TÁCIA GOMES BERGSTEIN. RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR: Biotecnologia aplicada ao sêmen de ovinos e caprinos

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1 TÁCIA GOMES BERGSTEIN RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR: Biotecnologia aplicada ao sêmen de ovinos e caprinos CURITIBA 2010

2 TÁCIA GOMES BERGSTEIN RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR: Biotecnologia aplicada ao sêmen de ovinos e caprinos Trabalho para conclusão do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Paraná. Supervisor: Prof. Dr. Romildo Romualdo Weiss Orientador: Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo CURITIBA 2010

3 Ao meu pai, Eduardo Avelino Bergstein, que esperou a finalização desta etapa mais do que eu. Sei da sua angústia, esforço e perseverança, por isso, a você, Papai, dedico este trabalho. Finalmente chegamos aqui, esse diploma é nosso! Te amo!

4 AGRADECIMENTOS À minha mãe sem a qual nada disso seria possível. Seu apoio em todos os momentos me trouxe até aqui. Mamãe, sua habilidade de equilibrar as coisas/pessoas foi determinante, obrigada pelos cuidados, mimos e proteções. À minha irmã, que é meu exemplo de esforço e profissionalismo. Aos meus avós, tios, tias e primos pela preocupação e torcida. Ao meu namorado, Carlos, sua presença torna tudo mais agradável. Obrigada por ser além de namorado um amigo tão presente, seu companheirismo e carinho foram e são essenciais. Ao meu amigo Thiago por cuidar da responsabilidade que era minha durante a realização deste estágio. Saber que a fazenda estava em boas mãos fez toda a diferença. Obrigada pela amizade e sintonia, mais que isso, por começar comigo esta nova etapa. À Jana, amiga importantíssima, seus conselhos e conversas me acalmaram nos piores momentos e me motivaram nos melhores. Aos amigos que conheci na UFR que fizeram destes cinco anos mais do que enriquecimento profissional e tornaram este período muito divertido e inesquecível. Afinal nosso crescimento vem muito das pessoas com quem convivemos e eu aprendi demais com vocês. Vocês estarão sempre comigo. Um agradecimento especial à Dani Serighelli que me obrigou a estudar até dormir em cima dos livros, sem essa companheira não seriam menos de sete anos! Valeu Dane! Um obrigada especial ao Professor Romildo Romualdo Weiss que, além de mestre, foi e é um amigo. Obtive nas nossas conversas mais do que o conhecimento na Medicina Veterinária, a experiência de vida que ele tem a passar. Obrigada, Professor, pela atenção e preocupação com a minha formação. Ao Professor Sony Dimas Bicudo que me recebeu de braços abertos e me mostrou o mundo científico da Reprodução Animal. Obrigada pela oportunidade e preocupação durante a realização do estágio. A todos os professores e funcionários da UFPR que me conduziram até aqui, em especial para o Professor Ivan Deconto pelo carinho e atenção. Á Claudinha por ser um refúgio quando o foco era eu dentro do Laboratório e à Sabrina pela confiança no meu trabalho e amizade. Ao Marcel por abrir portas e facilitar minha vida em Botucatu.

5 Ao Dr. Leandro Rodello, que no período de estágio me mostrou a realidade da nossa profissão. Obrigada pelos muitos ensinamentos, pela paciência com essa aprendizagem e pela amizade. A todos que de forma direta ou indireta contribuíram com a realização desse relatório e fizeram parte da minha formação..

