TSH INSTRUÇÕES DE USO
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- William Faro Sacramento
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1 TSH INSTRUÇÕES DE USO ENZIMAIMUNOENSAIO PARA DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DA CONCENTRAÇÃO DO HORMÔNIO ESTIMULADOR DA TIREÓIDE (TSH) EM SORO HUMANO SOMENTE PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO Conservar entre 2 e 8 C. SINONÍMIA Hormônio estimulador da Tireóide (TSH). Tirotrofina FINALIDADE Para determinação quantitativa da concentração do hormônio estimulador da Tireóide (TSH) em soro humano. Este teste é utilizado no diagnóstico e controle de tratamento das afecções tireoidianas e pituitárias. INTRODUÇÃO A determinação dos níveis séricos ou plasmáticos do hormônio estimulador da tireóide (TSH ou Tirotrofina) é reconhecida como um método sensível para o diagnóstico primário e secundário do hipotireoidismo. O TSH é secretado pelo lobo anterior da glândula pituitária e induz a produção e liberação da tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) pela glândula tireóide. O TSH é uma glicoproteína com peso molecular de aproximadamente 28. daltons, consistindo em duas unidades quimicamente diferentes: alfa e beta. Apesar da concentração de TSH no sangue ser extremamente baixa, é essencial para a manutenção da função tireoidiana normal. A liberação do TSH é regulada pelo hormônio liberador de tireotrofina (TRH) produzido pelo hipotálamo. Os níveis de TSH e TRH são inversamente proporcionais ao nível do hormônio tireoidiano. Quando existe um alto nível de hormônio tireoidiano no sangue, menos TRH é liberado pelo hipotálamo e, consequentemente, menos TSH é secretado pela pituitária. A ação oposta ocorrerá quando houver uma diminuição do hormônio tireoidiano na corrente sanguínea. Este processo é conhecido como mecanismo de retroalimentação negativa e é responsável pela manutenção dos níveis adequados destes hormônios no sangue. O TSH e as glicoproteínas pituitárias: hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo estimulante (FSH) e gonadotrofina coriônica humana (hcg), possuem cadeias alfa idênticas. As cadeias beta são diferentes, mas possuem regiões com seqüências idênticas de aminoácidos. Essas regiões homólogas podem provocar consideráveis reações cruzadas com alguns soros anti-tsh policlonais. O uso de anticorpo monoclonal no TSH Biocheck elimina esta interferência, que poderia resultar em resultados de TSH falsamente elevados em gestantes ou mulheres no climatério, população cuja avaliação da situação tireoidiana é clinicamente significativa. PRINCÍPIO DO TESTE O TSH Biocheck é um ensaio enzimático imunoabsorvente em fase sólida. O teste utiliza um anticorpo monoclonal direcionado contra um determinante antigênico distinto na molécula intacta do TSH. Os poços da microplaca são revestidos com anticorpo monoclonal anti-tsh de camundongo e a solução de conjugado utiliza anticorpo anti- TSH de cabra ligado à Peroxidase. A amostra é adicionada e reage simultaneamente com os dois anticorpos, de forma que as moléculas de TSH ficam posicionadas entre os anticorpos da fase sólida e os do conjugado. Após incubação de 6 minutos em temperatura ambiente, a placa é lavada para remover os anticorpos marcados não ligados. Adicionase em seguida a solução de 3,3,5,5 Tetrametilbenzidina (TMB - Substrato) e a placa é incubada por 2 minutos, resultando no aparecimento de uma cor azul. O desenvolvimento da cor azul é interrompido pela adição de HCl 1N (Solução de Bloqueio) e a cor amarela resultante é medida espectrofotometricamente em 45 nm. A concentração de TSH é diretamente proporcional à intensidade da cor na amostra testada. REAGENTES 1 placa de poliestireno com 96 microcavidades destacáveis revestidas com