Dialogando com um Centro de Reprodução: A preservação de gametas hoje. Rita Figueira, PhD, TS(ABB)

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2 Conceito e Objetivo: Conceito Criopreservação é um processo onde células ou tecidos biológicos são preservados por meio de resfriamento a temperaturas muito baixas, geralmente 196 C. Objetivo Suspensão do metabolismo e a manutenção das características biológicas por um longo período de tempo, mantendo a viabilidade celular.

3 Histórico: SPTZ 1953 Bunge & Sherman EMBRIÃO 1983 Trounson et al. OÓCITO 1986 Chen et al.

4 Aplicações: Gameta Fator masculino grave; Oscilação na contagem de sptz; Disponibilidade no período do tratamento; Pré-vasectomia; Orquiectomia; Paciente oncológico. Gameta Ausência de sptz no dia da punção folicular; Acúmulo de oócitos em ciclos de FIV; Falência ovariana precoce; Ooforectomia; Postergar a maternidade; Paciente oncológico.

5 Preservação Número de Gametas de mortes prevenidas em (EUA, ) e (EUA, ) Paciente oncológico: Dados gerais Sobrevida 5 anos 20 pontos percentuais

6 Paciente oncológico: Câncer Infantil Incidência 0,6% / ano Índice de Mortalidade 67%

7 Paciente oncológico: 87% afirmam que falta informação 33% encaminham o paciente ao especialista em infertilidade 23% nunca consultaram informações de guidelines em preservação da fertilidade

8 Paciente oncológico: 63% afirmam discutir com o paciente 83% dos em idade pós-puberal encaminhados para CRIO de sptz Apenas 39% dos em idade pré-puberal 1% encaminhadas para Centros de Fertilização in vitro

9 Paciente oncológico: Atualmente 25% 50% dos pacientes desconhecem a possibilidade de preservar a fertilidade antes do tratamento oncológico

10 Estratégias : Criopreservação de sptz Após masturbação Após Após métodos métodos Proteção gonadal Criopreservação Após masturbação de alternativos alternativos de coleta de coleta durante a terapia com Tecido Testicular radiação Supressão Supressão testicular testicu com análogo com análogo ou ou antagonista antagonista do GnRh do Gn Não invasivo Técnica estabelecida para preservação da fertilidade Resultados comprovados Número significativo de casos Aspiração testicular Aspiração testicular /epididimária /epididimária Eletroejaculação Eletroejaculação Ejaculação retrógrada Ejaculação retrógrada Poucos casos Poucos casos relatados relatados Procedimento Não invasivo cirúrgico Técnica estabelecida para preservação Implante da testicular fertilidade Isolamento de espermatogônia Resultados comprovados Número Resultados significativo de apenas casos em modelo animal Operador dependente Limitado ao campo de radiação Estudos de caso Não invasiv Não Terapia invasivo hormo Terapia hormonal Eficácia não comprovada Eficácia não comprovada

11 Estratégias : Criopreservação de oócitos Criopreservação Após métodos de Proteção gonadal Criopreservação alternativos de coleta Após masturbação de embriões durante a terapia com Tecido Ovariano radiação Supressão Supressão ovariana testicu com análogo com análogo ou ou antagonista antagonista do GnRh do Gn EOC IVM Punção Folicular Taxa de bebês nascidos / oócito criopreservado EOC IVM Aspiração testicular /epididimária Punção Folicular Eletroejaculação FIV Ejaculação retrógrada Técnica estabelecida para preservação da fertilidade Poucos casos relatados Procedimento Não invasivo cirúrgico Técnica estabelecida para Transplante preservação da autólogo fertilidade (Ortotópico / Heterotópico) Resultados Transplante comprovados heterólogo Número significativo de casos Poucos casos relatados Operador dependente Limitado ao campo de radiação Estudos de caso Não invasiv Não Terapia invasivo hormo Terapia hormonal Eficácia não comprovada Eficácia não comprovada Estudos randomizados em andamento

12 Maternidade tardia e Mídia:

13 Maternidade tardia: X

14 Princípios básicos: Adição de Agentes Crioprotetores; Resfriamento e Congelamento/Vitrificação; Estocagem em Nitrogênio Líquido (-196 C); Remoção das Soluções Crioprotetoras; Descongelamento/Aquecimento.