6 SUMÁRIO INTRODUÇÃO OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS DESCRIÇÃO DO ESTÁGIO LOCAL PERÍODO DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos Experimento com sêmen refrigerado Experimento com soluções clarificadoras para análise computadorizada de sêmen congelado Experimento com o meio para criopreservação de sêmen GGL Manipulação do meio GGL Setor de Reprodução Animal Visitas técnicas DISCUSSÃO ARTIGO CIENTÍFICO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADICIONAIS ANEXOS...47 v

7 LISTA DE ABREVIATURAS ALH - Amplitude de deslocamento lateral de cabeça BCF - Frequência de batimentos do flagelo CASA - Computer Assisted Sperm Analysis CEBAROC Centro de estudos em Biotecnologias aplicadas à Reprodução de Ovinos e Caprinos CERAN Centro de Diagnóstico e Biotecnologia em Reprodução Animal DIC - Diacetato de carboxifluoresceína FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia GGL Glicina gema e leite GL Gema e leite IP - Iodeto de propídio LIN - Linearidade LIN Linearidade ml mililitros MT Motilidade total OEP Lauril Sulfato de Sódio PBS - Phosphate Buffered Saline STR - Retilinearidade TK - TK Tecnologia em congelação Ltda, Uberaba, Minas Gerais UNESP Universidade Estadual de São Paulo VCL - Velocidade curvilinear VSL - Velocidade progressiva μm microlitros vi

8 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 FACHADA DO CENTRO DE ESTUDOS EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À REPRODUÇÃO DE OVINOS E CAPRINOS FIGURA 2 - CENTRO DE ESTUDOS EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À REPRODUÇÃO DE OVINOS E CAPRINOS FIGURA 3 - CENTRO DE ESTUDOS EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À REPRODUÇÃO DE OVINOS E CAPRINOS, BOTIJÕES DE ARMAZENAMENTO DE SÊMEN E EMBRIÕES FIGURA 4 APRISCO COM 8 BAIAS ANEXO AO CEBAROC FIGURA 5 - ÁREA DE MANEJO DO CEBAROC COM ALGUNS DOS ANIMAIS ALOJADOS FIGURA 6 MINIAUDITÓRIO PARA AULAS E MANEQUIM DE COLETA DE SÊMEN DE GRANDES ANIMAIS FIGURA 7 - DR. LEANDRO RODELLO REALIZANDO EXAME ULTRASSONOGRÁFICO TRANSABDOMINAL PARA DIAGNÓSTICO DE GESTAÇÃO FIGURA 8 - OVELHA COM EDEMA SUBMANDIBULAR, SINAL CLÍNICO CARACTERÍSTICO DE PARASITOSE POR HAEMONCHUS CONTORTUS FIGURA 9 GRÁFICO DAS PRINCIPAIS VELOCIDADES MENSURADAS PELO CASA vii

9 LISTA DE TABELAS TABELA 1 DIVISÃO DA CARGA HORÁRIA NO CEBAROC CONFORME AS PRINCIPAIS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS TABELA 2- PROCEDIMENTOS ACOMPANHADOS NO PERÍODO DE ESTÁGIO NO SETOR DE REPRODUÇÃO ANIMAL DA FMVZ viii

10 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 DISTRIBUIÇÃO DAS 400 HORAS TOTAIS DE ESTÁGIO NAS 3 ÁREAS ix

11 LISTA DE ANEXOS ANEXO I - MEIO DILUENTE GLICINA GEMA LEITE (GONZALEZ ET AL., 1996) PARA CONGELAÇÃO DO SÊMEN OVINO ANEXO 2 NORMAS PARA SUBMISSÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS DA REVISTA LIVERSTOCK SCIENSE x

12 RESUMO A ovinocaprinocultura é um setor da pecuária que tem chamado muito a atenção dos investidores. As biotecnologias aplicadas à reprodução têm uma grande participação no crescimento desse setor. Mais especificamente a manipulação de sêmen tem papel fundamental na difusão da genética melhoradora dos rebanhos. O principal objetivo deste estágio curricular foi aprimorar os conhecimentos científicos e práticos na área de reprodução animal, com ênfase na manipulação e congelação de sêmen ovino. O estágio totalizou 400 horas, sendo que as atividades foram divididas entre o Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos - onde foram acompanhados experimentos na área de reprodução ovina e caprina, além da manipulação do meio comercial GGL-, o setor de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista no campus de Botucatu onde houve o acompanhamento dos atendimentos clínicos na fisiopatologia da reprodução- e em visitas técnicas em propriedades rurais, com criação de ovinos e caprinos, com o acompanhamento do Dr. Leandro Rodello. Este relatório ainda inclui o artigo científico em que foram testadas quatro soluções de clarificação para análise em sistema computadorizado de sêmen ovino, no qual se comprovou que a solução X-cell era a mais indicada para clarificação do sêmen pré-análise. xi

