certas modalidades, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 pelo menos maior do que o nível de atenuação aditiva observado para cada classe de mutação sozinha (isto é, a soma das duas classes de mutação), no qual os níveis de atenuação (isto é, a LD 50) são determinados em um modelo 15 de virulência em animal pequeno. Por meio de um exemplo não limitante, se a equação (1) descreve uma "atenuação aditiva" de VSV: (1) AaLD 50 + AbLD50 = xlpso na qual AaLD 50 é a LD50 de um VSV possuindo uma primeira classe de mutação em seu genoma, AbLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo 20 uma primeira classe de mutação em seu genoma e xld 50 é a soma de AaLD 50 50; então uma "atenuação sinérgica" de VSV da invenção, possuindo e AbLD uma LD 50 pelo menos maior do que o nível de atenuação aditiva para cada classe de mutação sozinha, é descrita pela equação (2): (2) Aa,bLD 50 > (AaLD 50 + AbLD50); na qual Aa,bLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo uma 25 combinação de duas classes de mutação em seu genoma, AaLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo uma primeira classe de mutação em seu genoma e AbLD 50 é a LD 50 de um VSV possuindo uma primeira classe de mutação em

26 25 seu genoma. Assim, em certas modalidades, a sinergia de atenuação de VSV (isto é, duas classes de mutação em mesmo genoma de VSV) é descrita em relação à LD 50 de dois construtos de VSV (cada construto de VSV possuindo uma única classe de mutação em seu genoma), no qual a atenuação sinérgica 5 do VSV possuindo duas classes de mutação em seu genoma é definida como uma LD 50 pelo menos maior do que a LD 50 aditiva dos dois construtos de VSV possuindo uma única classe de mutação em seu genoma (por exemplo, veja valores de LD 50 de VSV na Tabela 7). Em certas outras modalidades, a sinergia de atenuação de VSV 10 é descrita em relação à LD 50 de um VSV de tipo selvagem. Assim, em uma modalidade, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual a LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em uma modalidade, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em outra modalidade, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos 100 vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em outra modalidade, 20 uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 modalidades, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD de VSV de tipo que é pelo menos vezes maior do que a LD 25 selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. Em certas outras modalidades, uma atenuação sinérgica de VSV é definida como uma LD 50 que é pelo menos vezes maior do que a LD 50 de VSV de tipo selvagem, no qual uma LD 50 é determinada em um modelo de virulência em animal. A determinação de uma dose letal 50% é determinada em um modelo de virulência em animal. Em ainda outras