ELEN SILVIA CARVALHO SIQUEIRA PYLES CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS

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1 ELEN SILVIA CARVALHO SIQUEIRA PYLES CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS Botucatu SP 2003

2 ELEN SILVIA CARVALHO SIQUEIRA PYLES CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS Monografia apresentada à disciplina Seminários II do programa de pós-graduação em Medicina Veterinária, nível doutorado, área de concentração em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu. DOUTORANDA: Elen Silvia Carvalho Siqueira Pyles ORIENTADORA: Profa. Dra. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga PROFESSORES RESPONSÁVEIS: Profa. Dra. Maria Denise Lopes Prof. Sony Dimas Bicudo Botucatu SP 2003

3 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS...3 INTRODUÇÃO...4 REVISÃO DA LITERATURA PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO AGENTES CRIOPROTETORES PROCEDIMENTOS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS Congelação de embriões Método tradicional de congelação Aquecimento Vitrificação de embriões Técnica convencional de envasamento em palhetas de 0,25mL Método OPS Open Pulled Straw Método de vitrificação em grades de microscopia eletrônica de transmissão CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES PRODUZIDOS in vitro E EMBRIÕES MICROMANIPULDADOS...17 CONSIDERAÇÕES FINAIS...18 REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS...19

4 LISTA DE ABREVIATURAS BSA = albumina sérica bovina DMSO = dimetilsulfóxido EG = etilenoglicol ml = mililitro M = molar OPS = open pulled straw PVP = polivinilpirrolidona SFB = soro fetal bovino TE = transferência de embriões

5 INTRODUÇÃO Na década de 70, quando a transferência comercial de embriões teve seu início, a sincronização dos estros já era utilizada, porém nem sempre havia receptoras em número suficiente para efetuar as transferências. Conseqüentemente, descartavam-se os embriões excedentes ou os cultivavam à temperatura ambiente ou a 0 C, até no máximo por 24 horas (HASLER et al., 1997). Uma maneira de solucionar problemas relacionados com o armazenamento de embriões produzidos in vivo ou in vitro não transferidos é a utilização de técnicas de criopreservação de embriões. O domínio dessas técnicas torna viável a formação de bancos de embriões, promovendo a oportunidade de se preservar material genético fundamental no melhoramento genético dos plantéis, podendo ser efetuado com maior rapidez e eficiência, mesmo em pequenas populações de animais, com a possibilidade de disseminação do material genético de animais zootecnicamente superior. Assim, a criopreservação de embriões tem se tornado uma parte integrante da reprodução assistida em animais, especialmente de espécies domésticas (LEIBO et al., 1996; PALASZ & MAPLETOFT, 1996; KULESHOVA & LOPATA, 2002). A evolução da criopreservação de embriões bovinos propiciou uma série de benefícios, tais como: utilização de receptoras em cio natural; aproveitamento de receptoras excedentes ao número de embriões obtidos no dia da colheita; realização de grandes programas de descongelação e transferência de embriões (TE) em novilhas provenientes de rebanhos homogêneos quanto à genética e ao manejo (rebanhos de cruzamento industrial); planejamento do período de nascimento dos bezerros de acordo com os interesses de manejo da propriedade; formação de bancos de germoplasma, com preservação de espécies ou raças em extinção; facilidade de importação e exportação, pois os custos são menores e sem os longos períodos de quarentena, riscos de transporte e de premunição; e, segurança quanto ao aspecto higiênico sanitário. Com o advento da produção in vitro de embriões, e por estes serem mais sensíveis à criopreservação, muitos esforços têm sido empregados no sentido de se aprimorar a criopreservação dos mesmos. As pesquisas na área de criopreservação incluem estudos sobre o tempo de préequilíbrio, o tipo e a concentração do crioprotetor, a velocidade de resfriamento, a 4

6 temperatura de imersão em nitrogênio líquido, a velocidade de aquecimento e o método de remoção do crioprotetor. Apesar de muitos embriões parecerem viáveis após a criopreservação e remoção do crioprotetor, com a maioria de suas células intactas, os índices de gestação obtidos após as transferências são consideravelmente menores que aqueles obtidos com a transferência de embriões não submetidos aos processos de criopreservação (transferidos a fresco). Dessa forma, é clara a necessidade do desenvolvimento de um maior número de pesquisas envolvendo diferentes metodologias de criopreservação e de crioprotetores aplicáveis à espécie bovina. REVISÃO DA LITERATURA 1. PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO A criopreservação visa manter o metabolismo celular em estado de quiescência, tornando possível a conservação de células e tecidos por tempo indeterminado. O primeiro sucesso desta técnica foi mencionado por Whittingham (1971), utilizando embriões de camundongos. Um dos mais importantes princípios da criopreservação reside na necessidade de se remover o máximo possível de água das células antes de se proceder a sua congelação. Se esta desidratação não ocorrer, grandes cristais de gelo se formarão lesando severamente a estrutura intracelular. No entanto, a remoção demasiada de água das células também pode ser deletéria (SEIDEL Jr., 1986). Os danos causados aos tecidos durante os processos de criopreservação e aquecimento são devido principalmente a: formação de cristais de gelo intracelulares, que afetam a estrutura da célula; concentração de soluto resultante do processo de desidratação que ocorre durante a congelação tanto no meio extra como intracelular; interação entre esses dois fatores (PICKETT, 1986). A congelação provoca um aumento da pressão osmótica na célula, uma vez que a concentração total de solutos dentro e fora deve estar sempre em equilíbrio. Em resposta a esse estresse, a água sai da célula e o soluto entra. O processo cessa quando a concentração 5

