DESENVOLVIMENTO E TESTE DE SISTEMA PARA A PREPARAÇÃO DO ÁCIDO LINOLÊNICO CONJUGADO

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1 DESENVOLVIMENTO E TESTE DE SISTEMA PARA A PREPARAÇÃO DO ÁCIDO LINOLÊNICO CONJUGADO Cleuciane Tillvitz do Nascimento [PIBIT/CNPq] 1, Clayton Antunes Martin [orientador] 1, Elton Gutendorfer Bonafe [Colaborador] 2 1 Departamento de Tecnologia em Processos Químicos - COPEQ Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR Rua Cristo Rei, Toledo - PR 2 Departamento de Química Universidade Estadual de Maringá - Avenida Colombo, Maringá PR tcleuciane@yahoo.com.br, claytonmartin@utfpr.edu.br, g_bonafe@yahoo.com.br Resumo Os ácidos graxos poli-insaturados tem uma importante função no organismo, que no caso da família ômega-3 envolve a diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Os isômeros conjugados dos ácidos linoleico (CLA) e alfa-linolênico (CLNA) têm sido relacionados com a prevenção da obesidade, diabetes e neoplasias. Este trabalho teve como objetivo desenvolver e testar um sistema para a produção do CLNA por meio da isomerização alcalina do óleo de linhaça. Para comprovar a formação de ligações duplas conjugadas do ácido linoléico (AL) e alfa-linolênico (AAL), foi realizada a espectroscopia na região UV-VIS (190 a 600 nm). Utilizando a espectroscopia no infravermelho (400 a 4000 cm -1 ) foi possível confirmar a formação de isômeros conjugados do AL e AAL. Os teores dos CLA e CLNA formados foram determinados por cromatografia gasosa. Ocorreu a formação dos isômeros 9cis,11trans-18:2 (4,6%) e 10trans, 12cis-18:2 (6,8%). Foram formados quatro isômeros CLNA, sendo identificado o isômero 9cis,11trans,13cis- 18:3 (1,8%). O principal isômero CLNA formado apresentou o teor de 28,8%. O grau de isomerização do AL e do AAL foi de 91 e 73%, respectivamente. A obtenção de um elevado teor de CLNA é de grande importância, considerando a perspectiva futura de incorporação destes isômeros em alimentos. Palavras-chave: ácido alfa-linolênico; óleo de linhaça; módulo de reação; CLNA. Abstract - The polyunsaturated fatty acids have an important function in the organism human, that for omega-3 acids involves a decreased risk of developing cardiovascular diseases. The isomers of conjugated linoleic acids (CLA) and alpha-linolenic acid (CLNA) have been associated to the prevention of obesity, diabetes and cancer. This study aimed to develop and test a system for the production of CLNA by alkaline isomerization of linseed oil. Occurrence of conjugated double bonds in linoleic acid (LA) and alpha-linolenic acid (ALA), was verified by UV-VIS spectroscopy (190 to 600 nm). Using infrared spectroscopy (400 to 4000 cm -1 ) was confirmed the formation of conjugated isomers of LA and ALA acids. CLA and CLNA levels were determined by gas chromatography. There was formation of isomers 9cis,11trans-18:2 (4.6%) e 10trans, 12cis-18:2 (6.8%). Were formed four CLNA isomers, being identified the isomer 9cis,11trans,13cis-18:3 (1,8%). The major CLNA isomer had level of 28.8%. Isomerization degree of ALA and LA were 91 and 73%, respectively. A high content of CLNA is extremely important, considering the future prospect of incorporation of these isomers in food. Keywords: alpha-linolenic acid, linseed oil; reaction module; CLNA.