anticorpo monoclonal de camundongo anti-tsh. Manter a placa acondicionada dentro da embalagem plástica contendo dessecante. Calibradores (Liofilizados): 6 frascos contendo TSH em matriz de soro eqüino, nas concentrações /,5 / 2, / 5, / 1, / 25, µui/ml e Bromonitro dioxano,4 g/dl como preservativo. Reconstituir seguindo as instruções do tópico Preparação dos Reagentes. Conjugado: 1 frasco com 13 ml de solução tamponada em ph 7,6 (diluída 1: 5 em Tampão Salina Fosfato, PBS - Cloreto de sódio,,8 g, Cloreto de potássio,,2 g, Fosfato de sódio bibásico,,115 g, Fosfato de potássio monobásico,,2 g e Água destilada q.s.p. 1 ml), contendo anticorpo de cabra anti-tsh conjugado com Peroxidase, H2SO4, e Bromonitro dioxano,4 g/dl como preservativo. Substrato TMB: 1 frasco com 11 ml de solução tamponada em ph 3,5 (com Tampão Citrato-Fosfato: Citrato de Sódio,7 mol/l, Fosfato de Sódio,6 mol/l, Água destilada q.s.p. 1 ml), contendo 3,3, 5,5 - Tetrametilbenzidina,5 mmol/l, Peróxido de hidrogênio 1 µmol/l e Bromonitro dioxano,4 g/dl como preservativo. Extremamente fotossensível. Protegê-lo da ação da luz. O reagente deve permanecer incolor ou levemente azulado; o aparecimento de coloração azul mais intensa indica contaminação e o reagente deve ser descartado. Solução de Bloqueio: 1 frasco com 11 ml de solução de Ácido Clorídrico (HCl 1N). 1
2 Materiais necessários, mas não inclusos: Pipetas automáticas de precisão. Ponteiras descartáveis. Água destilada ou deionizada. Vórtex ou equivalente. Vidraria Timer ou cronômetro Papel absorvente ou papel toalha. Papel de gráfico milimetrado, se necessário. Leitora de microplaca que possua filtro com banda de passagem de até 1nm e leitura média de densidades ópticas de -3 D.O. em nm. ARMAZENAMENTO DO KIT E MANUSEIO 1. O Kit deve ser armazenado entre 2 e 8 C. 2. A microplaca deve ser mantida sempre em sua embalagem, bem fechada e com dessecante para proteger da umidade. 3. Os reagentes são estáveis até a data de expiração do kit, desde que conservados na temperatura indicada. 4. Evitar exposição dos reagentes ao calor, luz solar ou luz forte direta, durante armazenagem ou uso. PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS 1. Material potencialmente infectante: Todos os reagentes foram testados e comprovados não reativos para a presença de vários agentes contaminantes, em especial anticorpos anti-hiv 1 e 2 e HbsAg. Entretanto nenhum teste laboratorial pode assegurar com certeza absoluta que quaisquer agentes infecciosos, incluindo vírus da Hepatite B e HIV, estejam ausentes. Tratar os reagentes, portanto, como amostras altamente infectantes como recomendam as normas da Secretaria de Vigilância Sanitária local, incluindo os procedimentos com relação à manipulação e descarte dos mesmos. 2. O kit é designado para uso diagnóstico in vitro. 3. Não pipetar com a boca. Não fumar, comer ou beber dentro da área de trabalho onde reagentes e amostras estiverem sendo manuseados. 4. Não utilizar os reagentes após a data de expiração do kit e não misturar ou trocar reagentes de lotes diferentes. 5. A Solução de Bloqueio é cáustica e corrosiva. Em caso de contato lavar imediatamente o local afetado com água em profusão. Em caso de ingestão acidental, procurar auxílio médico imediato. Não provocar vômitos. 6. Recolocar as tampas dos frascos imediatamente após o uso. Não misturar as tampas dos reagentes. 7. Cada cavidade da placa pode ser utilizada somente uma vez. COLETA DE AMOSTRA E PREPARAÇÃO 1. Coletar o sangue e separar o soro. 2. Não é necessário nenhum tratamento prévio da amostra. 3. Devem ser utilizadas somente amostras de soro sem aditivos ou conservantes. 4. As amostras de soro devem ser armazenadas entre 2 e 8 C por até 48 horas, e devem ser congeladas a 2 C ou menos para períodos mais longos (até 6 meses). Amostras congeladas devem ser misturadas por inversão várias vezes após seu descongelamento. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos de amostras. 5. Amostras fortemente hemolisadas ou fortemente lipêmicas podem interferir nos resultados. 6. Atenção: Amostras contendo azida sódica não devem ser utilizadas. PREPARAÇÃO DOS REAGENTES Reconstituir cada calibrador liofilizado com 1 ml de água destilada ou deionizada. Após a reconstituição, deixar em repouso por 2 minutos. Homogeneizar delicadamente por inversão e com movimentos circulares até a dissolução completa do conteúdo dos frascos. O material reconstituído deve ser armazenado entre 2-8 C (até 3 dias). Sugere-se o armazenamento em alíquotas a -2 C visando o aumento da estabilidade. O material congelado deve ser degelado uma única vez. Amostras apresentado concentração de TSH superior a 25µUI/mL devem ser diluídas 1:1 com o calibrador zero. Todos os reagentes devem ser misturados suavemente por inversão ou movimentos circulares antes do uso. Evitar a formação de espuma. Notas de Procedimento - Não se recomenda a utilização de mais de 32 cavidades para cada ensaio, principalmente para pipetagem manual. - Cada pipetagem, após iniciada, não deve ser interrompida. - Utilizar preferencialmente uma pipeta multi-canal para a adição dos reagentes. PROCEDIMENTO Antes da realização do teste espere que os reagentes, padrões e controles atinjam a temperatura ambiente (18 a 25ºC). 1. Colocar o número necessário de cavidades no suporte, para os calibradores, controles e amostras. 2. Pipetar 1 µl de calibradores, controles e amostras nos poços apropriados. 3. Adicionar 1 µl do Conjugado em todos os poços. Homogeneizar por 3 segundos através de movimentos circulares. É importante uma homogeneização rigorosa. 2
3 4. Incubar por 6 minutos em temperatura ambiente (18-25 C). 5. Desprezar o conteúdo dos poços e lavá-los 5 vezes com água destilada ou deionizada. Invertê-los em papel absorvente, batendo para retirar o excesso de líquido. Atenção: lavagens insuficientes ocasionam resultados falsamente elevados. 6. Pipetar 1 µl do Substrato em todos os poços. Homogeneizar. 7. Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente (18-25 C), ao abrigo da luz. 8. Pipetar 1 µl de Solução de Bloqueio em todos os poços. 9. Homogeneizar por 3 segundos. Nesta etapa a mudança da cor azul para a amarela deve ser completa, a fim de evitar resultados duvidosos. 1. Ler as densidades ópticas em nm, em até 1 minutos. CÁLCULO DOS RESULTADOS 1. Calcular a média dos valores de absorbância (A45) para cada conjunto de calibradores, controles e amostras. 2. Preparar uma curva padrão locando a média de absorbância obtida para cada padrão contra a sua concentração em µui/ml em papel de gráfico milimetrado, com os valores de absorbância no eixo Y e as concentrações no eixo X. 3. Usar a média dos valores de absorbância para cada amostra para determinar a concentração correspondente de TSH em µui/ml, utilizando a curva padrão. 4. Para amostras diluídas, calcular o resultado final multiplicando o valor obtido pelo fator de diluição. EXEMPLO DE CURVA PADRÃO A tabela abaixo apresenta os resultados de um ensaio padrão típico com as leituras de densidade óptica em 45 nm demonstradas no eixo Y contra as concentrações de TSH demonstradas no eixo X. A curva padrão representa uma faixa dinâmica entre e 25 µui/ml. Atenção: os valores de D.O. são apenas ilustrativos e não devem ser usados para cálculo de determinações. Cada laboratório deve determinar seus próprios valores. O valor de absorbância pode variar em função da incubação à temperatura ambiente, visto que diferentes laboratórios apresentam diferentes temperaturas. TSH (µui/ml) Absorbância (45 nm),63,5,157 2,,398 