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2 CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN E INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM EQUINOS Prof. José Antonio Ribas 2

3 INTRODUÇÃO Viabilidade da criação de cavalos = sucesso na reprodução Industria do cavalo - movimenta cerca de R$ 7,5 bilhões anuais 3,2 milhões de empregos diretos e indiretos Investimento no melhoramento genético 3

4 INTRODUÇÃO 1947 Barker e Gardier nascimento 1º potro de IA com sêmen congelado eqüino Inseminação com sêmen congelado: liberação pelas associações Não existe um protocolo ideal para a criopreservação de sêmen equino Pesquisas relacionadas ao congelamento e a inseminação artificial 4

5 Criopreservação de sêmen Coleta e avaliação do sêmen 1. Volume do ejaculado 2. Motilidade 3. Vigor (0.5) 4. Concentração x 10 6 sptz/ml 5

6 Criopreservação de sêmen 6

7 7

8 Criopreservação de sêmen Patologia espermática 8

9 EJACULAÇÃO E O SÊMEN Avaliação Macroscópica Microscópica O sêmen Mot. Prog >70% CBRA/MA Vigor > 3 Defeitos Totais < 40% Maior < 20% 9

10 Criopreservação de sêmen Sêmen refrigerado Sêmen mantém a viabilidade tempo Porque é desejável refrigerar o sêmen o metabolismo do sptz a temperatura corporal e ambiente é máximo. produtos do catabolismo do sptz (ác. lático e/ou CO2) a acidez do meio danos as células espermáticas. peroxidação das membranas lipídicas danos as células espermáticas. Limitações Choque térmico: alterações no espermatozóides quando eles são rapidamente resfriados da temperatura corporal até próximo a 0 C Choque osmótico 10

11 Sêmen refrigerado SPTZ para cada 15 C de redução o metabolismo é reduzido em 45%. SPTZ armazenados a 5 C requerimentos metabólicos serão apenas de 10% Faixa crítica = 19 a 8 C SPTZ são insensíveis a velocidade de resfriamento até atingir 19 C A partir de 19ºC veloc. 0,05 C/min. 11

12 Sêmen refrigerado Diluição 1:1 Utilização h Efeitos do choque térmico podem ser minimizados pela adição de lipídios (gema de ovo), lipoproteínas (leite) velocidade de refrigeração lenta Diluidor mais utilizado: diluidor de Kenney (1975) Glicose - 49g Leite desnatado - 24g Bicarbonato de sódio a 10% - 7,5ml Gentamicina - 200mg Água bidestilada ml Doses inseminates: 10 9, 10 a 30 ml 12

13 Sêmen refrigerado Refrigeração computadorizada Unidades de refrigeração e conservação (contêiner): Equitainer I, II e III ExpectaFoal Equine Express Salsbro Box (contêiner sueco) Celle container (container alemão) Botutainer, Botubox (containers brasileiros) 13

14 Sêmen Congelado Grande vantagem de conservação de sêmen por tempo indeterminado Forma de seguro reprodutivo do animal Causa graves lesões ao espermatozóide Apenas 24% dos garanhões apresentam boas taxas de concepção Não existe um protocolo ideal 14

15 SÊMEN Fluxograma do método utilizado na coleta, diluição, congelamento e revitalização das amostras de sêmen. CENTRIFUGAÇÃO CÂMARA NEUBAUER CONCENTRAÇÃO < 300 Msptz/ml COLETA (VAGINA ARTIFICIAL) FILTRAÇÃO ANÁLISE CONCENTRAÇÃO > 300 Msptz/ml EXAME AO MICROSCÓPIO ÓPTICO 100 Msptz/ml DILUIÇÃO N 2 LÍQ. SOBRENADANTE DESCARTE PRECIPITADO RESSUSPENSÃO ESTOCAGEM REVITALIZAÇÃO 37 ºC/30 seg. EXAME AO 15 MICROSCÓPIO ÓPTICO

16 Sêmen Congelado Centrifugação Pickett et al. (1975) concluíram que as centrifugações entre 370 e 829x g não produziram efeito deletério no sêmen Jasko (1994); Heitland et al. (1996) a 550 x g Períodos de centrifugação acima de 12 minutos - alta taxa de recuperação espermática mas predispõem as células a injúrias Recomendável: 600x g por dez minutos recuperação espermática de 87% sem alterações significativas nos parâmetros espermáticos (Dell Aqua Jr., 2000) 16

17 Sêmen Congelado Diluidores Tampão, antibióticos, gema ou leite, açucares e crioprotetor Avanços na composição dos diluidores Açucares: lactose, rafinose e trealose AA: glicina Lipoproteínas de baixa densidade da gema, lecitina de soja 17