2 INTRODUÇÃO Os ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) são ácidos graxos que apresentam duas ou mais insaturações na cadeia carbônica. A este grupo pertencem os ácidos linoleico e alfalinolênico. O ácido alfa-linolênico (18:3 n-3) é o precursor dos ácidos eicosapentaenóico (EPA, 20:5 n-3) e docosahexaenóico (DHA, 20:6 n-3), que estão associados à diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares, inflamatórias, depressão e desordens neurológicas. Nos mamíferos, o ácido linoléico (18:2 n-6) é o precursor do ácido araquidônico (20:4n-6), que está fortemente relacionado com o desenvolvimento do cérebro e da retina durante o período gestacional e nos primeiros meses de vida [1]. Os ácidos linoléico (AL) e alfa-linolênico (AAL) são denominados de essenciais por não serem sintetizados pelo organismo humano, devendo, portanto estar presente na dieta [2]. As grandes fontes alimentares do AL são os óleos de soja, girassol e milho, e do AAL são os óleos de linhaça, canola e peixes de origem marinha [3]. Os ácidos graxos poli-insaturados, incluindo os ácidos graxos essenciais, têm uma estrutura em que as duplas ligações estão separadas por carbonos metilenos (-C=C-C-C=C-). Por outro lado, os ácidos graxos conjugados, têm ligações duplas conjugadas (-C=C-C=C), com vários isômeros posicionais e geométricos. Os representantes dos ácidos graxos conjugados são o CLA (Ácido Linoléico Conjugado Conjugated Linoleic Acid) e o CLNA (Ácido alfa-linolênico conjugado Conjugated Linolenic Acid), que apresentam a mesma fórmula molecular dos ácidos linoléico e alfa-linolênico, respectivamente, mas com diferença quanto à configuração das duplas ligações, que podem ser cis ou trans e a sua posição [4]. Os isômeros conjugados do AL e AAL vêm despertando um grande interesse devido aos seus efeitos fisiológicos sobre diversas doenças, como câncer, diabetes, obesidade e alergias. Os isômeros conjugados do ácido linoléico são encontrados naturalmente em alimentos derivados de animais ruminantes, como carnes e produtos lácteos. Os isômeros conjugados do ácido alfa linolênico são encontrados exclusivamente em óleos de sementes de alguns tipos de plantas, dentre essas destacam-se a romã (Punicica Granatum) e tungue (Aleurites), onde são encontrados os isômeros 9cis,11trans, 13trans-18:3 e 9cis,11trans,13cis- 18:3, respectivamente. Essas espécies possuem uma enzima específica, a conjugase, que converte o AAL em CLNA [4]. Cada isômero de ácido graxo pode ter funções fisiológicas diferenciadas, por exemplo, o isômero 10-trans,12-cis-18:2, possui propriedades anti-carcinogênicas, anti-obesidade e efeitos de prevenção a diabetes [4]. O isômero 18:2 cis-9, trans-11 18:2 tem sido identificado como um potente anti-carcinogênico natural [5]. Um estudo realizado com ratos que tiveram câncer no cólon, induzido quimicamente pela injeção de azometano [6], mostrou que a administração do isômero 9cis,11trans,13cis- 18:3, inibiu significativamente o desenvolvimento de adenocarcinomas, sem causar efeitos adversos. A comparação entre a ingestão de CLA e CLNA indicou que o efeito de inibição do câncer foi relativamente maior para a ingestão de CLNA. Em estudos in vitro efetuando com células contendo monócitos leucêmicos e células tumorais provenientes de humanos, verificou-se que os efeitos anti-carcinogênicos do CLNA foram mais pronunciados que os observados para o CLA [7]. O CLNA também apresenta efeitos biológicos relacionados com a diminuição da obesidade. Em um estudo realizado com ratos, por KOBA et al (2002) [4], em que 0,5% da energia da dieta foi fornecida sob a forma de CLNA, houve a diminuição da gordura corporal, em relação a dieta correspondente ao CLA (0,7% da energia) [8]. Os ácidos linoléico conjugado (CLA) e alfa-linolênico conjugado (CLNA) são produzidos a partir de óleos com teores elevados de AL (ácido linoléico) e AAL (alfalinolênico), por meio de reações de isomerização em meio alcalino [9]. Com base nos efeitos fisiológicos provocados pelos isômeros conjugados do ácido alfa-linolênico, e considerando