7 de soluto se torna grande o bastante para prevenir futuras transformações de água em gelo (STOREY & STOREY, 1990). Como resultado dos danos causados pelos efeitos da solução, as células de mamíferos, independente do grau de desidratação, não sobrevivem a resfriamentos abaixo de -20 C, a não ser que se utilize um crioprotetor (SZELL & SHELTON, 1986). De acordo com Mazur (1970), ao submeter-se uma suspensão celular contendo crioprotetores à temperaturas ao redor de -5 C, tanto as células como o meio circundante permanecem descongelados. Isto é causado pelo super resfriamento decorrente do abaixamento do ponto de solidificação da solução provocado pela adição de substâncias crioprotetoras à suspensão celular. Entre -5 e -15 C normalmente ocorre a formação de gelo no meio extracelular, mas as células continuam descongeladas e super resfriadas, provavelmente porque a membrana plasmática impede o crescimento dos cristais de gelo em direção ao meio intracelular. A água super resfriada do interior da célula tem um potencial químico maior do que a água do meio extracelular parcialmente congelada e dessa forma a água sai da célula para se congelar externamente. Se a congelação for lenta, a célula perde água com rapidez adequada para manter em equilíbrio seu potencial químico com o da água do meio extracelular. Como resultado, a célula se desidrata e não sofre a congelação intracelular. Por outro lado, se a célula for resfriada rapidamente, ela não perde água com rapidez suficiente para manter o equilíbrio, provocando um super resfriamento e congelação intracelular, que leva à lise das membranas. O gelo intracelular resulta não da cristalização espontânea da água celular, mas sim do contato com o gelo extracelular, que cresce através dos canais aquosos na membrana. A membrana é uma barreira a passagem dos cristais de gelo à temperaturas ao redor de -10 C, mas deixa de ser uma barreira em temperaturas menores (LANDIM- ALVARENGA, 1995). Segundo Seidel Jr. (1986) os crioprotetores promovem o abaixamento do ponto de congelação do meio, conferindo um período maior para remoção da água intracelular durante o resfriamento prévio à congelação da água. Esses possuem ainda a capacidade de interagir com as membranas celulares, auxiliando-as a sobreviverem ao estresse provocado pelas mudanças físicas. Em adição, estas substâncias têm a aptidão de proteger os embriões contra as lesões causadas pela elevação das concentrações dessas soluções, no processo de formação do gelo, durante o resfriamento. 6

8 Efeitos adversos causados pela criopreservação são injúrias pelo resfriamento (MARTINO et al., 1996a) e citotoxicidade tempo-dependente do agente crioprotetor durante a exposição (VICENT & JOHNSON, 1992). Após a descongelação, a remoção do crioprotetor do interior da célula deve ser realizada de forma lenta, através da diluição desse, uma vez que a re-entrada brusca de água no meio intracelular também leva à lise das membranas (LANDIM-ALVARENGA, 1995). 2. AGENTES CRIOPROTETORES Independentemente da técnica, todos os métodos de criopreservação necessitam de crioprotetores que possuem a função de proteger as células e tecidos durante a congelação e a descongelação. Os crioprotetores são divididos em duas categorias: intracelulares (como dimetilsulfóxido - DMSO, metanol, etanol, glicerol, etilenoglicol - EG, 1,2 propanodiol, etc) e extracelulares (como lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona - PVP, rafinose, manitol, sorbitol, trealose, etc) (NIEMANN, 1991). Essas duas classes de crioprotetores são usadas separadamente ou associadas para diferentes tipos de protocolos de criopreservação (IM et al., 1997; YOUNG et al., 1998). Hanada & Nagase (1980) afirmam que as propriedades requeridas para um eficiente agente crioprotetor devem ser: baixo peso molecular, habilidade para atravessar a membrana das células vivas, alta solubilidade em soluções aquosas eletrolíticas e não ser tóxico. Em geral, quando o embrião é exposto a um crioprotetor que penetra na célula, como o glicerol, ele inicialmente se retrai devido à perda de água causada pela hiperosmolaridade inicial do meio extracelular e também porque o embrião é muito mais permeável à saída da água do que à entrada do crioprotetor. A retração do embrião irá continuar até que o afluxo de água seja balanceado com o influxo de crioprotetor. O índice de entrada do crioprotetor irá depender do coeficiente de permeabilidade deste e da temperatura da solução. Ao mesmo tempo, a água entra novamente na célula e causa um aumento gradual de volume. O equilíbrio é atingido quando o embrião retorna ao seu volume anterior quando em meio isotônico (SCHNEIDER & MAZUR, 1984). 7