5,,818 1, 1,415 25, 2,645 Absorbância (45 nm) 3 2,5 2 1,5 1, Concentração de TSH (uui/ml) VALORES ESPERADOS Cada laboratório deve estabelecer seus próprios valores de referência, baseado em sua população. Diferenças na técnica de ensaio podem afetar os resultados. Abaixo apresentamos os valores de referência obtidos em testes feitos com amostras de 38 indivíduos normais e 77 indivíduos hipertireoidianos. As faixas foram calculadas a partir da média ± 2 D.P. (µui/ml de TSH). Esses valores podem variar com relação a outros dados publicados. Indivíduos Normais Indivíduos com Hipertireoidismo Amostras Média de resultados (µui/ml 1,44 <,2 de TSH) Faixa de Variação,3 8,1 <,2 VALORES DE REFERÊNCIA As faixas de referência apresentadas abaixo são baseadas no Guia Clínico para Testes Laboratoriais de N.W.Tiez. Adultos: Gestantes: anos anos 1º Trimestre 2º Trimestre 3º Trimestre TSH (µui/ml),4 4,2,5 8,9,3 4,5,5 4,6,8 5,2 CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO 1. SENSIBILIDADE: A sensibilidade de um kit de ELISA pode ser definida como a mais baixa concentração, diferente de zero, que pode ser detectada, calculada a partir de 95% (do limite de confidência do padrão) do Kit. Os testes de sensibilidade foram feitos a partir de amostras de valores conhecidos, de forma crescente, a fim de determinar a faixa mínima de concentração em que a reação ocorreria. Para tanto, 8 kits foram selecionados 3
4 aleatoriamente e testados 1 vezes com cada uma das amostras, cujos valores de concentração variam de,9 a,5 µui/ml. Os resultados dos testes realizados determinaram, portanto, que o limite mínimo de detecção do kit é,2 µui/ml. Nas concentrações de,1 e,2 µui/ml de TSH, os coeficientes de variação inter-ensaio foram determinados como sendo 11,4 e 7,9%, respectivamente. 2. ESPECIFICIDADE: Os seguintes hormônios foram testados para verificação da ocorrência de reações cruzadas: Hormônio Testado HCG (OMS, 2ª IS, 61/6) FSH (OMS, 2ª IRP, HMG) LH (OMS, 1ª IRP, 68/4) hgh (OSM, 1ª IRP, 65/217) hgh (OSM, 1ª IRP, 65/217) Concentração 1 mui/ml 6 mui/ml 3.5 mui/ml 1. mui/ml 2. mui/ml 2 mui/ml 1 mui/ml 2 mui/ml 75 mui/ml 15 mui/ml 3 mui/ml 1 ng/ml 5 ng/ml 2 ng/ml 1 ng/ml 5 ng/ml 2 ng/ml Intensidade produzida equivalente ao TSH (µui/ml) <,2 <,2 <,2 <,2 3. EXATIDÃO: O TSH Biocheck foi comparado com o teste de TSH de terceira geração Immulite 2 DPC. Os métodos são semelhantes visto que ambos destinam-se à determinação quantitativa de TSH em soro humano e utilizam TSH calibrado em µui/ml, conforme padronizado pela Organização Mundial de Saúde (2ª IRP, 8/558). O estudo foi conduzido utilizando 39 amostras de soro de indivíduos eutireoidianos e 2 de indivíduos hipotireoidianos, conforme previamente determinado por análise laboratorial hospitalar. A faixa de resultados das amostras testadas variou entre,4 a 63 µui/ml. A comparação entre os métodos demonstrou boa correlação entre os dois testes, conforme apresentado abaixo: Amostras 59 Coeficiente de Correlação,994 Intervalo de variação (Slope) 1,27 Intreceptação,787 Média TSH Biocheck Média KIT DPC 8,39 µui/ml 9,41 µui/ml Outras 77 amostras de pacientes com hipertireoidismo também apresentaram resultados coincidentes com o KIT DPC: Nº. de Amostras com TSH,2 µui/ml TSH Biocheck N = 77 KIT DPC N = PRECISÃO: Intra-Ensaio: A precisão intra-ensaio foi determinada pela análise repetida de quatro amostras diferentes de soro em um ensaio. A variabilidade intra-ensaio é apresentada na tabela abaixo: Amostra de Soro Número de repetições Média (µui/ml de TSH) ,62 1,51 15,48 26,14 Desvio Padrão,3,9,39,86 Coeficiente de Variação (%) 4,6 5,7 2,5 3,3 Inter-Ensaio: A precisão inter-ensaio foi determinada pela análise repetida de quatro amostras diferentes de soro em uma série de ensaios calibrados individualmente, conforme mostra a tabela abaixo: Amostra de Soro Número de repetições Média (µui/ml de TSH) ,64 1,46 15,38 25,26 Desvio Padrão,5,1,87 1,75 Coeficiente de Variação (%) 7,6 7,1 5,7 8,9 5. EFEITO HOOK : Não foi observado efeito Hook neste ensaio para concentrações de TSH de até 1. µui/ml. 4