15 Crioprotetores: DMSO Glicerol PROH Etilenoglicol Permeantes Baixo peso molecular Capacidade de atravessar membranas celulares Diminuição do ponto de congelamento

16 Crioprotetores: Sacarose Glicose Ficoll Não permeantes Alto peso molecular Não é capaz de atravessar membranas celulares Gradiente osmótico desidratação

17 Princípios básicos: Adição de Agentes Crioprotetores; Resfriamento e Congelamento/Vitrificação; Estocagem em Nitrogênio Líquido (-196 C); Remoção das Soluções Crioprotetoras; Descongelamento/Aquecimento.

18 Aspectos técnicos: Tipo e concentração dos agentes crioprotetores; Velocidade de resfriamento; Manutenção da temperatura de estocagem; Velocidade de aquecimento; Remoção de crioprotetores após descongelamento; Experiência do embriologista.

19 Implicações: Mecanismo biológico do efeito da criopreservação no genoma. ROS Espécie reativa de O2 CP Crioprotetor T o low Baixa temperatura

20 Técnica : Congelamento lento Test-Yolk Buffer (TYB) TES C 6 H 15 NO 6 S N-tris[hidroximetil]metil-2-ácido aminoetano sulfônico TRIS C 4 H 11 NO 3 2-amino-2-hidroximetil-1,3 propanodiol Gema de ovo (20% v/v) Glicerol (12% v/v) Vitrificação

21 resultados Técnica : Cohen et al., Human Reprod. 12:994,1997 Zona pelúcida Microesferas de agarose Microgotas Esferas de Volvox globator Pipetas de ICSI Schuster et al., Human Reprod. 18:788,2003 Beads de alginato Palhetas ou Criotubos Cryoloop

22 Técnica : Implicações Métodos aplicados: Motilidade Vitalidade Reação acrossômica não-fisiológica Indução de apoptose Vitrificação: Resultados Dano osmótico Tempo Custo

23 Fertility - Neoplasia : Objetivo Estudo retrospectivo: Julho 1996 Janeiro pacientes oncológicos 3.1% 9.2% 7.1% 9.2% 15.3% 56.1% Câncer testicular Câncer de próstata Linfoma Hodgkin Linfoma não Hodgkin Leucemia Outros 3 coletas (exceções 1 ou 2 CÂNCER TESTICULAR MAIOR INCIDÊNCIA coletas)

24 Time (months) Age (years) Patients (%) Preservação de Gametas Fertility - Neoplasia : 60 20% DOS PACIENTES COM FILHOS 70 IDADE MÉDIA 33 ANOS (16-69) TESTICULAR CANCER PROSTATE CANCER HODGKINS NON-HODGKINS LYMPHOMA LYMPHOMA CANCER TYPE LEUKEMIA OTHER MALIGNANCIES SINGLE MARRIED NO CHILDREN MARRIED CHILDREN MARITAL STATUS INTERVALO MÉDIO 4.5 MESES TESTICULAR CANCER PROSTATE CANCER HODGKINS LYMPHOMA CANCER TYPE NON-HODGKINS LYMPHOMA LEUKEMIA OTHER MALIGNANCIES

25 Kruger Morphology (%) Progressive Motility (%) Sperm concentration (M/mL) Motile sperm recuperation (%) Preservação de Gametas Fertility - Neoplasia : Concentração espermática média (milhões/ml) 20 45,4 (0,1 368) 10 Motilidade 0 progressiva média (%) 0 43,8 (6 84) 7 70 Morfologia Kruger média (%) 3,5 (0 11) TESTICULAR CANCER TESTICULAR CANCER PROSTATE CANCER PROSTATE CANCER HODGKINS NON-HODGKINS LYMPHOMA LYMPHOMA HODGKINS NON-HODGKINS LYMPHOMA LYMPHOMA LEUKEMIA OTHER MALIGNANCIES LEUKEMIA OTHER MALIGNANCIES TESTICULAR CANCER TESTICULAR CANCER PROSTATE CANCER Recuperação média de espermatozóides móveis (%) 28,5 PROSTATE CANCER HODGKINS NON-HODGKINS LYMPHOMA LYMPHOMA HODGKINS NON-HODGKINS LYMPHOMA LYMPHOMA LEUKEMIA OTHER MALIGNANCIES LEUKEMIA OTHER MALIGNANCIES