13 12 INTRODUÇÃO A ovinocaprinocultura está em um momento de grande expansão tanto no consumo da carne, como no número de propriedades, animais e investidores. Nos últimos anos, verificou-se um crescimento intensificado, sobretudo nos países em desenvolvimento. Estima-se um crescimento anual de 2,1 % na produção de carne ovina durante o período de 2005 a 2014 (Viana, 2008). Neste contexto, a necessidade de desenvolvimento científico da área torna-se cada vez maior a fim de subsidiar o produtor rural com novas tecnologias aplicáveis a campo que tornem essa atividade mais produtiva e rentável. As biotecnologias aplicadas à reprodução animal são exemplos desse desenvolvimento científico. As técnicas de reprodução assistidas foram introduzidas na indústria caprina e ovina com os objetivos principais de acelerar o ganho genético de animais superiores e de superar alguns obstáculos de eficiência reprodutiva (Smith, 1986). O distanciamento entre propriedades rurais muitas vezes torna inviável a cópula. Com o uso da inseminação artificial e refrigeramento de sêmen essas barreiras são derrubadas e a troca de material genético torna-se viável. Por ser uma grande ferramenta para a disseminação de bons genes, a reprodução assistida de pequenos ruminantes causa tanto interesse. O estágio supervisionado foi realizado na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP no campus de Botucatu, São Paulo. O foco principal era o acompanhamento dos experimentos no Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos situado dentro do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ, mas também foram acompanhados alguns atendimentos clínicos e cirúrgicos no Setor de Reprodução Animal da Universidade, além de visitas às propriedades rurais com criação de ovinos e caprinos na região de Botucatu..

14 13 1 OBJETIVO GERAL O objetivo geral deste estágio supervisionado era aprimorar os conhecimentos na área de Reprodução animal além da conclusão do curso de Medicina Veterinária. 2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Os objetivos específicos do estágio supervisionado foram: a) Acompanhar a rotina do Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos; b) Acompanhar os experimentos desenvolvidos no Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos; c) Aprimorar os conhecimentos científicos e práticos na área de Reprodução Animal; d) Conhecer a estrutura e rotina do setor de Reprodução Animal da FMVZ, com foco principal na clínica e cirurgia de grandes animais; e) Desenvolver o experimento proposto pelo Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo; f) Desenvolver habilidade na avaliação subjetiva de sêmen com base na análise computadorizada, g) Identificar as doenças mais recorrentes nas criações de ovinos de caprinos. 3 DESCRIÇÃO DO ESTÁGIO 3.1 LOCAL O estágio foi realizado na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP no campus de Botucatu, São Paulo. A maior parte do estágio foi realizada no Centro de estudos em biotecnologia aplicada à reprodução de ovinos e caprinos, porém também houve atividades no Setor de Reprodução animal da Faculdade, além de acompanhamento do Dr. Leandro Rodello em atendimentos a propriedades rurais na região de Botucatu.

15 14 O Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos está situado dentro do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. É composto por um escritório, um laboratório para análise, processamento e congelamento de sêmen, uma sala para o espectrofotômetro de duplo feixe, um aprisco anexo com 8 baias, área de manejo dos animais e piquetes. Fonte: Arquivo Pessoal Figura 1 Fachada do Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos Fonte: Arquivo Pessoal Figura 2 - Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos

16 15 Fonte: Arquivo Pessoal Figura 3 - Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos, botijões de armazenamento de sêmen e embriões. Fonte: Arquivo Pessoal Figura 4 Aprisco com 8 baias anexo ao CEBAROC. São responsáveis pelo funcionamento do CEBAROC o Professor Titular da FMVZ Sony Dimas Bicudo e seus orientados: pós doutorando Leandro Rodello, doutoranda Cláudia Dias Monteiro e mestrandos Marcel Faleiros e Sabrina Sakashita. Neste Centro ficam alojados 3 reprodutores da raça Santa Inês, além de 7 ovelhas e 3 reprodutores sem raça definida. Esses animais esporadicamente são usados nos experimentos realizados no CEBAROC. No período de estágio estavam alojados temporariamente 48 borregos da raça Santa Inês, que eram usados em um

17 16 experimento do curso de Biologia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho e dois bodes Boer pertencentes ao experimento desenvolvido no CEBAROC. Fonte: Arquivo Pessoal Figura 5 - Área de manejo do CEBAROC com alguns dos animais alojados. Os setores de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária fazem parte do mesmo Departamento, mas são fisicamente separados. O estágio foi realizado somente no setor de reprodução animal. Este é constituído pelo Bloco Principal, Área anexa, CERAN, Área externa e pelo CEBAROC. O bloco principal possui sala dos professores, ambulatório de atendimento a pequenos animais, sala de esterilização, cozinha, sala de armazenamento de botijões com sêmen e embriões, Laboratório de Biotecnologias Aplicadas a Reprodução de Pequenos animais, sala de citologia, sala dos residentes e secretaria. A área anexa possui um miniauditório utilizado em aulas demonstrativas, área de manejo com 3 (três) troncos de contenção e um manequim para coleta de sêmen de grandes animais. Nesta área ainda está presente o anfiteatro, o Laboratório de Fertilização in Vitro e o Laboratório de Endocrinologia.

18 17 Fonte: Arquivo Pessoal Figura 6 Miniauditório para aulas e manequim de coleta de sêmen de grandes animais. O Centro de Diagnóstico e Biotecnologia em Reprodução Animal (CERAN) é constituído de sala de fluorescência, sala de aula e duas salas para andrologia. A área externa possui 15 baias para equinos e muares, 5 piquetes e uma área de manejo para bovinos com tronco de contenção e dois embarcadouros. O setor de Reprodução Animal do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ possui 7 professores adjuntos, 3 professores titulares, 3 professores assistentes e 9 funcionários. Os atendimentos clínicos são realizados por 4 residentes. Também foram acompanhadas visitas técnicas com o Dr. Leandro Rodello em 6 propriedades rurais com criação de ovinos e caprinos na região de Botucatu, Itapetininga e Itu. 3.2 PERÍODO O estágio teve início no dia 5 de julho de 2010 e terminou em 15 de setembro de A frequência era diária, das 8h às 18h, com duas horas de intervalo. Nos finais de semana havia plantão de atendimento na Clínica, além de pequenos procedimentos nos pacientes internados e fornecimento de alimentação para os animais residentes no CEBAROC. O período de atividades totalizou 320 horas regulares e 80 horas de plantão.

19 DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES As atividades realizadas no CEBAROC foram o acompanhamento da rotina do laboratório e no desenvolvimento dos experimentos. Além disso, o Prof Dr. Sony Dimas Bicudo propôs o desenvolvimento de um experimento com clarificadores de sêmen. No Setor de Reprodução Animal foi possível acompanhar a rotina de casos clínicos que eram atendidos pelos residentes, principalmente na parte de grandes animais. Nas visitas às propriedades, a principal atividade foi o diagnóstico de gestação por ultrassonografia e atendimentos clínicos. Gráfico 1 Distribuição das 400 horas totais de estágio nas 3 áreas Centro de Estudos em Biotecnologia Aplicada à Reprodução de Ovinos e Caprinos O CEBAROC foi fundado há 10 anos e é uma referência em pesquisa na área de biotecnologias na reprodução de pequenos ruminantes. As principais linhas de pesquisa são com sêmen congelado de ovinos, no desenvolvimento de meio para criopreservação e adição de antioxidantes ao meio a fim de diminuir crioinjúrias nas células espermáticas. Além desse foco principal também são realizados experimentos na área de precocidade sexual em borregas e uso de sêmen refrigerado para inseminação artificial em cabras. O CEBAROC produz meio para congelamento de sêmen ovino e caprino. Este meio chamado de GGL (Glicina-gema e leite) foi desenvolvido com base nos