3 que existem poucos estudos sobre a produção do ácido alfa-linolênico conjugado, este trabalho teve como objetivo desenvolver e testar um sistema para a produção do CLNA por meio da isomerização alcalina do óleo de linhaça. METODOLOGIA Materiais e reagentes. O óleo de linhaça foi obtido de um industria de refino de óleos vegetais (Panambi, RS). Os reagentes utilizados nos experimentos foram de grau analítico para o desenvolvimento do sistema empregado na isomerização utilizou-se um bloco digestor com controle de temperatura microprocessado, tubo de vidro e gás nitrogênio industrial. Transesterificação de ácidos graxos do óleo de linhaça. Os triacilgliceróis do óleo de linhaça foram convertidos em ésteres metílicos de ácidos graxos (EMAG) conforme metodologia da ISO (1998) [10]. Módulo e isomerização. Os testes iniciais para a produção de ácidos graxos conjugados do óleo de linhaça foram realizados em um bloco digestor, onde foram adicionados ao recipiente contido no equipamento, 15 gramas de óleo de linhaça, e 50 ml de KOH em etileno-glicol 0,2 mol/l. A mistura foi aquecida a aproximadamente 180 ºC, e a temperatura foi verificada por meio de um controlador de temperatura micro-processado. A mistura foi mantida sobre fluxo de nitrogênio 10 ml/min, por 1,5 h. Não foi possível a utilização de um agitador mecânico nesses ensaios preliminares, devido à limitação do equipamento empregado. Entretanto, os testes não foram satisfatórios, sendo observado que não ocorreu a reação de isomerização, e em alguns casos foi observado a degradação da amostra. Os ensaios seguintes foram submetidos à agitação mecânica (Figura 2). Nesses ensaios ocorreu a substituição do óleo de linhaça por éster metílico deste óleo (15 g), visando favorecer a reação de isomerização. Agitador Mecânico Sensor de temperatura Saída de gás (N 2 ) N 2 Figura 1 - Módulo reacional de isomerização Após a reação de isomerização foram adicionados para cada 13 ml da mistura obtida, 5 ml de HCl 37%, para a formação de ácidos graxos livres. A mistura foi levada ao funil de separação onde foram adicionados 76 ml de n-hexano. Após a separação das fases a inferior foi descartada e a superior levada ao evaporador rotativo para remoção do solvente, sendo armazenada a 5ºC, para posterior utilização [9].

4 Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos. A preparação de EMAG a partir dos ácidos graxos livres após a etapa de isomerização foi realizada conforme metodologia de HARTMAN & LAGO [11]. Espectroscopia no ultravioleta-visível. As análises espectroscópicas na região UV-VIS foram realizadas em um espectrofotômetro de varredura, modelo T80+, PG Instruments, na região de 190 a 600 nm. Cerca 50 µl de ésteres metílicos de ácidos graxos foram diluídos em 2,5 ml de n-heptano. Para as medidas foram utilizadas cubetas de quartzo, com caminho óptico de 1 cm. Os espectros foram obtidos para amostra não-isomerizada e isomerizada. Espectroscopia no infravermelho. Os espectros de transmitância na região do infravermelho foram registrados em um espectrofotômetro BOMEM, modelo MB-séries (Suíça), em cela de KBr, na região de 400 a 4000 cm -1. Aproximadamente 50 mg de ésteres metílicos foram espalhados na cela de modo a formar um filme líquido. Como referência foi utilizada a banda de transmitância em 1601 cm -1 de um filme de poliestireno. Análise cromatográfica e identificação dos ésteres metílicos. Os ésteres metílicos de ácidos graxos foram separados em um cromatógrafo a gás, modelo CP3380 (Varian, Estados Unidos), equipado com coluna capilar de sílica fundida CP Select CB FAME (100 m x 0,25 mm x 0,25 μm de cianopropilpolisiloxano) e detector de ionização em chama. A temperatura inicial da coluna foi de 185 o C por 5 min, sendo elevada a 225 o C à taxa de 15 o C min -1, permanecendo nesta temperatura por 15 min. As temperaturas do injetor e detector foram 240 C. O volume injetado foi de 2,0 μl. As velocidades de fluxo dos gases foram 1,4 ml min -1 para o gás de arraste (H 2 ); 30 ml min -1 para o gás auxiliar (nitrogênio); 30 e 300 ml min -1 para os gases da chama, hidrogênio e ar sintético, respectivamente. A razão de divisão da amostra foi 1/100. As áreas dos picos foram determinadas através do software Workstation versão 5.0 (Varian). Os ésteres metílicos de ácidos graxos foram identificados por comparação dos seus tempos de retenção com o de misturas padrão de ésteres metílicos obtidas da Sigma (EUA) e pela co-eluição de amostras com padrões. A quantificação foi realizada através do método da normalização. Determinação do grau de isomerização. O grau de isomerização (GI) foi obtido pelo quociente do teor de ácido graxo (AL ou AAL) isomerizado pelo teor inicial do ácido graxo no óleo de linhaça não isomerizado. RESULTADOS E DISCUSSÃO A comparação dos espectros obtidos na região UV-VIS, para os EMAG isomerizados e não-isomerizados, permitiu verificar que o espectro modificou após a isomerização (Figura 2). Houve o aumento da absorção na região de 252 a 294 nm, sendo observado um deslocamento do comprimento de onda máximo, em relação ao espectro dos EMAG não isomerizados, cuja absorção máxima ocorreu em 250 nm. Em 268 e 278 nm ocorrem às absorções características de trienos conjugados, conforme determinado por WILEY (2005). Dessa forma foi possível comprovar a formação de duplas ligações conjugadas na reação de isomerização [12].