26 Fertility - Neoplasia : 2015: 276 pacientes incluídos ( ) 188 possuem amostras criopreservadas 73 opção por descarte 13 retirada para outro serviço 10 utilização 2 finalizadas Utilização das amostras: 10% pacientes Prognóstico desfavorável Morte do paciente Sem 30 planos pacientes/ano CUSTO para filhos Recuperação da função gonadal pacientes ~R$ 2.000,00 (3 coletas) ~R$ 350,00 (6 meses)

27 Resultados Fertility ICSI : 2015 Taxa de gestação/ciclo transferido (%) 45,0 34,4 FRESCO CRIO Fertility, 2014

28 Fertility Banco de Sêmen: Taxa de gestação/ciclo transferido (%) 45,0 39,0 34,4 PRÓPRIO IAD ~R$ 3.000,00/ amostra Fertility, 2014

29 Técnica : Conceito: Solidificação de uma solução em temperatura abaixo de zero em estado vítreo, transparente, livre de cristais de gelo.

30 Técnica : Vantagens: Não necessita equipamento específico; Custo; Velocidade do procedimento; Taxas de sucesso.

31 Histórico : Chen et al., 1986 Congelamento lento Kuleshova et al., 1999 Vitrificação LIMITAÇÕES

32 Limitações - Técnica : Crioprotetores Hastes Velocidade de resfriamento Velocidade de aquecimento Eficiência x Segurança

33 Limitações - Gameta : Tamanho da célula Conteúdo de H 2 O Permeabilidade da membrana Viabilidade celular

34 Limitações - Gameta : Fusos meióticos Ultra-estruturas celulares Perfil gênico (mrna) Perfil metabólico Aneuploidia Ana Cobo, ALPHA 2012

35 Vacúolos Preservação de Gametas Limitações - Gameta : Fusos meióticos Ultra-estruturas celulares Perfil gênico (mrna) Forma e distribuição de organelas Perfil metabólico Aneuploidia

36 Limitações - Gameta : Fusos meióticos Ultra-estruturas celulares Perfil gênico (mrna) Perfil metabólico Aneuploidia

37 Limitações - Gameta : Fusos meióticos Ultra-estruturas celulares Perfil gênico (mrna) Perfil metabólico Aneuploidia

38 Limitações - Gameta : Fusos meióticos Ultra-estruturas celulares Perfil gênico (mrna) Perfil metabólico Aneuploidia

39 Limitações - Técnica : Ana Cobo, ALPHA 2012

40 Limitações - Gameta :

41 Resultados Consenso :

42 Resultados - Neoplasia :

43 Resultados - Gerais :

44 Resultados - Maternidade tardia: Nagy et al., 2010

45 Resultados - Maternidade tardia: % de ciclos N o de folículos puncionados 26,4% 59.9% 10,4% 29,7% ,7 18,9 12,5 9,2 14,6 33,5% N o de oócitos recuperados 17,6 14,0 9,0 6,5 10, Fertility, 2014

46 Resultados - Maternidade tardia: 48 Cobo et al., 2010

47 Resultados - Maternidade tardia: Idade Tx. Bebê em casa / oócito aquecido N o de ooc para 1 bebê em casa 25a 31.3% 5.2% 19 37a 16.1% 2.7% 37 32a 21.6% 3.6% 28 42a 11.8% 2.0% 51

48 Resultados Fertility : 2015 (Social + Clínico): 209 pacientes incluídas ( ) 2172 oócitos vitrificados 92 pacientes 771 oócitos aquecidos 89 amostras finalizadas Utilização das amostras: ~45% Média 8,1 oócitos / paciente Tx. Bebê em casa / oócito aquecido N o de ooc para 1 bebê em casa Tx de sobrevida 75% 38,5a 38.9% 3.9% 25

49 Banco de Oócitos: BANCO DE OÓCITOS Flexibilidade Facilidade Custo Segurança

50 Fertility - Banco de Oócitos: Fertility Vitrification $2,225 ($1,500 - $2,500) ~R$ ($ 1,100) Fertility 7.5%/oócito 13 oócitos ( %) 6.8%/oócito 15 oócitos

51 Conclusões:?

52 OBRIGADA! When you get back, tell your hotshot scientists that we ve been reproducing with frozen sperm and eggs for years!

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