5 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO 1. Resultados confiáveis e reprodutíveis serão obtidos se o procedimento do teste for seguido com o completo entendimento das instruções de uso e de acordo como as boas práticas laboratoriais. 2. O procedimento de lavagem é importante. Lavagens insuficientes ocasionam falsos resultados. 3. A homogeneização, após a adição de cada reagente, deve ser bem feita para se evitar uma baixa precisão do teste. 4. Como em outros ensaios sorológicos, os resultados deste teste devem ser analisados em conjunto com outras informações disponíveis para se definir uma evolução clínica e o diagnóstico. 5. O TSH Biocheck não foi testado em recém nascidos. Assim sendo, não deve ser usado na triagem de recém nascidos. TERMOS E CONDIÇÕES DE GARANTIA DA QUALIDADE A qualidade do produto estará garantida se o kit for usado dentro do prazo de validade, todas as condições de armazenamento e manuseio forem seguidas, assim como tomadas as devidas precauções e os cuidados especiais conforme o indicado nestas instruções de uso. Deve-se utilizar somente os reagentes fornecidos com o kit. O procedimento do teste também deve ser seguido à risca, passo a passo, bem como a preparação dos reagentes. O usuário não deve, de forma alguma, iniciar os testes sem ter realizado a leitura completa das instruções de uso. As boas práticas laboratoriais requerem que os controles sejam passados em cada curva de calibração. Um número significativo de controles deve ser testado para se estabelecer os valores médios e os limites aceitáveis para o seu desempenho. Recomendamos o uso de soro controle disponível no mercado. Não devem ser utilizados controles que contenham azida sódica. PADRONIZAÇÃO Os padrões de referência do TSH são calibrados de acordo com a Segunda Referência Internacional para Preparação de htsh da Organização Mundial de Saúde (2ª IRP 8/558). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Burger, H. G., Patel, Y. C., Thyrotropin releasing hormone- TSH Clinic. Endocrinol. and Metab., 6, 831-(1977). 2. Ezrin, C., The Thyroid, S. C. Werner and S. H. lngbar (eds.), Harper and Row, Hagerstown, MD, 9, (1978). 3. Pierce, J. G., Endocrinology, 89, (1971). 4. Berger, S. and Quinn, J. L., Fund. Clin. Chem., N. W. Tietz (ed.), W. B. Saunders Co., Phila., PA 14, (1976). 5. Utiger, R. D., The Thyroid, S.C. Werner and S. H. Ingbar (eds.), Harper and Row, Hagerstown, MD, 9, (1978). 6. Soos, M. and Siddle, K., J. Immun. Methods, 51, (1982). 7. Wada, H. G., Danisch, R. J., Baxter, S. R., et al, Clin. Chem.,28, (1982). 8. Snyder, P. J. & Utiger, R. D., J. Clin. Endo. Metab., 34, (1972). 9. Engall, E., Methods in Enzymology, Vol. 7, VanVunakis, H. & Langone, J.J. (eds.), Acad. Press, NY, (198). 1. Uotila, M., Ruoslahti, E. and Engvall, E., J. lmmunol. Methods, 42, (1981). 11. USA Center for Disease Control/National Institute of Health Manual, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Clinical Guide to Laboratory Tests. Ed. N.W. Tietz, 3rd Ed., W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA 1916, Fabricado por: Bio Check, Inc. 323 Vintage Park Drive Foster City, CA EUA Serviço de Atendimento ao Consumidor (SAC): (xx11) Distribuído por: Interteck Internacional Imp. e Exp. Ltda Rua Sabarabussu, Santo Amaro CEP São Paulo SP CNPJ /1-94 Responsável Técnico: Alzenir Paulino de Arantes Christofe CRBM 2364 Nº Reg. ANVISA: Revisão: Jun/7 5
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