Técnicas de Reprodução Assistida

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1 Manipulação da Fertilidade Técnicas de Reprodução Assistida Juliana, nº19 Elisa, nº20 Tânia, nº26 12ºA

2 Técnicas complementares 1. Indução da ovulação Geralmente, antes de realizar qualquer processo de reprodução assistida, fazse uma indução controlada da ovulação na mulher, que é uma etapa determinante no processo. A indução da ovulação, tal como o nome indica, estimula a produção de oócitos II, aumentando, assim, as hipóteses de ocorrer fecundação. Normalmente, são usados medicamentos que actuam sobre o complexo hipotálamo-hipófise. Acontece o seguinte: o hipotálamo é estimulado a produzir uma maior quantidade de hormona GnRH, que, por sua vez, estimula o lobo anterior da hipófise a produzir maior quantidade da hormona FSH (hormona folículo-estimulina); esta actua sobre os ovários, estimulando o crescimento dos folículos. Durante um ciclo ovárico, ou seja, todos os meses, seleccionam-se vários folículos cerca de 10 mas apenas um consegue alcançar o estado de folículo maduro ou de Graaf, pelo que os restantes folículos degeneram. O objectivo da indução da ovulação é produzir o maior número possível de oócitos nos dois ovários da mulher. Por isso, quando os ovários são estimulados, há produção de mais folículos e consegue-se evitar que muitos deles atrofiem, pelo que é produzido um maior número de oócitos II. Como são produzidos muitos oócitos, é muito frequente nestas técnicas de reprodução assistida nascerem gémeos. Contudo, a estimulação dos ovários não deve ser exagerada, de modo a não ocorrer uma hiperestimulação e, consequentemente, gravidez múltipla. Este controlo é feito através de ecografias transvaginais ou por administração de certas hormonas. 2. Recolha de gâmetas A recolha de gâmetas é uma tarefa muito delicada e requer uma série de procedimentos. Poderá ser feita por dois processos: Aspiração transvaginal Primeiro, é necessário fazer uma limpeza à vagina. Em seguida, é introduzida uma agulha maleável, que está ligada a um tubo de ensaio e a um aspirador, que irá até a um dos ovários, de modo a recolher os oócitos II presentes nos folículos maduros. Recolha dos oócitos II.

3 Laparoscopia É feita uma pequena incisão no umbigo e é introduzido um telescópio fino (laparoscópio), que é um instrumento de fibra óptica, que permite observar os órgãos abdominais, nomeadamente as trompas de Falópio, os ovários ou os testículos, no caso do homem. Esta técnica permite recolher os gâmetas: no caso da mulher, a observação dos ovários permite retirar os oócitos II e, no homem, permite retirar os espermatozóides dos testículos. Laparoscopia.

4 Técnicas de Reprodução Assistida 1. Inseminação Artificial ou IUI (Intra-Uterine Insemination) Em que circunstâncias é utilizada esta técnica? Casos de incapacidade de ejaculação; Distúrbios de ovulação; Alteração no muco cervical, que dificultem ou impeçam a livre penetração dos espermatozóides no útero; Alterações na qualidade do sémen; Alterações nas trompas; Endometriose. Procedimento: 1ªParte É recolhido sémen, obtido por masturbação do parceiro ou recorrendo a um banco de esperma, onde há esperma de terceiros que foi previamente congelado e armazenado. 2ª Parte Realiza-se um tratamento e selecção dos espermatozóides, os quais são avaliados em termos de qualidade, segurança e quantidade. Através de centrifugação, os espermatozóides são separados do líquido seminal. Porque é que se faz isto? Numa situação normal, o líquido seminal é essencial para o transporte dos espermatozóides ao longo da vagina. Neste caso, como os espermatozóides são colocados acima do colo do útero, o líquido seminal deixa de ser necessário, sendo substituído por um meio de cultura adequado. São apenas seleccionados os espermatozóides viáveis, em óptimas condições de locomoção. São exigidos, no mínimo, 5 milhões de espermatozóides, no final da selecção em laboratório. 3ª Parte Conhecido o local onde é mais provável encontrar o oócito II e qual das trompas se encontra desimpedida, devido a exames realizados previamente, é introduzido, através da vagina, um cateter muito fino, que contém os espermatozóides seleccionados.