20 19 experimentos já realizados e é produzido no próprio laboratório para ser comercializado. Outros serviços como análise de sêmen fresco e congelado, inseminação artificial e transferência de embriões na espécie ovina e caprina também são disponibilizados pelo Centro. No período de estágio havia três experimentos em andamento. Um sobre sêmen caprino refrigerado, outro sobre soluções clarificadoras na análise de sêmen congelado e um outro com o meio GGL. Na tabela 1 estão divididas as principais atividades realizadas no CEBAROC com a quantidade de horas e frequência relativa por atividade. Tipo Quantidade Horas % horas Coleta de sêmen 20 * 2 1,0 Descongelamento de sêmen 105 ** 2 1,0 Congelamento de sêmen 38 ** 4 1,9 Análise Computadorizada 405 *** 53 25,5 Fluorescência Espermática 405 *** ,0 Manipulação de meio ,4 Outras atividades ,2 Total Tabela 1 Divisão da carga horária no CEBAROC conforme as principais atividades desenvolvidas. * unidade em ejaculados ** unidade em doses *** unidade em amostras Experimento com sêmen refrigerado O objetivo desse experimento era testar a viabilidade do meio 1 de GGL 20% como diluente para sêmen a fresco e posterior inseminação artificial em cabras. O sêmen foi coletado de um bode da raça Boer por meio de vagina artificial. O ejaculado foi mantido em banho-maria a 32ºC enquanto foram realizadas as avaliações de concentração e cinética. A concentração foi feita com a diluição de 1:400 e as células foram contadas em câmara de Neubauer. A avaliação da motilidade total e progressiva foi mensurada com auxílio de análise computadorizada do equipamento Hamilton Thorn Motility Analyser modelo IVOS 12.

21 20 Se a qualidade do sêmen estivesse dentro dos padrões normais, uma amostra era aliquotada em 3 diluentes a saber: meio com gema e leite(gl), meio 1 de glicina, gema e leite com 20% de gema de ovo e meio 1 de glicina, gema e leite com 20% de gema de ovo mais antioxidantes. Essas amostras foram dispostas em dois Equitainers por 24 e 48h. O Equitainer é um dispositivo da empresa Hamilton Research, Inc. que tem por objetivo formar uma curva de decréscimo de temperatura de 0,5ºC por minuto e mantém a temperatura final em 5ºC. É usado para transporte e manutenção de sêmen refrigerado. A capacidade de fecundação do sêmen fica preservada dentro do Equitainer por aproximadamente 5 dias. Após 24 horas, o primeiro Equitainer foi aberto e o sêmen armazenado dentro deste passou por um teste de exaustão sendo mantido à 40ºC e feitas análises de Motilidade, Integridade de membrana e patologia espermática nos tempos: 0, 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos e 240 minutos. Decorridas mais 24 horas o segundo Equitainer foi aberto e foram feitas as mesmas análises nos mesmos tempos já citados. O experimento não havia sido finalizado ao final do período de estágio, mas na fase 1 (um), na qual foi utilizado um bode Boer, as amostras mantidas em GL e GGL com antioxidante pareciam apresentar melhores resultados na análise computadorizada Experimento com soluções clarificadoras para análise computadorizada de sêmen congelado Este experimento tinha como hipótese que o meio diluente Xcell usado no CEBAROC como clarificador para análise no Hamilton, causava hiperativação em algumas células espermáticas. Foram descongeladas 25 doses de sêmen congelado de ovinos da raça Dorper e White dorper e cada uma das doses foi diluída em 4 soluções clarificadoras. São elas: Meio 1 do diluente composto por Glicina-gema e leite com 5% de gema de ovo; citrato de sódio a 2,94%; Phosphate Buffered Saline (Dulbecco Modificado DMPBS Flush - Nutricell) e X-cell. Decorridos 5 minutos da clarificação, as amostras foram analisadas no Hamilton e foram gravados os parâmetros de cinética individual dos