9 Segundo Leibo (1984), o intervalo de tempo em que ocorre o retorno ao volume inicial atingindo-se o equilíbrio osmótico está relacionado com: espécie do embrião em questão, estágio de desenvolvimento, relação superfície/volume do embrião, características intrínsecas do crioprotetor e temperatura em que o embrião é exposto. Para o autor, estes aspectos atinentes à permeabilidade de membrana explicam, em parte, as diferenças observadas entre os vários crioprotetores quanto à eficiência. Apesar dos efeitos benéficos do crioprotetor, não existe uma técnica de criopreservação celular que permita 100% de sobrevivência após a criopreservação e aquecimento, mesmo utilizando-se curvas de resfriamento e aquecimento consideradas ótimas. Existem duas razões para justificar as falhas na ação dos crioprotetores: primeira, a toxicidade do crioprotetor limita a concentração em que este pode ser utilizado antes do resfriamento e, portanto, limita a eficácia da ação crioprotetora (FAHY, 1986). Segunda, os agentes crioprotetores podem ter uma ação direta na produção de crioinjúrias, como, por exemplo, alterando a polaridade do meio extracelular lesando as membranas (ARNOLD et al., 1983). Os crioprotetores são usualmente diluídos em solução salina tamponada (Phosphate Buffered Saline - PBS ) acrescida de 0,4% de albumina sérica bovina (BSA) ou 10% de soro fetal bovino (SFB). No entanto, para a criopreservação de embriões tem sido relatada também a diluição em meios como TCM-199 (HAMANO et al., 1992; OTOI et al., 1993; PALASZ & MAPLETOFT, 1996; PAPIS et al., 1999), H-CZB (MARTINO et al., 1996b), TCM-199/Hepes (VAJTA et al., 1998a), acrescidos de diferentes concentrações de SFB e antibióticos (OTOI et al., 1995; OTOI et al., 1998). Vajta et al. (1998a) e Papis et al. (1999) relatam o uso do meio TCM-199 acrescido de 20% de SFB para diluição de diferentes crioprotetores. O EG tem sido utilizado em diversos protocolos para a criopreservação de embriões em várias espécies, devido principalmente ao seu baixo peso molecular quando comparado a outros crioprotetores, o que proporciona rápida entrada e saída na célula durante o período de equilíbrio e rehidratação, respectivamente, o que permite a rehidratação direta após o aquecimento (VOELKEL & HU, 1992). O EG possui ainda a vantagem de ser menos tóxico do que outros crioprotetores (KASAI et al., 1990). A sacarose, embora isoladamente não seja um bom crioprotetor, foi utilizada em combinação com outros agentes. A exemplo de outros carboidratos, não atravessa a membrana celular, exercendo assim um efeito osmótico significativo. Seu efeito 8

10 crioprotetor ocorre durante a fase de rehidratação, após a congelação, na medida em que as células são submetidas à diluições sucessivas de sacarose (FRIEDLER et al., 1988). A adição de açúcares como a sacarose, dextrose e trealose aumenta a sobrevivência in vitro de blastocistos após a vitrificação (SAITO et al., 1994). Na prática, a criopreservação de embriões pelas técnicas de congelação convencional normalmente utilizam um único crioprotetor como o glicerol, EG ou propanodiol, enquanto que a vitrificação envolve o uso de misturas de crioprotetores como glicerol e EG, glicerol e propanodiol ou propanodiol e EG em combinação com sacarose, trealose ou galactose (DOBRINSKY, 2002). Os crioprotetores e a criopreservação podem provocar ruptura no citoesqueleto do embrião e para se evitar este fato, uma alternativa seria provocar a despolimerização reversível dos filamentos de actina antes da criopreservação. As citocalasinas têm sido empregadas como estabilizadores de microfilamentos para prevenir danos e estabilizar a membrana plasmática. A repolimerização dos microfilamentos ocorre naturalmente após a rehidratação (DOBRINSKY, 2002). A ação das citocalasinas é reversível se o período de incubação for curto. O tratamento das células com essas substâncias faz com que a membrana plasmática se torne mais elástica e que os microfilamentos não se rompam devido à micromanipulação (Mc GRATH & SOLTER, 1983). 3. PROCEDIMENTOS PARA A CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES Durante os últimos anos diversas técnicas de criopreservação de embriões foram desenvolvidas. As substâncias crioprotetoras vêm sendo utilizadas em diversas concentrações e combinações. Tais substâncias são adicionadas às soluções em um único passo ou paulatinamente e os embriões criopreservados com diferentes curvas de abaixamento da temperatura, sendo em alguns casos mergulhados diretamente no nitrogênio líquido a partir da temperatura ambiente. Da mesma maneira, a temperatura de aquecimento tem variado de 20 a 37 C em banho-maria ou ao ar e a retirada do crioprotetor realizada em um ou mais passos (LANDIM-ALVARENGA, 1995). 9