5 Inseminação artificial. 4ª Parte A paciente fica em posição ginecológica e o médico coloca um espéculo (aparelho utilizado para exames ginecológicos) na vagina. Após desinfecção do orifício do colo do útero, é introduzido um cateter até ao interior do útero, que injecta o concentrado de espermatozóide previamente seleccionado. Inseminação artificial. 5ª Parte Assim, os espermatozóides são transferidos, de forma mecânica, para a cavidade uterina, sendo deixados o mais próximo possível do local onde se encontra o oócito II. Este processo é indolor, pelo que não requer qualquer tipo de anestesia ou internamento. Só os mais rápidos conseguem alcançar o oócito II e apenas um consegue penetrar o oócito II fecundação. Contudo, nem sempre o processo é bem sucedido e, muitas vezes, não há fecundação e a mulher não consegue engravidar. Fecundação.

6 Notas: Existe ainda outra modalidade que consiste na introdução dos espermatozóides no cérvix (inseminação intra-cervical). A fertilização, neste caso, é in vivo, dentro das trompas de Falópio. Neste processo não é necessário repouso para além dos 30 minutos que se seguem à inseminação ou modificação da vida pessoal. As hipóteses de sucesso desta técnica são de aproximadamente 18 a 20%. Como os espermatozóides são injectados depois do colo do útero, esta técnica permite ainda aumentar o número de espermatozóides móveis que entram na cavidade uterina e, consequentemente, atingir o terço distal da trompa de Falópio (local da fecundação), facilitando o encontro do óvulo com o espermatozóide.

7 2. Fertilização in Vitro (In Vitro Fetilization) Esta técnica é também conhecida por bebé-proveta, pelo facto da fecundação ocorrer fora do corpo da mulher, sendo este um dos processos que mais contribuiu para o tratamento da fertilidade. Quando deve ser utilizada? Este processo deverá ser utilizado: Quando há uma lesão nas trompas de Falópio; Quando a mulher engravida, mas é uma gravidez etópica (que ocorre fora do pavilhão da trompa e que é falível); Quando a mulher sofreu uma laqueação das trompas de Falópio irreversível, ou quando houve a remoção destas; Infertilidade masculina (espermatozóides mutáveis); Infertilidade sem causa aparente; Endometriose. Procedimento: 1ª Parte Indução da ovulação Consiste na produção do maior número possível de oócitos II hiperovulação. Este processo é acompanhado por outro processo, a estimulação. A estimulação consiste na administração de medicamentos, de modo a que estes estimulem a hipófise para que seja sintetizada a hormona FSH, responsável pelo desenvolvimento e amadurecimento dos folículos ováricos. Assim, com a estimulação dos ovários, vai ser possível obter inúmeros oócitos II. Estes processos são monitorizados através de ecografias transvaginais que vão acompanhar o processo de crescimento dos folículos. 2ª Parte Recolha de gâmetas É uma tarefa muito delicada e requer uma série de procedimentos. Poderá ser feita por dois processos: Aspiração transvaginal Laparoscopia

8 3ª Parte Regulação do desenvolvimento do endométrio Após a recolha dos gâmetas femininos, o corpo amarelo poderá não criar progesterona suficiente. Neste caso, será administrado progesterona de modo a que o endométrio uterino se desenvolva o suficiente para aceitar o embrião que, posteriormente, será libertado no útero. Há também casos em que ocorre aspiração folicular. Neste caso, a mulher tem de ingerir hormonas a base de progesterona, visto que não há formação de corpos amarelos devido à extracção dos folículos e, consequentemente, se não houver administração de progesterona, não haverá desenvolvimento do útero, sendo este processo essencial para a implantação do embrião. Hormonas. 4ª Parte Recolha de espermatozóides e sua selecção A colheita de espermatozóides, normalmente é obtida por masturbação. No caso de o homem não conseguir ejacular, é utilizado o processo de laparoscopia que permite retirar os espermatozóides dos epidídimos. Posteriormente, são escolhidos os espermatozóides mais resistentes, ou seja, os que têm mais mobilidade e capacidade para fecundarem, através do processo de centrifugação. Centrifugação dos espermatozóides.