5 Figura 2 Espectro UV-VIS dos EMAG óleo de linhaça isomerizado e não isomerizado Os espectros na região do infravermelho para os EMAG não isomerizados e isomerizados (Figura 3) apresentam uma banda intensa em 1743 cm -1, que ocorre devido ao estiramento C=O, da carbonila do éster metílico. A banda em 3030 cm -1 está relacionada ao estiramento CH=CH de duplas ligações cis. Ocorreu a diminuição na intensidade de absorção desta banda após a isomerização, indicando que a quantidade de duplas ligações com a configuração cis diminuiu [13]. Figura 3 Espectros no infravermelho do óleo não isomerizado (a) e isomerizado (b) O espectro dos EMAG não isomerizados apresenta uma banda em 1654 cm -1, de baixa intensidade, que corresponde ao estiramento C=C de ligações cis. Para as duplas ligações na configuração trans a absorção deste estiramento apresenta uma intensidade ainda menor devido a sua maior simetria em relação à configuração cis. A comparação com o espectro dos EMAG isomerizados permite verificar que ocorreu a diminuição pronunciada desta banda, indicando há uma quantidade menor de ligações cis na mistura após a isomerização [14]. Após a isomerização foi observado o surgimento de bandas em 948, 965 e 995 cm -1. A banda

6 em 965 cm -1 está baseada na deformação fora do plano de hidrogênios ligados a carbonos com duplas ligações na configuração trans. A absorção em 948 cm -1 está relacionada a deformação fora do plano de hidrogênios ligados a carbonos com duplas ligações trans, que estão conjugadas a duplas ligações cis. Em 995 cm -1, a banda está relacionada com a presença de duas duplas ligações trans que estão conjugadas. Ao determinar ácidos graxos conjugados octadienóicos em gorduras parcialmente hidrogenadas, proveniente de óleo de soja, Mossoba et al, (1991) [13], verificaram a ocorrência de bandas em 950 e 986 cm -1, referentes a isômeros cis, trans-18:2 conjugados e em 990 cm -1 a um isômero trans, trans- 18:2 conjugado. Em 722 cm -1 ocorre uma banda, cuja intensidade é maior no espectro dos EMAG não isomerizados. Esta absorção ocorre devido à deformação fora do plano da ligação C-H de duplas ligações cis e também à vibração dos CH 2 do EMAG [15]. A partir da análise por cromatografia gasosa dos EMAG do óleo de linhaça, foi determinada a sua composição (Tabela 1), sendo obtidos os teores de 49,9 e 15,9 %, para os ácidos alfa-linolênico e linoléico, respectivamente. Em outro estudo realizado pelo nosso grupo, com a linhaça dourada foi obtido o teor de 56% para o ácido alfa-linolênico [16]. Tabela 1- Composição de ácidos graxos do óleo de linhaça não-isomerizado (ONI) e Isomerizado (OI) Ácidos graxos ONI (%) OI (%) 16:0 6,2 ± 0,009 5,6 ± 0,005 18:0 5,0 ± 0,000 4,7 ± 0,002 18:1n-9 21,6 ± 0,013 20,0 ± 0,093 18:2n-6 15,9 ± 0,145 4,3 ± 0,002 18:3n-3 49,9 ± 0,166 4,5 ± 0,000 CLA1 ND* 4,6 ± 0,008 CLA2 ND 6,8 ± 0,001 CLNA1 ND 28,8 ± 0,576 CLNA2 ND 1,7 ± 0,012 CLNA3 ND 6,5 ± 1,153 CLNA4 ND 1,8 ± 0,006 ND* = Não detectado Após a reação de isomerização ocorreu a diminuição dos teores dos ácidos linoléico e alfa-linolênico, que passaram de 15,9 para 4,2% e 49,9 para 4,5%, respectivamente. Houve a formação de dois ácidos graxos conjugados 18:2 (CLA), cujos teores foram de 4,6% (CLA1; 9cis,11trans-18:2) e 6,8% (CLA2; 10trans, 12cis-18:2). A sua identificação foi baseada na comparação dos tempos de retenção de uma mistura padrão, contendo os isômeros 9cis,11trans-18:2 e 10trans,12cis-18:2. Os ácidos graxos CLA1 e CLA2 apresentaram o mesmo tempo de retenção que o observado para a mistura padrão de CLA, indicando que os isômeros obtidos possivelmente são os mesmos da mistura padrão de CLA. A partir do ácido alfa-linolênico ocorreu a formação de quatro isômeros (CLNA), cujos teores foram de 28,8 (CLNA1), 1,7 (CLNA2), 6,5 (CLNA3) e 1,8 (CLNA4). Foi realizada a tentativa de identificação desses isômeros por meio da comparação dos seus tempos de retenção com os de uma mistura de EMAG proveniente do óleo de tungue, de composição conhecida. Este óleo apresenta os ácidos graxos conjugados,9cis,11trans, 13trans 18:3 (70,1 %), 9trans,11trans,13trans 18:3 (6,2 %) e 9trans,11trans,13cis 18:3 (1,8 %). O isômero CLNA4 apresentou o mesmo tempo de retenção que o isômero 9cis,11trans,13cis-18:3 presente no óleo de tungue. Assim, possivelmente o isômero formado é o mesmo.