22 21 espermatozóides avaliados. Em seguida foram aliquotadas amostras para avaliação da integridade de membrana das células por meio de sondas fluorescentes. Os espermatozóides foram classificados como hiperativados ou não pelos parâmetros de hiperativação de Mortimer & Maxwell (1999) que levam em consideração padrões de cinética como velocidade curvilinear (VCL), velocidade progressiva (VSL), linearidade (LIN) e amplitude de deslocamento lateral de cabeça (ALH). Foi feita a porcentagem de células hiperativadas por amostra e por solução de clarificação usando a fórmula: % hiperativados = número de células hiperativadas número total de células analisadas. Após feitas as análises estatísticas dos dados, ficou provado que o Xcell não hiperativava as células espermáticas mas consagrava-se a melhor solução de clarificação por não imobilizar os espermatozóides como ocorria com as outras soluções citadas. Além disso, o X-cell apresentou menor porcentagem de células com membrana plasmática lesada Experimento com o meio para criopreservação de sêmen GGL Seguindo a linha de diminuição de radicais livres no sêmen congelado, a proposta deste experimento foi usar um extrato de gema de ovo para manipulação do meio GGL a fim de minimizar a produção desses radicais. O extrato da gema de ovo era obtido por consecutivas centrifugações e diálises de um pool de gemas. Depois de obtido o extrato, o meio GGL foi manipulado substituindo a gema de ovo in natura pelo extrato. Foi coletado sêmen de carneiro Santa Inês que foi congelado em geladeira TK e vapor de nitrogênio usando o meio GGL com extrato. Depois de 24 horas congeladas, as doses foram descongeladas e analisadas em sistema computadorizado. Não havia dados suficientes para nenhuma conclusão deste experimento até a data de término do estágio.

23 Manipulação do meio GGL O CEBAROC produzia duas variantes do meio GGL para comercialização sendo um com 20% de gema de ovo, mais apropriado para diluição de sêmen refrigerado e outro com 5% de gema de ovo, mais usado para congelamento de sêmen ovino. Para a produção do meio era necessária a pesagem criteriosa dos ingredientes (Anexo 1), em seguida eram feitos os procedimentos de manipulação do meio com a mistura dos compostos. Por fim a qualidade foi avaliada com base no ph e osmolaridade do produto final Setor de Reprodução Animal O Setor de Reprodução Animal da FMVZ realiza procedimentos clínicos e cirúrgicos em pacientes com enfermidades reprodutivas. Todos os pacientes que chegam ao Hospital veterinário da FMVZ passam por uma triagem e são encaminhados aos setores conforme a queixa principal e os sinais clínicos. No Setor de Reprodução Animal os pacientes eram recebidos pelos residentes, que faziam o diagnóstico, os primeiros procedimentos e as cirurgias. Os 4 residentes seguiam um esquema de rodízio semanal na clínica e cirurgia de pequenos animais, clínica e cirurgia de grandes animais, laboratórios e auxílio nas aulas. A maior casuística do Setor de Reprodução Animal é de cães e gatos, os procedimentos mais realizados nestes são castrações e cesarianas. Na parte de grandes animais a maioria dos pacientes era da espécie equina e os procedimentos e enfermidades são muito variáveis. Como o foco principal do estágio era a permanência no CEBAROC, poucos casos foram acompanhados no Setor de Reprodução Animal. A tabela 2 descreve os procedimentos acompanhados no período de estágio. Procedimento Espécie Quantidade Avaliação Andrológica Equina 2 Correção de acrobustite Bovina 1 Remoção de carcinoma testicular Asinina 1 Correção de prolapso de bexiga Canina 1

24 23 Caprina 1 Cesariana Ovina 1 Canina 1 Episiotomia Ovina 1 Vaginoplastia Equina 1 Tabela 2- Procedimentos acompanhados no período de estágio no Setor de Reprodução Animal da FMVZ Visitas técnicas Foram acompanhadas sete visitas a seis propriedades rurais com o Dr. Leandro Rodello. As propriedades eram de criação de ovinos e caprinos, sendo quatro delas de animais elite das raças Dorper, White Dorper e Santa Inês e duas de animais comerciais. O motivo principal das visitas normalmente era o diagnóstico de gestação por ultrassonografia, outros procedimentos também foram realizados como intervenções em casos de distocia e tratamentos para verminose. Fonte: Arquivo Pessoal Figura 7 - Dr. Leandro Rodello realizando exame ultrassonográfico transabdominal para diagnóstico de gestação.