9 5ª Parte Fecundação A fecundação ocorre em laboratório, numa caixa de Petri, sendo assim, em ambiente extracorporal mas parecido com o ambiente dentro das Trompas de Falópio. Normalmente, os espermatozóides são colocados juntos dos oócitos II e, de forma natural, um dos espermatozóides irá fecundar o oócito II. Em casos mais complicados, o espermatozóide é introduzido dentro do oócito. Fecundação in vitro: trabalho em laboratório. 6ª Parte Observação do desenvolvimento embrionário e colocação no útero Após a fecundação, os embriões vão estar sobre vigia laboratorial, de modo a observar se o desenvolvimento embrionário ocorre de forma natural, ou seja, se há presença de dois pró-núcleos. Caso haja um ou mais do que dois pró-nucleos, os embriões serão eliminados, visto que ocorreu uma mutação genética. Fertilização normal Fertilização Anormal Fertilização Anormal 2 pró-núcleos 1 pró-núcleo 3 pró-núcleos Os embriões que foram seleccionados são mantidos no mesmo meio de cultura em que ocorreu a fecundação durante dois dias, até que ocorra uma divisão do embrião em 6-8 células.

10 Após o tempo de incubação dos embriões anteriormente seleccionados, é escolhido o melhor embrião para que seja transferido para o útero da mulher. Esta transferência não provoca dores, visto que apenas é introduzido um cateter maleável que contém embriões, dentro do útero. Transferência de embriões para o útero. Há casos em que é transferido mais do que um embrião de modo a aumentar a fiabilidade da implantação e gravidez, havendo o risco de nascerem gémeos falsos. Por fim, todos os embriões de boa qualidade que sobram são preservados, por congelação ou vitrificação, podendo ser utilizados no futuro. Último Passo Cerca de duas semanas após a transferência embrionária, é realizado um teste de gravidez de modo a verificar se ocorreu ou não a implantação do embrião na parede uterina, ou seja, se há ou não uma gravidez em curso. Curiosidade: Caso ocorra gravidez, aparecem duas barras vermelhas; quando o teste dá negativo, apenas aparece uma barra. Teste de gravidez.

11 Notas: Caso a mulher ou o homem forem estéreis, é possível obter um gâmeta sexual num banco dador. A taxa de sucesso varia entre os 20 e 35% em mulheres até aos 35 anos. A partir dos 40 anos, a taxa de gravidez já é de 15%. Procedimento no processo de Fertilização in vitro.

12 3. Injecção intra-citoplasmática de espermatozóides ou ICSI ( Intra Cyto- plasmatic Sperm Injection) Nos últimos anos, esta técnica tem vindo a substituir a fertilização in vitro, uma vez que tem um êxito, em média, de 50% nas mulheres até aos 35 anos. Consiste na escolha do espermatozóide a usar e a sua microinjecção directamente no citoplasma de um oócito. Esta técnica deverá ser utilizada quando: Nenhuns ou poucos espermatozóides são ejaculados; Os espermatozóides apresentam baixa mobilidade; O homem tem obstrução ou vasectomia (consiste no corte dos canais deferentes, de forma a impedir que os espermatozóides passem para a uretra); Há um número significativo de espermatozóides mutantes. Espermatozóides mutantes. Procedimento: 1ª Parte Recolha de gâmetas A recolha dos gâmetas femininos é efectuada como na fertilização in vitro. A recolha dos gâmetas masculinos é efectuada através de uma cirurgia aos testículos.

