Criopreservação de embriões

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1 Criopreservação de embriões Vicente J.F. Freitas Biotecnologia da Reprodução Animal Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução Aula ministrada por: M.Sc. Ribrio Ivan T. P. Batista

2 1. PRINCÍPIO DA CRIOPRESERVAÇÃO 1. Danos causados pela criopreservação 2. Proteção contra danos 2. TÉCNICAS DE CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES 3. FATORES QUE AFETAM O SUCESSO DA TÉCNICA 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

3 Conceito Redução ou mesmo parada de todos os fenômenos biológicos (movimentos moleculares, reações químicas e atividades enzimáticas), as temperaturas inferiores a C.

4 Histórico Embrião de camundongo (Whittingham et al., 1972) Embrião de bovino (Wilmut e Rowson, 1973) Embrião de ovino (Willadsen et al., 1976) Embrião de caprino (Bilton e Moore, 1976)

5 Vantagens 1. Otimização das biotecnologias reprodutivas. 2. Conservação de material genético extinção/produção. a. Preservação de raças em vias de extinção. 3. Prevenção de perdas de animais vivos durante o transporte. 4. Adequação a época de parições.

6 Princípio da criopreservação O p r o t o c o l o e m p r e g a d o n a criopreservação de uma célula deve ser suficientemente lento para prevenir a cristalização da água intracelular e suficientemente rápido para prevenir a exposição das células a elevadas concentrações de eletrólitos antes da congelação.

7 Lesões nas membranas Danos

8 Desnaturação proteíca Danos

9 Desnaturação do citoesqueleto Danos

10 Proteção Ø Crioprotetores ü Proteção celular ü Reduzem a formação de cristais de gelo ü Reduzem do ponto crioscópico da água ü Maior estabilidade a membrana celular

11 Proteção Crioprotetores Substituem e/ou removem a água intracelular Intracelulares (penetrantes) Etilenoglicol, dimetilsufóxido, glicerol, propanodiol, butanodiol e metanol Extracelulares (não penetrantes) Lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona, manitol, trealose e albumina sérica bovina (BSA)

12 Proteção Crioprotetores Moléculas protetoras do citoesqueleto Citocalasina B

13 Proteção Toxicidade de Crioprotetores Concentração Entre 1 e 2 M Tempo de exposição 10 a 20 min. Nível de toxicidade Etilenoglicol Glicerol Propilenoglicol

14 Métodos Métodos de criopreservação Congelamento lento Convencional One-Step Vitrificação OPS Em grade de microscopia eletrônica de transmissão Cryollop Micropipetas de vidro GMP Em superfície sólida de vitrificação SSV Microgotas Hemi-palhetas ( Hemi Straw )

15 Congelação lenta São utilizados taxas de resfriamento que permitem a troca de água intracelular por crioprotetor, sem grandes efeitos osmóticos ou mudanças na forma celular, prejudiciais á funcionalidade das células.

16 Congelação lenta Etapas de congelação lenta com etilenoglicol 1. Lavar embriões em PBS com 0,4% de BSA 2. Equilíbrio com 1,5 M de etileno glicol em PBS com 0,4% de BSA por pelo menos 5 ;

17 Congelação lenta Etapas de congelação lenta com etilenoglicol 3. Envase durante o equilíbrio (mínimo de três colunas, separadas por bolhas de ar; embrião na coluna do meio) 4. Levar palhetas ao congelador de embriões (já estabilizado entre -5 e -7ºC); 5. Deixar por 5 minutos a -5/-7ºC;

18 Etapas de congelação lenta com etilenoglicol Congelação lenta

19 Congelação lenta Etapas de congelação lenta com etilenoglicol 6. Realizar o seeding; 7. Confirmar formação do gelo nas palhetas; 8. Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC;

20 Congelação lenta Etapas de congelação lenta com etilenoglicol 8. Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC; 9. Iniciar curva de congelação (-0,3 a -0,6ºC/min); 10.Após atingir 32ºC, mergulhar palheta em N2 liquido (não tocar palheta com as mãos).

21 Congelação lenta Etapas de descongelação lenta com etilenoglicol 1. Descongelação: 5 no ar e 30 em banho-maria a 35-37ºC 2. Palheta é montada diretamente no inovulador ; 3. Recomendado não levar mais do que 20 entre a descongelação e a inovulação; 4. Não existe avaliação prévia do embrião.

22 Vitrificação Ø Estado líquido estado vítreo (amorfo) Ø Crioprotetores com alto grau de viscosidade Ø Crioprotetores: etilenoglicol e DMSO Ø Alta velocidade na congelação (imersão direta no N2)

23 Vitrificação Vitrificação por OPS (Vajta, 1998). Ø Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno) Ø Crioprotetores: Ø Meios Ø Solução I (VS1): Ø TCM Hepes + SFB (20%) Ø Etilenoglicol (7,5%) e DMSO (7,5%) Ø Solução II (VS2): Ø TCM Hepes + SFB (20%) Ø Etilenoglicol (16,5%) e DMSO (16,5%) + sacarose (0,5 M)

24 Vitrificação VS1: 7,5% EG + 7,5% DMSO - 1 min VS2: 16,5% EG + 16,5% DMSO - 20 seg

25 Vitrificação

26 Vitrificação ü Reaquecimento: ü Meios: ü SM (sacarose 0,5 M): PBS+5%SFB ü Poço 1: 800 μl HM, 400 μl SM ü Poço 2: 800 μl HM, 400 μl SM 5 min ü Poço 3: 800 μl HM, 200 μl SM 5 min ü Poço 4: 800 μl HM P-1 P-2 P-3 P-4

27 Vitrificação Ø Vitrificação X Congelamento lento Ø Inconvenientes: Ø Ø Estresse osmótico Toxicidade químico de crioprotetor Ø Vantagens: Ø Ø Não precisa de um congelador programável Técnica muito rápida

28 Fatores influenciando o sucesso da técnica q Qualidade do embrião

29 Fatores influenciando o sucesso da técnica q Estádio de desenvolvimento embrionário

30 Fatores influenciando o sucesso da técnica q Raça Bos taurus x Bos indicus q Espécies zebuínas menor taxa de sobrevivência embrionária

31 q Origem do embrião Fatores influenciando o sucesso da técnica

32 Fatores influenciando o sucesso da técnica Tabela 1. Taxa de fertilidade ao parto e sobrevivência embrionária após inovulação de embriões vitrificados obtidos pela produção in vivo ou in vitro (COGNIÉ e BARIL, 2002). Parâmetro observado Ovinos In vivo In vitro Caprinos In vivo In vitro Número de receptoras Parto (%) 70 a 15 ª Sobrevivência embrionária (%) 49 b 9 b Letras diferentes na mesma coluna: P < 0,001

33 Considerações Finais Ø Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação) podem ser utilizadas para criopreservação de embriões. Ø A eficiência das duas técnicas podem variar de acordo com diversos fatores.

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