11 3.1 Congelação de embriões Com relação aos avanços obtidos na criobiologia nos últimos anos, muito poucos protocolos de congelação de embriões têm sido colocados na prática. A maioria dos embriões é congelada pelo método tradicional (PALASZ & MAPLETOFT, 1996). Para a realização da congelação de embriões existe a necessidade da utilização de uma máquina eletronicamente programável para monitorar a temperatura da curva de resfriamento antes que as palhetas contendo os embriões sejam imergidas no nitrogênio líquido. Vários tipos de máquinas são completamente automatizados e capazes de obter padrões controlados de criopreservação com ou sem nitrogênio líquido (HAFEZ, 1980). Leibo & Mazur (1978) e Palasz & Mapletoft (1996) mostraram a importância da indução da cristalização do meio extracelular ( seeding ) antecedendo a congelação do meio contendo os embriões, proporcionando as condições necessárias para uma retirada lenta de água do meio intracelular através da formação de gelo no espaço extracelular. Os autores fazem algumas observações sobre o procedimento de seeding que devem ser consideradas: o instrumento a ser usado para efetuar a indução da cristalização deve ter temperatura abaixo da temperatura da amostra. Não é desejável empregar instrumentos muito grandes para proceder indução da cristalização de amostras desproporcionalmente menores, pois a massa relativa de um instrumento muito maior resfria as amostras por temperaturas muito baixas. Os embriões são lesados caso haja neste momento congelação intracelular. Instrumentos muito pequenos também não são desejáveis, por se aquecerem rapidamente após serem retirados do nitrogênio líquido. A indução da cristalização deve ser feita em locais onde preferencialmente não estejam os embriões, como no menisco superior da coluna central da palheta Método tradicional de congelação Denominou-se curva clássica de congelação os procedimentos descritos por Whittinghan (1980) para conservação de embriões mamíferos em baixas temperaturas: 1) equilíbrio no crioprotetor; 2) envase; 3) colocação das palhetas no aparelho congelador; 4) seeding ; 5) resfriamento de -0,3 a -0,5 C por minuto até -32 C; 6) imersão e conservação no nitrogênio líquido; 7) descongelação; 8) remoção do crioprotetor. 10

12 Os procedimentos adotados por Niemann (1991) para congelação de embriões bovinos foram: 1) adição de 1,4M glicerol feita em única etapa à temperatura ambiente, com período de equilíbrio de 20 minutos; 2) envase dos embriões em palhetas de 0,25mL, com três colunas de meio, separadas por duas colunas de ar, estando o embrião na coluna central; 3) transferência das amostras para o banho de álcool, à temperatura de -7ºC, realizando-se o seeding ; 4) após 5 minutos da indução da cristalização, a temperatura foi decrescida à 0,3 C por minuto, até atingir -28 C; 5) de -28 C à -35 C, a taxa de resfriamento foi de -0,1 C por minuto, sendo as palhetas mergulhadas em nitrogênio líquido. Porém, Schneider & Mazur (1984) demonstraram uma adequada curva de resfriamento no processo de congelação de embriões bovinos que propicia uma eficiente remoção da água intracelular, assim descrita: 1) após a adição do crioprotetor e envase, as amostras devem ser transferidas para o recipiente do congelador previamente resfriado à temperatura próxima de -5 C para soluções a 1M glicerol e -7 C, para soluções a 1,5M; 2) as amostras devem ser equilibradas à temperatura do seeding por 5 a 10 minutos; 3) deve ser realizado o seeding ; 4) a temperatura do seeding deve ser mantida por mais 10 minutos, para permitir equilíbrio da solução, inicialmente cristalizada; 5) as taxas de resfriamento devem estar entre -0,3 a -0,5 C por minuto até atingir temperaturas entre -30 a -40 C. É aconselhado manter as amostras no equipamento de congelação por 15 a 30 minutos antes de imergi-las em nitrogênio líquido (-196ºC), quando adotadas elevadas taxas de resfriamento Descongelação A sobrevivência dos embriões à descongelação depende da específica combinação do regime de resfriamento e taxas de descongelação. Embriões congelados sob taxas de resfriamento lentas (exemplo: -0,1 C/min) e imersão em nitrogênio às baixas temperaturas (exemplo: -60 a -110 C), requerem procedimentos de descongelação lentos (exemplo: 10 C/min). Entretanto, a maioria dos processos de congelação é realizada às taxas de resfriamento entre -0,1 a -0,5 C/min e imersão das amostras em nitrogênio líquido às temperaturas entre -25 e -40 C (TAKEDA et al., 1984). 11

