Imunoistoquímica e FISH nos carcinomas invasores

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1 Imunoistoquímica e FISH nos carcinomas invasores Monica Stiepcich Fleury Medicina e Saúde - Patologia Novembro

2 Diagnóstico, orientações terapêuticas e predição de risco em Oncologia Análises clínicas Anatomopatológico Genotipagem Expressão de mrna Proteômica Ribotipagem Estadiamento clínico Imunoistoquímica Receptores hormonais HER2 2

3 Câncer de mama Ductal Lobular Tubular Medular Micropapilar Lobular pleomórfico Mucinoso Rico em lipídios Metaplásico Secretor

4 Vias de diferenciação das células epiteliais glandulares mamárias SMA+ CK5 / 14+ SMA+ CK5+ CK14+

5 Expressão proteica nas células mamárias e carcinomas Korsching et al. J Clin Pathol 61: , 2008

6 Produção de anticorpos Policlonais Monoclonais 6

7 Processos teciduais em Patologia T E M P O Excisão Morte celular Fixação Desidratação Emblocamento Análise e diagnóstico Estudos auxiliares Nucleases Proteases Lipases Sacaridases Ampla variação: - Tempo entre excisão e fixação - Condições de fixação 7

8 Desparafinização 8

9 Métodos de reação Método direto Métodos indiretos 9

10 Métodos indiretos Reação em vários passos Anticorpos primários não-marcados Anticorpos secundários Procedimentos mais demorados Maior sensibilidade devido à amplificação do sinal 10

11 FISH 11

12 IIQ em Patologia mamária Diferenciação de hiperplasias epiteliais ductais usuais de hiperplasia ductal atípica e carcinomas ductais in situ Subclassificação de carcinomas em tipos ductal ou lobular Subclassificação dos carcinomas em basais, luminais ou HER2+ Afastar microinvasão em carcinomas intraductais extensos Diferencial de carcinomas e lesões epiteliais proliferativas benignas que os simulam Orientação de terapêuticas adjuvantes (hormonioterapia, Herceptina, anti-egfr, TOPO2A) Avaliação de micrometástases e linfonodos sentinela YEH e MIES,

13 Status dos receptores hormonais Métodos de avaliação: Macerados de tecido: PCR quantitativo, amplificação por Southern blotting, ELISA Imunoistoquímica Quantificação da marcação IIQ: critérios não uniformizados Avaliação por número de células marcadas Avaliação combinada (no. e intensidade) TMA: melhor comparabilidade dos KINSEL et al resultados em grandes amostrasbiesterfeld et al REINER et al GOLOUH et al MONTORO et al ALLRED et al STIERER et al HARVEY et al YAMASHITA et al. 2006

14 Allred Scoring Guideline 14

15 Padrões de imunomarcação Anticorpo s Ki-67 ER PR p53 p63 CK5,6 CK8 CK18 CK14 CK17 c-erbb-2 EGFR Padrões de imunomarcação Nuclear Nuclear Nuclear Nuclear Nuclear Citoplasmático e membrana Citoplasmático incompleto* e membrana Citoplasmático incompleto* e membrana incompleto* Citoplasmático/membrana irregular Citoplasmático membrana Membrana e citoplasmático*

16 Gradação das reações de imunoistoquímica mica 16

17 17

18 18

19 Lesões mamárias esclerosantes Maligno - Carcinoma tubular Benigno - Cicatriz radiada 19

20 Lesões mamárias esclerosantes 20

21 Micrometástases em linfonodos sentinelas 21

22 Receptores tirosino-quinase

23 c-erbb-2 2 (HER2/neu neu) Chr17q21 Amplificação: 15 a 20% dos CAs mama Expressão aumentada da pher2 em 95% dos casos amplificados Reorganização do citoesqueleto modifica adesão e motilidade celular invasividade e potencial metastático Expressão e ativação de proteases Expressão aumentada Pior evolução clínica Quimiorresistência ER-, PR-, p53+, alto GN Alta fração de fase S Comprometimento nodal Melhor resposta à antraciclina SLAMON et al OWENS et al YAZIJI et al

24 Amplificação do gene HER2 (*) Watters AD, Going JJ, Cooke TG, Bartlett JM. Breast Cancer Res Treat 2003 Jan;77(2):109 24