25 24 Fonte: Arquivo Pessoal Figura 8 - Ovelha com edema submandibular, sinal clínico característico de parasitose por Haemonchus contortus. 4 DISCUSSÃO As biotecnologias aplicadas ao sêmen de ovinos e caprinos vem trazendo grandes vantagens para o produtor rural. Pesquisas na área de refrigeramento e congelamento são bem vindas, pois potencializam o uso desse produto em todo o mundo, podendo disseminar a genética em situações em que a cobertura natural seria impossível. O mais comum é ser feita a análise subjetiva do sêmen em microscópio óptico, porém recentemente a análise computadorizada do sêmen tem permitido uma avaliação mais precisa e objetiva da motilidade espermática (Robayo et al, 2008). Segundo Verstegen et al (2002) existe uma variação de 30 a 60% entre as análises subjetivas feitas na mesma amostra de sêmen. O CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) é um sistema computadorizado e automático de captura e análise de sucessivas fotos dos espermatozóides, que quando unidas formam um filme com o trajeto de cada célula. Por esse sistema é possível obter informações mais precisas e acuradas do movimento de cada célula espermática (Amann e Kartz, 2004). As imagens são capturadas por um sistema estroboscópico acoplado a um computador que digitaliza as imagens, e um software que as junta formando o vídeo. O trajeto é obtido através de marcações de pontos onde a cabeça do espermatozóide está em cada foto. Embora seja o flagelo a parte do espermatozóide que propulsiona o movimento, os sistemas automáticos avaliam o movimento da

26 25 cabeça, porque é tecnicamente mais fácil acompanhar esse movimento do que o do flagelo (Amann e Katz, 2004). Para cada espécie animal, o computador é programado com uma micrometragem mínima e máxima. Objetos que tiverem tamanhos dentro desta faixa são considerados espermatozóides. Partículas presentes na imagem com tamanho abaixo do mínimo são consideradas parte do fundo (Mortimer, 2000). Depois de identificado o espermatozóide, o software une as imagens traçando assim a trajetória de cada célula. As células espermáticas são classificadas quanto ao seu movimento em padrões definidos: móvel não progressivo, linear lento, linear rápido e imóvel (Mortimer, 2000). Para determinar esses padrões são mensuradas várias velocidades: VAP - Velocidade de trajeto (μm/s) - Velocidade curvilínea sobre um trajeto uniforme desprezando-se o deslocamento lateral da célula espermática. É a velocidade da trajetória média do espermatozóide. VSL - Velocidade progressiva (μm/s) - É a distância considerando-se uma linha reta entre o ponto inicial e o final da trajetória dividida pelo tempo decorrido. VCL - Velocidade curvilinear (μm/s) - É a distância total entre cada posição do centro da célula durante a captura da imagem. É a velocidade da trajetória real do espermatozóide. ALH - Amplitude de deslocamento lateral de cabeça (μm) - Corresponde à largura média da oscilação da cabeça do espermatozóide durante seu deslocamento. A mensuração desse parâmetro esta relacionada com a capacidade de penetração na zona pelúcida do óvulo, assim, a ALH é um dos parâmetros que tem efeito sobre a fertilização. BCF - Freqüência de batimentos do flagelo (Hz) - Determinada pela medida da frequência com que a linha da cabeça espermática atravessa a trajetória celular em qualquer direção. STR - Retilinearidade (%) - É a medida do afastamento médio da trajetória da célula espermática considerando-se uma linha reta. Calculado pela relação entre (VSL/VAP) x 100. Estima a proximidade do percurso da célula a uma linha reta.