13 2ª Parte Injecção do espermatozóide dentro do oócito II Este processo é realizado em ambiente extracorporal, como na fertilização in vitro. O oócito é colocado numa caixa de Petri e, em seguida, a fecundação ocorre com a ajuda de duas micropipetas (mais finas que um fio de cabelo) em que, uma segura no oócito e a outra pega no espermatozóide, imobiliza-lo e injecta-o no citoplasma do oócito. Imobilização do espermatozóide Colocação do espermatozóide na micropipeta de injecção pela cauda Início da injecção do espermatozóide (no interior da micropipeta) no oócito Micropipeta que contem o espermatozóide, totalmente dentro do oócito Injecção do espermatozóide no citoplasma do oócito e retirada da micropipeta

14 3ª Parte Observação do desenvolvimento embrionário e sua colocação no útero Através do microscópio é verificado se há a presença dos dois pró-núcleos. Após esta observação e, caso não haja anomalias, os embriões são incubados durante 72horas. Ao fim desse tempo, os embriões são seleccionados e, posteriormente, serão colocados no útero da mulher do mesmo modo que ocorre na fertilização in vitro. Transferência de embriões para o útero.

15 4. Transferência intratubárica de gâmetas ou GIFT (Gamete Intrafallopian Transfer) A GIFT é indicada para casos em que: A infertilidade deriva de disfunções do esperma; Não é conhecida a causa de infertilidade; O muco cervical apresenta anomalias; Existe endometriose. Procedimento: 1ª Parte Nesta técnica, os gâmetas masculino e feminino são obtidos utilizando as mesmas técnicas que na fertilização in vitro e na ICSI, ou seja, a mulher é sujeita a uma estimulação da produção de folículos ováricos e, em seguida, obtêm-se os oócitos por aspiração transvaginal ou por laparoscopia e os espermatozóides por masturbação ou laparoscopia. 2ª Parte Depois de uma selecção em laboratório, os oócitos e os espermatozóides que apresentam as melhores condições são transferidos para o interior das trompas de Falópio, através de laparoscopia. Se tudo correr bem, os espermatozóides penetram num ou mais oócitos II, formando-se um ou mais embriões. O embrião descerá até ao útero, onde se irá fixar. Por isso, nesta situação, diz-se que a fecundação é in vivo, pois todo o processo de concepção ocorre integralmente no corpo da mulher. Depois da transferência, a paciente apenas terá de esperar algumas horas até ir para casa. Colocação dos gâmetas nas trompas de Falópio por laparoscopia.

16 Nota: A GIFT tem uma taxa de sucesso relativamente baixa, da ordem dos 25 a 35%. Contudo, cerca de um terço das gravidezes são múltiplas, ou seja, há concepção de gémeos. Este facto explica-se pelo facto de, para garantir alguma margem de sucesso, no mesmo tratamento, são recolhidos e introduzidos na mulher vários oócitos II.

17 5. Transferência intratubárica de zigotos ou ZIFT (Zygote Intrafallopian Transfer) A ZIFT surgiu depois da técnica GIFT, sendo uma variante desta. Procedimento: Nesta técnica, os oócitos II e os espermatozóides são recolhidos e seleccionados através das técnicas citadas anteriormente e, seguidamente, são colocados em contacto in vitro, num meio de cultura adequado, durante 18 a 24 horas. Depois de ocorrer fecundação, por laparoscopia, um ou mais zigotos são transferidos para as trompas de Falópio. Introdução de embriões, por laparoscopia. Nota: Normalmente, esta técnica tem uma taxa de sucesso igual ou até pior do que a FIV, ou seja, varia entre 20 e 35%, em mulheres até 35 anos e, a partir dessa idade, sofre um declínio considerável. Portanto, actualmente, não é das técnicas mais utilizadas.

