Criopreservação de sêmen. Dr: Ribrio Ivan T.P. Ba1sta

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1 Criopreservação de sêmen Dr: Ribrio Ivan T.P. Ba1sta

2 Sumário 1. Introdução 2. Criopreservação de sêmen 3. Efeito da criopreservação 1. No metabolismo dos espermatozoides 2. Na ultra- estrutura dos espermatozoides 4. Recentes avanços na criopreservação 5. Considerações finais

3 Introduction Oviduto Tubal epithelium 3

4 Introdução Animais de produção Caprino Ovino Bovino Suíno Inseminação artificial Inseminação artificial (IA) é a ferramenta mais amplamente aplicado na pecuária moderna facilitando a utilização de sêmen congelado de animais geneticamente superiores.

5 Introdução Alargar intervalo de tempo da viabilidade de espermatozoides (SPTZ) o Desaceleração da taxa metabólica do sptz: Produtos do catabolismo do sptz ü Ácido lático e CO 2 aumentam acidez do meio ü Peroxidação das membranas lipídicas ² Danos as células espermáticas

6 Introdução Duas estratégias podem ser utilizadas Inibidores de metabolismo Dióxido de carbono (CO 2 ) Inibidores de proteinase o Produzem efeito semelhante, mas menos bem sucedida Criopreservação de SPTZ Resfriamento de SPTZ a 5-8 C Congelação de SPTZ a 196 C

7 Sumário 1. Introdução 2. Criopreservação de sêmen 3. Efeito da criopreservação 1. No metabolismo dos espermatozoides 2. Na ultra- estrutura dos espermatozoides 4. Recentes avanços na criopreservação 5. Considerações finais

8 Criopreservação de sêmen Resfriamento de SPTZ a 5-8 C Aumenta a sobrevivência de sptz por h Reduz a taxa metabólica dos sptz e prolonga a sobrevivência SPTZ para cada 15 C de redução de temperatura Metabolismo é reduzido em 45% SPTZ armazenados a 5 C Taxa metabólica é apenas de 10% Sem diminuição significativa Taxa motilidade Taxa de fertilização

9 Criopreservação de sêmen Congelação de SPTZ 196 C Preservação de sptz por tempo indeterminado Parada total no metabolismo do sptz Benefícios resultantes do processo de criopreservação: Melhoramento genético de animais de produção Controle de doenças Otimização da criação e exploração de macho através de programas de IA Conservação de material genético de animais em vias de extinção

10 Criopreservação de sêmen Congelação de sêmen 196 C Viabilidade do esperma é reduzida em 50% Capacidade de fertilização é reduzida sete vezes após a criopreservação Efeitos adversos sobre os espermatozoides Redução na taxa de viabilidade Integridade estrutural Redução na motilidade Redução na taxa de concepção

11 Criopreservação de sêmen Congelação de sêmen 196 C Efeitos deletérios da criopreservação nas organelas espermática Indução da reação acrossomal prematura Alteração na função mitocondrial Redução da motilidade Falha na descondensação da cromatina Arrefecimento reorienta de fosfolipídios Interromper a função e a permeabilidade seletiva da membrana Choque de frio Diminui o metabolismo celular Alteração da permeabilidade da membrana Perda de componentes intracelulares Perda irreversível da motilidade espermatozoides Aumento do número de espermatozoides mortos

12 Criopreservação de sêmen Congelação de sêmen 196 C Existem dois principais gamas de temperatura em relação a danos durante a congelação de espermatozoides Período de super-refrigeração 0 5 C Estresse osmótico Período de formação de cristais de gelo - 6 a -15 C Problema pode ser superado pela técnica denominada seeding

13 Criopreservação de sêmen Crioprotetores Substituem e/ou removem a água intracelular Intracelulares (penetrantes) Etilenoglicol, dimetilsufóxido, glicerol, propanodiol, butanodiol e metanol Extracelulares (não penetrantes) Lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona, manitol, trealose e albumina sérica bovina (BSA), gema de ovo, leite Criopreservação de embriões

14 Criopreservação de sêmen Fatores que afetam sucesso de criopreservação: Toxicidade do crioprotetor Tipo de extensor Taxa de resfriamento Taxa de aquecimento Embalagens Variação individual do animal Alguma perda de viabilidade do espermatozoide é inevitável devido aos procedimentos de processamento antes de congelação, bem como durante o processo.