7 A isomerização do ácido alfa-linolênico ocorreu em maior proporção (91,0 %) que a do ácido linoléico (73,4%). Estes valores correspondem ao rendimento da isomerização e indicam que o valor obtido possibilita a obtenção de CLA e CLNA, em concentrações significativas. A retirada seletiva do hidrogênio de ácidos graxos insaturados é dependente do número de duplas ligações presentes na molécula. A energia de ligação do hidrogênio em um grupo metilênico duplamente alílico do ácido linoléico é 52 kcal/mol enquanto que para um hidrogênio alílico do ácido oléico é de 77 kcal/mol. O ácido alfa-linolênico possui dois grupos metilênicos duplamente alílicos, e consequentemente, a velocidade de perda de hidrogênio da sua molécula é duas vezes maior que no ácido linoléico [17]. Esta condição implica em uma taxa de isomerização maior que a do AL. CONCLUSÕES A isomerização do óleo de linhaça é uma alternativa adequada para a preparação de misturas de isômeros conjugados dos ácidos linoléico e alfa-linolênico, utilizando um sistema reacional e uma metodologia de isomerização, que são simples e de baixo custo. A caracterização da isomerização foi realizada pela espectroscopia UV-VIS, que mostrou a formação de duplas ligações conjugadas, e pela espectroscopia no infravermelho que apresentou bandas correspondentes à ligações duplas na configuração trans e ligações trans conjugadas à ligações cis e a ligações trans. O grau de isomerização do ácido alfa-linolênico foi de 91%, indicando que houve uma conversão elevada à CLNA. Ocorreu também a formação dos isômeros 9cis,11trans-18:2 e 10trans, 12cis-18:2. A obtenção de um elevado teor de CLNA é de grande importância, considerando a perspectiva futura de incorporação destes isômeros em alimentos. AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico - CNPq (Brasil). REFERÊNCIAS [1] MARTIN, C. A., ALMEIDA V. V., RUIZR., VISENTAINER, J. E. L.,MATSHUSHITA, M., SOUZA, N. E; VISENTAINER, J. V. (2006), Ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e ômega-6: importância e ocorrência em alimentos. Revista de nutrição, 6, [2] GU Hai-bo; MA xue-yi; WU Jing-bo; ZHANG Qi; YUAN Wen-bing ; CHEN Yi-ping, Concentration of α-linoleic Acid of Perilla Oil by Gradient Cooling Urea Inclusion. Agricultural Sciences in China, vol 8, No [3] CEOTTO, B. O que é que a linhaça tem. Dentro das sementes da planta que dá origem ao linho há componentes que equilibram os hormônios femininos e reforçam as defesas do corpo. Revista da Saúde. Campinas. v. 23, n. 3, p , [4] KOBA, Kazunori; BELURY, Martha A.; SUGANO, Michihiro. Potential health benefits of conjugated trienoic acids. Lipid Technology. Weinheim. v. 19, n. 9, p , [5] PARIZA, M. W; HA, Y. L. Conjugated dienoic derivatives of linoleic acid: a new class of anticarcinogens. Medical Oncology Tumor Pharmacology, v. 7, p [6] KOHNO, H; SUZUKI, R; YASUI, Y; HOSOKAWA, M; MIYASHITA, K; TANAKA, T. Pomegranate seed oil rich in conjugated linolenic acid suppresses chemically induced colon carcinogenesis in rats. Cancer Science, v. 95, p , 2004.

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