13 A diluição do crioprotetor tem como função evitar a entrada muito rápida da água na célula, pois uma redução muito drástica na osmolaridade levaria à lise celular, de acordo com Schneider & Mazur (1984). Com a introdução da sacarose nos procedimentos de diluição de substâncias crioprotetoras intracelulares, as técnicas tornaram-se mais rápidas e seguras, pois a sacarose atua como um tampão osmótico, mantendo constante a concentração do meio extracelular, regulando a velocidade de entrada da água e saída do crioprotetor do embrião, evitando o choque osmótico. Somente após o emprego da sacarose e das palhetas francesas foi possível realizar o método one-step de descongelação (NIEMANN, 1991). Este método permite a transferência direta dos embriões para as receptoras na mesma palheta no qual foram congelados. Isto simplificou significativamente a tecnologia de TE, reduzindo o tempo requerido para preparar os embriões para serem transferidos e eliminando a necessidade de equipamentos especiais (PALASZ & MAPLETOFT, 1996). Estes pesquisadores relataram que 5000 embriões bovinos foram congelados e transferidos por este método e as taxas de gestação foram superiores a 55%, não diferindo de valores observados para embriões nos quais foi realizada a remoção dos crioprotetores antes da transferência. Segundo Niemann (1991), a metodologia one-step oferece vantagens significativas quando embriões são enviados para regiões desprovidas de estrutura laboratorial para realizar manipulação dos mesmos. As taxas de gestação alcançadas por este método, foram de 30 a 50%, podendo ser a principal causa dessas diferenças as variações individuais ocorridas sobre as soluções que são homogeneizadas no interior da própria palheta. Para evitar essas variações, Massip et al. (1987) desenvolveram nova técnica, com adaptações dos métodos one-step de diluição do crioprotetor, adicionandose 0,25M de sacarose à solução de 1,36M de glicerol em PBS. A adição da mistura crioprotetora foi efetuada em única etapa, adotando-se período de equilíbrio de 10 minutos, sendo realizado o seeding à temperatura de -7 C. A taxa de resfriamento foi de -0,3 C/min até a temperatura de -25 ou -35 C, quando as palhetas foram imersas em nitrogênio líquido. A descongelação das mesmas ocorreu em banho-maria à 20 C, obtendo-se taxa de gestação de 50% (5/10). A grande vantagem dessa metodologia foi de possibilitar a inovulação imediatamente após a descongelação, sem a necessidade de homogeneizar as colunas da palheta e nem aguardar o período de equilíbrio da solução ao 12

14 embrião, uma vez que na composição da própria solução para congelação (glicerol a 1,36M) dos embriões havia 0,25M de sacarose. As taxas de sobrevivência após a descongelação apresentaram variações segundo a qualidade pré-congelação de embriões bovinos, em experimento delineado por Kennedy (1986). As taxas de sobrevivência pós-descongelação para embriões classificados como grau 1, 2 e 3 foram, respectivamente, 100% (11/11), 86% (24/28) e 83% (20/24) e os índices de desenvolvimento in vitro 91% (10/11), 50% (14/28) e 29% (7/24). Os autores concluíram que elevados índices de sobrevivência somente seriam possíveis selecionandose rigorosamente, através da morfologia, os zigotos para congelação. 3.2 Vitrificação de embriões A vitrificação pode ser definida segundo Fahy (1986) como sendo a solidificação de um líquido, não pela cristalização, mas pela extrema elevação da viscosidade durante o processo de resfriamento. Dobrinsky (2002) e Kuleshova & Lopata (2002) afirmam que este processo provoca solidificação das células evitando completamente a formação de cristais de gelo tanto durante o resfriamento como no aquecimento e que, se realizada corretamente, evita a formação de cristais de gelo intra e extracelular. Este é um protocolo de criopreservação baseado na desidratação do embrião através da sua breve exposição à soluções com altas concentrações de crioprotetores seguida da imersão direta em nitrogênio líquido. Devido a estas altas concentrações de crioprotetores e à rápida curva de congelamento o sistema se solidifica sem que ocorra cristalização (MARTINO et al., 1996b). A vitrificação é uma técnica promissora na reprodução assistida, sendo um procedimento simples, menos oneroso e que requer menos tempo do que os métodos de congelação (DOBRINSKY, 2002; KULESHOVA & LOPATA, 2002). Comparando as duas técnicas, a congelação tradicional é uma tentativa de manutenção do equilíbrio entre danos osmóticos e tóxicos utilizando baixas concentrações de crioprotetores e controlando a formação de gelo através da congelação do meio extracelular e desidratação do embrião. Em contraste, a estratégia de vitrificação é mais radical, pois é baseada na eliminação total da formação de gelo. Porém, as altas concentrações de crioprotetores aumentam os danos osmóticos e tóxicos. Por outro lado, a 13