18 Crioprotetores Glicerol Dimetilformamida Metilformamida Dimetilacetamida Sêmen Congelado Menor viscosidade associada ao seu menor peso molecular Melhor permeabilidade destes crioprotetores através da membrana plasmática, induzindo conseqüentemente um menor dano osmótico Resultados Melhorou de 27% para 50% a motilidade do sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador e de 18% para 36% da Pantaneira, 30% para 40% da raça Árabe e Quarto de milha 18

19 Proteínas do plasma seminal Sêmen Congelado Efeitos deletérios ao sêmen x benéficos 10 KDa concentradas 10x Acrescentar 10% Melhora de até 50% Plasma heterólogo Melhorou de 26% para 40% a congelabilidade com plasma concentrado e dimetilformamida em cavalos Pantaneiros 19

20 Sêmen Congelado Onde congelar Pallhetas de 0,5 ml Palhetas de 0,25 ml Macrotubos 20

21 Efeito de solução x Formação de gdes cristais de gelo Efeito de solução Grande desidratação sptz Exposição a condições osmóticas extremas Lesão pela formação dos cristais Menor desidratação sptz Predisposição a formação de cristais de gelo intracelulares 21

22 Sêmen Congelado Máquinas para congelamento- TK TK Máquina Sousa (Patente) - tecnologia em congelação 22

23 Curvas de congelamento e descongelamento compatíveis Congelamento -196ºC Descongelamento 37ºC muito rápido descongelamento ótimo muito lento adaptado de Amann and Pickett,

24 Sêmen Congelado Descongelamento Rápido x lento? 37º C / 30 seg. 46ºC / 20 seg. 75 C / 7 seg. 98ºC/ 4 seg. 24

25 Controlador Eletrônicodo TIMER Termômetro Digital Controlador Eletrônicodo Nívelador Transformador Sêmen Congelado Equipamentos de descongelamento Controlador de Temperatura 25

26 Inseminação Artificial Entende-se por inseminação artificial o depósito mecânico de sêmen no aparelho reprodutivo da fêmea Vantagens da utilização de um programa de I.A. na espécie eqüina. Melhor aproveitamento do Garanhão Evita doenças transmissíveis através da cobertura Evita ferimentos durante a cobertura do garanhão e da égua 26

27 Inseminação Artificial Identificação do cio 27

28 Inseminação Artificial Preparo para I.A. 24 hs antes da ovulação Folículo pré-ovulatório (35 mm ou maior) Uso de 2500 a 3300 UI de hcg Ovulação em h 28

29 Inseminação Artificial Inseminação imediatamente antes ou após a ovulação Sobrevida em horas Sêmen cong./descong.: 12 h Ov! ========= % gest. ===== Sêmen I.A. fresco ou Monta natural 48 h { 8 } Ov! ==================== % gestação ===== 29

30 Inseminação Artificial Anatomia dos órgãos genitais da égua 30

31 Inseminação Artificial Inseminação clássica 31

32 Inseminação Artificial 350 a 1000 X10 6 sptz/ml (600) Dose inseminante 250 a 400 X10 6 sptz/ml (mot) CBRA / MA 200X10 6 sptz/dose (mot) Doses reduzidas CBRA / MA 200X10 6 sptz/dose (mot) 32

33 Inseminação Artificial Motivos da diminuição da fertilidade sptz demoram em atingir o oviduto diminui sua capacidade de se aderirem com as células epiteliais do oviduto (Bader, 1982) alterações membrana capacitação Sobrevida 33

34 Inseminação Artificial Inseminação histeroscópica o sêmen depositado próximo ao oviduto, sobre a junção úterotubárica (papila), através de um aparelho de endoscopia via lumen uterino 34

35 Inseminação Artificial Fibroendoscópio Redução da quantidade de espermatozóides: 5 a 40 x 10 6 Deposição ipsilateral da ovulação Sêmen sexado 35

36 Inseminação Artificial Inseminação no corno uterino através do desvio da pipeta IA no ápice do corno Utilizada para sêmen com baixa motilidade e concentração Incremento de até 60% nas taxas de prenhez Pouco inferior a histeroscópica Maior reação inflamatória 36

37 Inseminação Artificial Inseminação Intrafolicular/ Intratubária / Intraperitonial Experimentais Utilizadas em outras espécies Bons resultados 37

38 Inseminação Artificial 38

39 Considerações finais Importante para manter a lucratividade de um haras Novas biotécnicas da reprodução 39

40 Muito obrigado! 40

41

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