25 HER2 e resposta aos antracíclicos 25

26 Trastuzumab Disease-free survival Overall survival DFS by subgroup PICCART-GEBHART et al. 2005; ROMOND et al SLAMON et al JOENSUU et al OZOLS et al

27 Padronização técnica e interpretativa dos resultados 27

28 C-erbB-2 Escores

29 TOPO2A 29

30 Amplificação de TOPO2A Co-amplificação de TOPO2A / HER2: melhor resposta aos antracíclicos É rara a amplificação de Antracíclicos intercalam-se na estrutura do DNA, provocando distorções TOPO2A na ausência de amplificação de HER2 Presente em ~ 8% da população e 35% dos casos 30

31 31

32 TOP2A FISH pharmdx Kit 32

33 CA LOBULAR GRAU III HER2 e TOPO2A - CISH HER2 AMPLIFICADO TOPO2A AMPLIFICADO CA DUCTAL GRAU III HER2 AMPLIFICADO TOPO2A NÃO AMPLIFICADO 33

34 EGFR (HER1) Chr 7p11.2-p2 Anticorpos anti-egfr : opção terapêutica nos carcinomas mamários triplo-negativos (ER-, PR- HER2-) e basalóides SALOMON et al SCHLESSINGER 2000 HUTCHESON et al HYNES e LANE

35 Ki-67 Proteína nuclear e nucleolar humana (constituinte da cromatina) Expressa durante as fases G1, S, G2 e mitose Ausente na fase G0 e em células quiescentes Função desconhecida Determinação rápida e exata da fração proliferativa - IIQ Correlação com grau histológico, sobrevida e resposta terapêutica GERDES et al ENDL e GERDES 2000 KREITZ et al. 2000; LEE et al herkules.oulu.fi

36 Citoesqueleto, CKs e funções celulares Expressão em pares - tipo I (CKs básicas) e tipo II (CKs ácidas) Adaptadores, vias de canalização e transporte intracelular Aproximam ou afastam moléculas; deslocamento de proteínas Intermediação, transferência, sinalização, atenuação de sinais mecânicos e ligações com receptores de membrana Dinâmica de resposta celular ao estresse, sinalização celular e apoptose através de fosforilação e interação com proteínas associadas (ex: sigma) KIRFEL 2003 OMARY 2004 (Basic CKs) (Acidic CKs) Novocastra.com

37 Papel ativo na diferenciação mamária Altos níveis de colagenase tipo IV Participação nos processos de renovação da membrana basal e remodelação das glândulas Perfil basal Células basais mamárias nejm.org/content/vol342/issue3 Expressão de CKs específicas basais (CK5, 14, 17) Alterações na expressão das CKs: embriogênese, metástases STREULI et al MONTEAGUDO et al

38 Sobrevida - perfis IIQ EC I e II EC III e IV HERpos HR pos Basalóide HER2 pos HR neg Basalóide HER2 pos HR neg

39 Cancer Stem Cells Breast Cancer Stem Cells: Lin - CD44 hi CD24 low B ESA + CD44 low CD24 hi site CD44 low CD24 hi CD44 low CD24 hi CD44 hi CD24 low site CD44 hi CD24 low CD44 hi CD24 low Al-Hajj et al. PNAS 100: , 2003

40 Variações nos resultados dos testes IIQ / FISH 40

41 Variações na recuperação antigênica 41

42 Tissue Microarrays NEJ M 351, 2004 Análise múltipla e em paralelo no mesmo grupo de casos por diferentes metodologias Expressão de proteínas, RNA e DNA por hibridização in situ e IIQ bentham.org Avaliação e validação dos novos marcadores descobertos pelas técnicas de cdna microarray Aceleração dos avanços da pesquisa aplicada à clínica ( translational research ) Organização de grandes grupos de espécimes arquivados Despersonalização das amostras (sigilo das pesquisas) Cancer Genetics Branch, NHGRI 42

43 Desafios Individualização da avaliação do risco, diagnóstico e tratamentoorganização de bancos de amostras Análise dos dados de pesquisa Integração Pesquisa Prática Difusão Organização Correlação com evolução clínica e resposta terapêutica Proteômica Educação Farmacogenética Farmacogenômica

44 Unidade Técnico-Administrativa - 44 Jabaquara

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