18 Técnicas Acessórias Biópsia de Embriões ou Diagnóstico Genético Pré- Implantatório (PGD) O Diagnóstico Genético Pré-Implantatório (PGD) é uma técnica que permite analisar os cromossomas ou uma fracção de genes de um blastómero do embrião que é obtido por FIV. Com esta observação e análise, é possível identificar doenças, sem que o embrião seja danificado. Após a FIV forma-se um ou vários embriões, os quais passam por um processo de biopsia embrionária, durante o qual lhes é retirado um blastómero para análise. O PGD engloba duas técnicas: FISH (fluorescent in situ hybridization), que diagnostica alterações cromossómicas, como a síndrome de Down; PCR (Polymerase Chain Reaction) para detectar mudanças estruturais nos genes. Assim, doenças hereditárias, desde que previamente identificadas na família, podem ser evitadas através do uso destas técnicas. Durante a FIV, é relativamente fácil aceder aos óvulos e aos pré-embriões, uma vez que estão em estágios precoces de clivagem. Por isso, é possível realizar uma ou mais biopsias destas células. Contudo, actualmente, a quantidade de material genético que seria suficientemente segura e necessária para a realização dos testes é ainda limitada e, por isso, não é possível confirmar totalmente os resultados dos diagnósticos. Apesar disso, o PGD tem-se revelado essencial no decorrer de muitos procedimentos de FIV. É, de facto, um desafiado científico, pois exige conhecimentos e técnicas avançadas, nos ramos da embriologia e da biologia molecular. Trabalho em laboratório.

19 Biópsia do corpúsculo polar Para se realizar o PGD, é necessário adquirir uma quantidade de material genético suficiente para que se obtenha informação. Mas, ao mesmo tempo, o embrião não pode ser danificado. Assim, pode fazer-se a biopsia: Do primeiro glóbulo polar mais precisamente, diagnóstico genético pré-concepcional; Do segundo glóbulo polar; De blastómeros em fase de clivagem; De células do trofoblasto. De todos os processos, a biópsia de células do trofoblasto é, teoricamente, aquele que permite obter quantidade suficiente de células para análise genética. No entanto, a biópsia do primeiro glóbulo polar e a biópsia de blastómeros continuam a ser os métodos mais utilizados nas clínicas de reprodução assistida. FISH (Fluorescent in situ Hibridization) A técnica da FISH, que tem vindo a conhecer um maior desenvolvimento na última década, permite determinar o número de cromossomas específicos, através da contagem de sinais específicos nos núcleos em interfase. Esta técnica é muito sensível e extremamente exacta. Como mencionado anteriormente, o material genético para análise está limitado a uma ou duas estruturas (glóbulos polares e um ou dois blastómeros). Além disso, a biópsia do glóbulo polar não é aplicável se as doenças genéticas em questão são transmitidas pelo homem, ou seja, pelo pai. A análise cromossómica directa é realizada apenas no primeiro ou segundo glóbulos polares porque, nos estágios mais precoces de clivagem (6 a 10 células), raramente se obtêm cromossomas em metafase, porque as mitoses ocorrem muito rapidamente. PCR (Polimerase Chain Reaction) para detecção de defeitos em um único gene A técnica da PCR é uma revolução na análise do DNA, pois permite detectar mutações num único gene, em glóbulos polares ou blastómeros. O DNA é amplificado repetidas vezes, para que se obtenham cópias adequadas para análise, sendo, depois, submetido a análise de mutações.

20 No entanto, ainda existem muitos problemas, nomeadamente, ao nível do controlo das contaminações do DNA, pois mesmo quantidades mínimas de DNA contaminante podem comprometer todo o método. Por isso, os cuidados na utilização desta técnica devem ser rigorosos. Procedimento do PRC. Quais as principais aplicações do PGD? O sexo de um pré-embrião pode ser realisticamente determinado através da FISH, usando sondas que identificam os cromossomas X ou Y; ou usando a técnica de PCR, por análises de sequências cromossómicas. Desta forma, doenças ligadas ao sexo podem ser detectadas e evitadas. A FISH permite determinar a ploidia exacta do pré-embrião e ainda diagnosticar certas aneuploidias muito comuns, como é o caso das trissomias, que ocorrem, normalmente, quando a mulher tem já uma idade materna avançada. Também se podem detectar outras anomalias cromossómicas estruturais. A PRC permite detectar alterações genéticas que envolvem um único gene, tais como a Fibrose Cística, a Anemia Falciforme, a Doença de Tay-Sachs e outras doenças comuns. O PGD é uma técnica que está em crescimento e que, no futuro, poderá ser determinante para resolver problemas genéticos. Além disso, com o desenvolvimento da tecnologia, certamente, daqui por uns anos, a eficiência destas técnicas será ainda maior, e será possível minimizar as falhas e os erros associados. éticas. No entanto, o PGD tem sido alvo de várias críticas, relacionadas com questões