15 alta velocidade de resfriamento e aquecimento resulta em uma rápida passagem através da temperatura perigosa ao redor de 0ºC, o que minimiza os danos causados pelo resfriamento que prejudica predominantemente estruturas ricas em lipídeos (VAJTA, 1997). As soluções de vitrificação, assim como as soluções usadas para a congelação, contêm um crioprotetor, vários sais e usualmente uma ou mais macromoléculas. As macromoléculas agem para modificar os crioprotetores durante o processo de vitrificação. A adição de polietilenoglicol como uma macromolécula aumenta a viscosidade da solução de vitrificação contendo EG. Outras macromoléculas comumente usadas incluem o Ficoll, a PVP e o dextran. Um crioprotetor não permeável comum é a sacarose, a qual exerce um significativo efeito osmótico e assim, muitas vezes, é empregada na diluição ou rehidratação de embriões após o aquecimento (O NEIL et al., 1997). Para protocolos de vitrificação, o EG em associação com outros crioprotetores não permeáveis tem se tornado a solução mais comumente utilizada (HOCHI et al., 1996; MARTINO et al., 1996a e b). Utilizando mistura de 20% de 1,2 propanodiol e 25% de glicerol, Massip et al. (1987) vitrificaram mórulas e blastocistos de bovinos em fase bastante precoce. O resultado de gestação atingido foi de 39,1%. Mahmoudzadeh et al. (1993) comunicaram o método de adição de soluções de vitrificação em única etapa em mórulas e blastocistos iniciais, observando que a melhor solução de vitrificação era composta de EG a 7,15M e sacarose a 0,3M, enquanto que Ishimori et al. (1993) relataram o uso da mistura das soluções de DMSO e EG para a vitrificação de embriões bovinos. A taxa de gestação de mórulas e blastocistos iniciais foi de 38% e para blastocistos de 40% Técnica convencional de envasamento em palhetas de 0,25ml Esse método de vitrificação utiliza palhetas francesas de inseminação de 0,25mL para abrigar os embriões. Contudo, essas palhetas limitam o padrão máximo de congelação e aquecimento a 2000ºC/min (VAJTA et al., 1998a). De acordo com Martino et al. (1996b), as palhetas francesas de 0,25mL são parcialmente preenchidas com uma coluna de 200µL solução de vitrificação seguida de 20µL de meio contendo os embriões e 25µL de solução de vitrificação. As colunas de meio são separadas por colunas de ar com aproximadamente 8mm de comprimento. Após serem seladas, as palhetas são imersas em nitrogênio líquido. Para prevenir rachaduras, pode-se 14

16 primeiro colocar a extremidade da palheta no nitrogênio líquido e após poucos segundos a sua totalidade. O tempo transcorrido desde o início da exposição aos agentes crioprotetores até a imersão da palheta em nitrogênio líquido é de 30 segundos. No aquecimento as palhetas são colocadas em banho-maria a 37ºC por 15 segundos e imediatamente agitadas vigorosamente para misturar as colunas de fluido entre si. O conteúdo é expelido e os embriões transferidos para a solução de vitrificação em dois passos: o primeiro, em meio mais concentrado por 1 minuto e, o segundo, em meio mais diluído durante 5 minutos. Para remoção completa dos agentes crioprotetores os embriões são lavados duas vezes em H-TCM %SFB (MARTINO et al., 1996b) Método OPS Open Pulled Straw A técnica chamada Open Pulled Straw (OPS) foi desenvolvida por Vajta et al. (1997a), originalmente desenvolvida para embriões de bovinos e de porcos. Nesta técnica, os tampões de algodão das palhetas francesas de inseminação de 0,25mL são removidos e estas são amolecidas por aquecimento em sua região central e esticadas manualmente até que o diâmetro interno e a espessura da parede diminuam para aproximadamente metade do tamanho original. As palhetas são subseqüentemente resfriadas em ar e cortadas em duas na extremidade estreita. O envasamento dos embriões é realizado utilizando o efeito capilar simples. Cerca de 1 a 2µL do meio de vitrificação contendo o embrião é introduzido na extremidade estreita da palheta, a qual é imediatamente submersa no nitrogênio líquido. A coluna líquida solidifica-se imediatamente, sem que haja a dispersão da solução, o que é comum quando são utilizadas palhetas de tamanho original (VAJTA et al., 1998a). O aquecimento é realizado pela colocação da ponta aberta diretamente na placa contendo o meio aquecido. O meio vitrificado volta ao estado líquido dentro de 1 a 2 segundos. Imediatamente após, o embrião flutua no meio de aquecimento (VAJTA et al., 1998a). Neste método a taxa de resfriamento é de 20000ºC/min (KULESHOVA & LOPATA, 2002). As razões para a diferença nas taxas de resfriamento entre este método e o convencional (palhetas de 0,25mL) são a redução do volume das soluções, o contato direto entre a solução e o material resfriado ou aquecido e a diminuição da espessura da parede (aproximadamente 0,07mm e 0,15mm para a palheta estendida e original, 15