27 26 LIN - Linearidade (%) - É a medida do afastamento da célula espermática considerando-se a trajetória em uma linha reta. É a razão entre (VSL/VCL) x 100. Figura 9 Gráfico das principais velocidades mensuradas pelo CASA. A análise computadorizada de sêmen tem-se mostrado uma boa ferramenta na pesquisa de novos diluidores e crioprotetores seminais, na quantificação de hiperativação e outros tipos de processamento (Amann e Katz, 2004). No estágio supervisionado essas também eram as principais funções em que o aparelho foi usado, além das análises de sêmen fresco e congelado na rotina do CEBAROC. No período de estágio foi possível a utilização desta nova tecnologia em análise de sêmen. As principais vantagens da técnica são a agilidade em que é feita a análise, possibilitando também avaliar, além dos parâmetros tradicionais, os valores de cinética e o desempenho individual das células. Porém, as desvantagens do equipamento também devem ser levadas em consideração. O alto custo de investimento na compra muitas vezes inviabiliza o uso em larga escala, ficando restrito a centros de pesquisa e centrais de processamento de sêmen com grande volume de análises. Outro teste realizado muitas vezes no período de estágio supervisionado foi a avaliação da integridade da membrana espermática por meio de sondas fluorescentes. A integridade da membrana espermática é essencial na viabilidade seminal, pois quando existem lesões nas membranas o gradiente iônico dentro da

28 27 célula é alterado e este não mantém as suas características de motilidade e capacidade de fecundação. Vários são os métodos para se avaliar a integridade do espermatozóide, porém essa avaliação fica comprometida quando o sêmen está suspenso em meio opaco, o que não ocorre com as sondas fluorescentes, sendo assim a técnica mais vantajosa (Garner et al, 1986). No CEBAROC o método de eleição para esta análise era o uso combinado de duas sondas fluorescentes, diacetato de carboxifluoresceína (DIC) e iodeto de propídio (IP), e contagem de 100 células em aumento de 400x em microscópio de epifluorescência com filtro de excitação nm, espelho dicromático 510nm e filtro de supressão 515nm. Uma amostra do sêmen a ser analisado é aliquotado em solução de formol mais a combinação de diacetato de carboxifluoresceína (DIC) e iodeto de propídio (IP). A solução de formol tem por função imobilizar os espermatozóides para que haja a coloração com as sondas (Harrison & Vickers, 1990). O DIC é permeável à membrana espermática e não é fluorescente. As moléculas do DIC, quando dentro do citoplasma, sofrem hidroxilação ligando-se em estruturas celulares e tomam uma fluorescência verde. O IP é uma sonda específica de ácidos nucléicos e é impermeável à membrana. Quando esta está lesada, é possível a entrada do IP na célula que se liga ao núcleo e fluoresce em vermelho. Então, espermatozóides fluorescentes em verde são considerados íntegros e os fluorescentes em vermelho são classificados como lesados (Garner et al, 1986). Nas 405 amostras analisadas durante o período, houve uma discordância significativa entre as análises de motilidade e integridade de membrana. Partindo do pressuposto que espermatozóides lesados não mantêm um bom padrão de motilidade. Essa discordância pode ter ocorrido por erros na manipulação da solução de DIC + IP, pelas amostras de sêmen congelado estarem abaixo do padrão de qualidade normal ou por erros de contagem no microscópio de epifluorescência. De modo geral o estágio superou as expectativas quanto aos objetivos iniciais. A experiência em um centro de referência em reprodução, mais especificamente na área de pequenos ruminantes, foi esclarecedora, possibilitando a atualização nas áreas de pesquisa mais recentes, além da oportunidade de acompanhar a análise de variadas amostras de sêmen tornando mais acurada a avaliação subjetiva. A vivência no Setor de Reprodução Animal também fez com que se ampliasse o conhecimento na área de clínica e cirurgia da reprodução nas