21 Crioconservação de gâmetas e embriões O que é a Criobiologia? A Criobiologia é o estudo dos processos de congelação de células e tecidos e permite a preservação de células por tempo prolongado, mantendo as suas propriedades biológicas depois de descongeladas. Graças aos avanços tecnológicos, desenvolveram-se protocolos de congelação e descongelação eficazes, que permitem preservar células e tecidos a temperaturas até -196ºC, sem afectar ou com um efeito mínimo na sua estrutura e funcionalidade. Criopreservação dos Espermatozóides A Criopreservação do esperma é uma técnica utilizada desde os anos 50 e representa uma valiosa opção terapêutica no tratamento da infertilidade. Esta técnica permite: Inseminação artificial com esperma de doador recurso a um banco de esperma; Utilizar esperma congelado do parceiro, caso não seja possível a presença deste nos procedimentos de inseminação artificial ou FIV; Preservar a capacidade reprodutiva, pois os pacientes que são sujeitos a tratamentos que podem comprometer a função espermática, como a radioquimioterapia e algumas cirurgias, podem preservar o próprio esperma, para uma utilização dos espermatozóides posterior ao tratamento. Preservar o material genético, visto que pacientes submetidos à vasectomia podem guardar amostras de esperma para serem utilizadas no futuro. Aparelho de congelação de sémen e embriões.

22 Criopreservação de Oócitos Esta é uma técnica ainda em desenvolvimento. Porém, surgiram já ideias para a formação de um banco de oócitos II. No futuro, os oócitos II poderão ser armazenados e, posteriormente, usados, sobretudo, em casos de mulheres que não possuem ovários ou que apresentam menopausa precoce. Além disso, trata-se de uma oportunidade para pacientes que serão submetidas a tratamentos de cancro. Assim, aumenta a eficácia das técnicas de reprodução medicamente assistida. Pacientes que são submetidas a tratamentos de FIV ou ICSI, dos quais obtêm um grande número de oócitos II, poderão congelar os excedentes e utilizá-los numa outra tentativa ou ainda doá-los a um banco, para que outras mulheres os possam utilizar. No entanto, para já, há que ter em atenção algumas desvantagens da técnica: O fuso mitótico, estrutura que segura o material genético do oócito maduro, é sensível a mudanças de temperatura, pelo que, durante o processo de congelamento, podem ocorrer erros genéticos, dando origem a aneuploidias, como as trissomias. É possível que, com o congelamento, ocorra um aumento da libertação de grânulos corticais que provoquem o endurecimento da zona pelúcida. Estando a zona pelúcida mais dura, seria dificultado o processo da fecundação in vitro. Quanto à taxa de sobrevivência dos oócitos humanos descongelados, ainda não foram estabelecidos valores definidos, mas, normalmente, os índices de sucesso variam entre 27% e 64%. Sabe-se, no entanto, que a fertilização de oócitos frescos é mais eficaz do que a fertilização dos oócitos descongelados. Hoje, a técnica que mais é utilizada e que melhores resultados apresenta é a técnica de congelação ultra-rápida a vitrificação. Crioconservação de gâmetas.

23 Criopreservação de Embriões Esta técnica permite guardar os embriões excedentários, quando há produção de mais embriões do que o necessário para a transferência. Os embriões são colocados numa solução especial, que contém uma substância que evita que o frio excessivo danifique os embriões crioprotector. São, então, colocados em botijas de azoto líquido, onde a temperatura chega a - 196ºC. Os embriões podem permanecer guardados por tempo indeterminado e, apesar de apresentarem menor taxa de sobrevivência do que os embriões a fresco, esta técnica permite a um casal ter mais filhos, com um menor custo. Vinte e quatro horas antes da transferência, os embriões são descongelados, cultivados e são novamente estudados quanto à sua viabilidade. Congelação de embriões

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