17 respectivamente). As conseqüências dessas diferenças foram altamente benéficas para a criopreservação de embriões. Os altos padrões de resfriamento e aquecimento resultaram em diminuição de danos causados pelo resfriamento. Adicionalmente, o alto padrão de mudanças de temperatura permite o uso de uma concentração menor de crioprotetores o que, junto com o rápido envase e liberação das estruturas, minimiza as injúrias tóxicas e osmóticas. Além disso, o manejo e armazenamento das palhetas são simples, fáceis e não requerem equipamentos especiais (VAJTA et al., 1998a). A única desvantagem do método OPS é o risco de contaminação, pois o meio possuindo os embriões fica diretamente em contato com o nitrogênio líquido. Porém, esse risco também está presente usando-se palhetas originais, pois a superfície externa a qual é ocasionalmente submersa no meio de diluição é considerado contaminado, podendo carrear patógenos para o interior da palheta. O risco pode ser diminuído filtrando-se o nitrogênio líquido comercialmente produzido através de um filtro de 0,2µL e acondicionado-se a OPS dentro de palhetas de 0,5mL pré-resfriadas, fechando-se ambas as pontas (VAJTA et al., 1998b; KULESHOVA & LOPATA, 2002) Método de vitrificação em grades de microscopia eletrônica de transmissão Martino et al. (1996b) desenvolveram um método de criopreservação utilizando grades de microscopia eletrônica de transmissão como suporte físico para os embriões, as quais são imediatamente submersas em nitrogênio líquido, na tentativa de obter uma curva de resfriamento super rápida. Com o procedimento da congelação ultra-rápida a velocidade de congelação é maior do que 20000ºC/min. O método consiste em manter os embriões em pequeno volume de crioprotetor e colocá-los quase que em contato direto com o nitrogênio líquido, criopreservando-os em grades de microscopia eletrônica, sendo os embriões e os crioprotetores mergulhados diretamente no nitrogênio líquido (MARTINO et al., 1996b; VAJTA et al., 1998a; PAPIS et al., 1999). São utilizadas grades (de cobre) de microscopia eletrônica (3,05mm de diâmetro) para obter padrões de congelação muito altos. Os embriões são expostos à solução crioprotetora e com o auxílio de uma delicada pipeta eles são então transferidos sobre o topo da grade em um volume muito pequeno (1µL). Para favorecer a redução do volume, o lado inferior da grade é colocado sobre um papel filtro para retirar o excesso de meio, 16

18 restando apenas os embriões expostos na parte superior. A grade é manuseada com uma pinça de dissecação e imediatamente imergida no nitrogênio líquido. O tempo transcorrido desde o início da exposição aos crioprotetores até a colocação das grades no nitrogênio líquido é de 30 segundos (MARTINO et al., 1996b). 4. CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES PRODUZIDOS in vitro E EMBRIÕES MICROMANIPULADOS Muitas pesquisas têm sido realizadas para a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro, pois estes são mais sensíveis à criopreservação e tem as taxas de gestação significativamente menores após a transferência quando comparado com os embriões produzidos in vivo também criopreservados (DOBRISNKY, 2002). Nos últimos anos, várias tentativas têm sido feitas para aumentar as taxas de sobrevivência desses embriões após a criopreservação. Duas linhas de pesquisa têm sido seguidas: a) modificações nos sistemas de cultivo in vitro para melhorar o meio embrionário para que os embriões possam resistir melhor às condições do processo de criopreservação; b) desenvolvimento de uma técnica de criopreservação específica adaptada para embriões produzidos in vitro (MARTÍNEZ et al., 2002). Khurana & Niemann (2000) relatam gestações e nascimentos de bezerros provenientes de transferência de embriões produzidos in vitro congelados e aquecidos. Porém, as taxas de gestação são inconsistentes e invariavelmente menores do que aquelas reportadas para embriões produzidos in vivo. Isto pode estar relacionado com algumas diferenças na morfologia, ultra-estrutura e metabolismo entre os embriões provenientes das duas técnicas. Existe um consenso geral de que a qualidade dos embriões produzidos in vitro é inferior àquela dos embriões produzidos in vivo e que isto, juntamente com outros fatores, poderia ser responsável pela pobre sobrevivência destes embriões após a criopreservação. Os autores afirmam que os embriões produzidos in vitro são mais sensíveis às crioinjúrias e que esta sensibilidade é afetada pela qualidade do embrião. Segundo Hasler et al. (1997) e Dobrinsky (2002), as taxas de sobrevivência dos embriões produzidos in vitro após criopreservação são afetadas também pela idade do embrião, estágio de desenvolvimento embrionário, qualidade do embrião, crioprotetor, ph do meio de criopreservação, método de criopreservação e sistema de cultivo no qual os 17