15 Sumário 1. Introdução 2. Criopreservação de sêmen 3. Efeito da criopreservação 1. No metabolismo dos espermatozoides 2. Na ultra-estrutura dos espermatozoides 4. Recentes avanços na criopreservação 5. Considerações finais

16 Efeito da criopreservação no espermatozoide Efeito no metabolismo dos espermatozoides: Comparação criopreservados VS. sêmen fresco Vida útil mais curta e menor taxa fecundação Diferença atribuída á Taxa de geração de O 2 - e H 2 O 2 Concentração intracelular de iões de cálcio livres (Ca 2 + ) Crioprotetores para amenizar esses efeitos Extensores base de gema de ovo Reduzem significativamente o nível intracelular de radicais livres Tratamento pós-descongelação de sêmen congelado com tióis Antioxidantes impedem danos na membrana provocados por H 2 O 2 Perda de motilidade espermática

17 Efeito da criopreservação no espermatozoide Efeito no metabolismo dos espermatozoides: As mudanças estruturais na membrana dos espermatozoides pósdescongelamento Alteração na capacidade de produção de energia na forma de ATP Concentração intracelular de ATP é reduzida após a criopreservação Queda na motilidade de espermatozoides Glicose-6-fosfato-desidrogenase Sai da célula quando a membrana celular é danificada durante a criopreservação

18 Efeito da criopreservação no espermatozoide Efeito no metabolismo dos espermatozoides: Stress oxidativo Temperatura ambiente o espermatozoide usa preferencialmente a via glicólica para síntese de ATP em detrimento a fosforilação oxidativa; Incapacidade para sintetizar antioxidantes Alta concentração de ácido graxo poli-insaturado, Alta capacidade de produzir aniões superóxido (O 2 ) e peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 ) através da respiração mitocondrial, Mecanismo de defesa antioxidante endógena restrito

19 Efeito da criopreservação no espermatozoide Congelamento provoca alteração da membrana Alterações após a descongelação Perda substancial da viabilidade de espermatozoides

20 Efeito da criopreservação no espermatozoide Características das membranas que afetam a criopreservação Fluidez das membranas pré-requisito para a sua função eficiente Proporção colesterol/fosfolipídeo, Grau de saturação de hidrocarboneto Relação proteína/fosfolipídeo Diferença da criosensibilidade de espermatozoides de diferentes espécie Cada espécie contém uma composição de membrana diferente Proteínas de fixação periférica

21 Efeito da criopreservação no espermatozoide Ø Efeito da criopreservação na capacitação Capacitação e hiperativação prematura Aumento intracelular de cálcio O aumento das concentrações de iões de cálcio desencadeiam sinais intracelular de capacitação Criopreservação Alterações na membrana do espermatozoide Influxo de cálcio Capacitação prematura

22 Sumário 1. Introdução 2. Criopreservação de sêmen 3. Efeito da criopreservação 1. No metabolismo dos espermatozoides 2. Na ultra- estrutura dos espermatozoides 4. Avanços recentes na criopreservação 5. Considerações finais

23 Avanços recentes na criopreservação u Aumento na sobrevivência de sêmen pós descongelamento o Minimização dos danos oxidativo o Quebra de material genético (DNA) o Peroxidação de lipídeos o Suplementação de ácidos gordos poli-insaturados na alimentação Ø Alteração do perfil lipídico da membrana plasmática

24 Avanços recentes na criopreservação u Diminuição do estresse osmótico no espermatozoide u Crioprotetores o Compostos com baixo peso molecular em alternativa ao glicerol Ø Metil-formamida Ø Dimetilformamida Ø Etilenoglicol Ø Dimetilacetamida ü Proporcionam maior motilidade do sptz pós-descongelamento u Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) ü Efeito benéfico na função espermática pós-descongelação ü DNA-integridade

25 Sumário 1. Introdução 2. Criopreservação de sêmen 3. Efeito da criopreservação 1. No metabolismo dos espermatozoides 2. Na ultra- estrutura dos espermatozoides 4. Recentes avanços na criopreservação 5. Considerações finais

26 1. Criopreservação de sêmen continua sendo uma das técnica mais utilizada na produção animal. Considerações Finais 2. No entanto, criopreservação causa efeito negativo sobre os compartimentos de espermatozoides e na sua função. 3. Diferentes compartimentos de esperma são inter-relacionados e defeito em um invariavelmente afeta o outro. 4. A capacidade de fecundação do espermatozoide criopreservado é afetada ao longo de todo o curso desde a sua origem até que alcançar o o óvulo.

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