19 embriões são produzidos. Siqueira-Pyles et al. (2002) produziram embriões in vitro em diferentes meios de cultivo e Fernandes et al. (2002) os vitrificaram e avaliaram a sua viabilidade podendo observar que o meio composto por aminoácidos e BSA desde o início, associado a SFB no terceiro dia de cultivo produz altas taxas de produção de blastocistos (159/312, 51%), porém não promove diferença estatística nas taxas de viabilidade, concluindo que o meio de cultivo pode aumentar a quantidade de blastocistos produzidos sem contudo, melhorar a qualidade embrionária. O método OPS tem sido aplicado para criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro a diferentes estágios de desenvolvimento (VAJTA, 1997; VAJTA et al., 1997a e b; VAJTA et al., 1998a). Os resultados nas taxas de re-expansão de embriões vitrificados no dia 6 (blastocistos iniciais e blastocistos) e no dia 7 (blastocistos eclodidos) foram 90, 97 e 81%, respectivamente (VAJTA et al., 1998b). Esses resultados podem ser considerados como um avanço significativo na criopreservação de embriões bovinos, porém nem a curva lenta de congelação e nem os métodos de vitrificação se mostraram adequados até o momento para obtenção de padrões desejáveis de sobrevivência de embriões bovinos em estágio de pré-compactação produzidos tanto in vivo como in vitro (LEIBO et al., 1996). Martínez et al. (2002) afirmam que a vitrificação pode ser utilizada com sucesso na criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro e que essa técnica pode ser considerada inclusive para utilização em programas comerciais. Segundo Palasz & Mapletoft (1996), os embriões micromanipulados são mais sensíveis à criopreservação devido aos danos que ocorrem em suas células e à zona pelúcida decorrentes da micromanipulação. Por exemplo, embriões bipartidos resultam em perda de 10% de suas células e uma proporção similar de células geralmente são danificadas durante a criopreservação. CONSIDERAÇÕES FINAIS O grau de aproveitamento dos embriões criopreservados e aquecidos depende de técnicas de tratamento que não produzam danos que os inviabilizem. Verifica-se, no entanto, que quando o manejo requer que os embriões bovinos sejam criopreservados antes 18

20 da transferência para as receptoras, as técnicas correntes de criopreservação sempre causam perdas de viabilidade. É necessário que sejam desenvolvidos protocolos específicos que resultem em boa preservação de embriões, os quais possam minimizar os danos causados aos embriões em decorrência do processo de criopreservação e, conseqüentemente, maximizar a sua viabilidade pós-aquecimento. A produção in vitro de embriões bovinos a partir de ovócitos imaturos tem se tornado um procedimento de rotina para pesquisas em transgênese, clonagem e outras áreas da biologia reprodutiva. Esta técnica tem crescido consideravelmente em aplicações comerciais em programas de criação de bovinos. Para que possa haver maior flexibilidade para uma utilização eficiente e mais difundida desta tecnologia é essencial que os embriões possam ser estocados de forma eficaz em nitrogênio líquido. O desenvolvimento de tecnologias de criopreservação de embriões revolucionou a criação de bovinos. Embora a criopreservação possa aumentar a utilização de tecnologias de produção in vitro de embriões ou de micromanipulação de embriões, a sobrevivência dos embriões produzidos in vitro à criopreservação ainda é menor que dos embriões produzidos in vivo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARNOLD, K., PRATSCH, L., GAWRIS, H.K. Effect of poly (ethylene glycol) in phospholipid hydration and polarity of the external phase. Biochem Biophys Acta, v.782, p , DOBRINSKY J.R. Advancements in cryopreservation of domestic animal embryos. Theriogenology, v.57, p , FAHY, G.M. The relevance of cryoprotectant toxicity to cryobiology. Cryobiology, v.23, p.1-13, FERNANDES C.B., SIQUEIRA-PYLES E.S.C., LANDIM-ALVARENGA. Viabilidade pós vitrificação de embriões bovinos cultivados em diferentes meios. Rev. Bras. Reprod. Anim., v.26, p , FRIEDLER S., GIUDICE L.C., LAMB E.J. Cryopreservation of embryos and ova. Fertil. Steril.., v.49, p , HAFEZ, E.S.E. Reproduction in farm animals. 4 th edition. Lea & Febiger. Philadelphia,

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