Vinicius Müller, Juliana Francis Piai, André R. Fajardo, Silvia L. Fávaro, Adley Forti Rubira, Edvani C. Muniz*

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1 PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS CONSTITUÍDAS DE QUITOSANA E ZEÍNA, COMO MATRIZES POLIMÉRICAS PARA POSTERIOR LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS Vinicius Müller, Juliana Francis Piai, André R. Fajardo, Silvia L. Fávaro, Adley Forti Rubira, Edvani C. Muniz* * Universidade Estadual de Maringá - UEM, Campus de Maringá, Maringá-PR ecmuniz@uem.br Os sistemas de liberação controlada de fármacos oferecem inúmeras vantagens quando comparados a sistemas de dosagem convencional, entre elas destacam-se a maior eficácia terapêutica, bem como diminuição significativa da toxicidade pelo uso de materiais biodegradáveis. Materiais poliméricos biodegradáveis vêm sendo amplamente estudados como matrizes carreadoras de fármacos, devido ao baixo custo, disponibilidade e baixa toxicidade. Zeína (ZN) e Quitosana (QT) são polímeros biodegradáveis e podem formar microesferas com características para serem utilizadas como matrizes carreadoras de fármacos. Neste trabalho, foram preparadas e caracterizadas microesferas constituídas de ZN na presença e na ausência de QT a partir da mistura das soluções desses dois polímeros. As análises morfológicas apresentaram microesferas com maior porosidade quando formadas na presença de QT. Além disso, as análises calorimétricas e espectroscópicas na região do infravermelho evidenciaram a formação dessas microesferas constituídas basicamente por ZN, com pequena quantidade de QT. Palavras-chave: sistemas de liberação controlada, Zeína, Quitosana, microesferas, materiais poliméricos biodegradáveis. Preparation and characterization of microspheres constituted of Zein and Chitosan, as polymeric matrices for controlled drug delivery system. The drug delivery systems offers several advantages when compared to the conventional dosage systems, for instance, major therapeutic efficacy, significant decrease of toxicity, because the use of biodegradable materials. Biodegradable polymeric materials are becoming studied as drug carrier matrices, because of the low price, availability and low toxicity. Zein (ZN) and Chitosan (QT) are biodegradable polymers which can form microspheres with characteristics for the use as drug carrier matrix. In this work, microspheres constituted of ZN were prepared in the presence and absence of QT, from solutions of each polymer, and characterized. The morphological analysis presented microspheres with bigger porosity when formed in presence of QT, as well as, the calorimetric analysis and the FTIR spectroscopic analysis make evident the formation of microspheres basically constituted of ZN, with little quantity of QT. Keywords: drug delivery systems, Zein, Chitosan, microspheres, biodegradable polymeric materials. Introdução Sistemas poliméricos de liberação de drogas são amplamente utilizados e não só permitem uma liberação lenta e gradual do ingrediente ativo, como também podem possibilitar o direcionamento a alvos específicos do organismo, como sítios de inflamação ou tumor. (Middleton e col., 2002). Para a liberação de um fármaco, é interessante que este chegue ao local específico sem que haja modificações na sua estrutura molecular. Assim, são utilizados alguns sistemas coloidais para liberação controlada de fármacos. Entre estes sistemas é possível citar lipossomos, micelas, nanoemulsões e nonopartículas. Dessa forma, o fármaco fica preso dentro da matriz coloidal e é protegido da degradação por enzimas (Gerelli e col., 2008).

2 Os polímeros naturais são frequentemente biodegradáveis, como por exemplo, o colágeno, a celulose, o alginato e a quitosana e são muito utilizados como matrizes em liberação de fármacos (Nascimento e col., 2001). A quitosana (poli[β-(1-4)-2-amino-2-desoxi-d-glicopiranose]), QT, é um polissacarídeo obtido a partir de desacetilação parcial da quitina que, por sua vez, é um polímero natural constituinte do esqueleto de invertebrados (Kumar, M.N.V.R., 2000). Devido às suas propriedades de biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade, a quitosana é um biopolímero que tem sido utilizado dentro das áreas biomédica e farmacêutica como carreador de medicamentos, para liberação controlada de fármacos e DNA, em manufatura de lentes de contato, membranas artificiais, pele artificial, aplicações ortopédicas e periodontais (Kumar e col., 2004). Zeína, ZN, é uma proteína da classe das prolaminas encontrada no milho. Devido a sua capacidade de atuar como barreira para a água, ela é muito utilizada em revestimento para doces, nozes, frutas e embalagem para alimentos. Há, também, estudos para aplicação médica da zeína como carreadores de biocompostos para liberação em sítios específicos no corpo humano (Picklesimer, P., 2005). A ZN é insolúvel em água pura e solúvel em soluções contendo no mínimo 70% de álcool (Lawton, 2002). Zeína, quando precipitada, tem a capacidade de formar filmes com água. A interação intermolecular é de tal forma que suas moléculas agregam-se e formam filmes para revestimento. Essa propriedade também é importante para estudos de filmes e revestimentos comestíveis, tanto na área alimentícia, bem como em filmes gastro-resistentes na área farmacêutica e biomédica. Devido às características da QT e da ZN, foram preparadas e caracterizadas, neste trabalho, partículas constituídas desses dois polímeros, visando à formação de biomateriais com potencial para serem aplicados como matrizes para liberação controlada de fármacos. Experimental Preparação de micropartículas de Zeína com Quitosana e Zeína (QT/ZN). Para a preparação das partículas de QT/ZN, primeiramente foram feitas duas soluções. A quitosana (QT) foi solubilizada em 100 ml de solução aquosa de ácido clorídrico (HCl 0,2 mol.l -1 ) a 65 ºC e sob agitação, de modo a obter concentração 1% (m/v) de QT. Para a solução de zeína

3 (ZN) foram utilizados 2,0 g de ZN adicionadas à 100 ml de solução etanol-água 80-20% (v/v), sob agitação, obtendo-se uma solução de ZN à concentração de 2% (m/v). A solução alcoólica de ZN foi colocada em um balão de fundo redondo com três bocas, acoplado ao dispersor Extratur (Quimis). Logo após a solução de QT foi vagarosamente (cerca de 4 ml min -1 ) adicionada ao balão, sob agitação de rpm, com o auxílio de uma pipeta. Também, foram preparadas partículas constituídas somente de ZN pela adição de água pura no lugar na solução contendo QT dissolvida. Após todo o conteúdo ter sido adicionado, foi obtida uma nova mistura com concentração de solvente álcool-água % (v/v), a qual as partículas são insolúveis e precipitam. Ainda, sob agitação, foram esperados cerca de 2 a 3 minutos para a total interação entre os polímeros. O precipitado formado foi congelado e após foi seco sob pressão reduzida. Em seguida, as partículas já secas foram lavadas com solução aquosa de HCl (0,2 mol L -1 ) para retirada de QT não agregada às partículas. Essa mistura foi filtrada e seca sob pressão reduzida, a temperatura ambiente. Após secas, as partículas foram caracterizadas por MEV, DSC e FTIR. Caracterizações das micro e nanopartículas Microscopia eletrônica de varredura As partículas, após serem secas, foram recobertas com ouro e analisadas morfologicamente por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) utilizando um equipamento SHIMADZU, modelo SS-550. O diâmetro médio das partículas formadas foi calculado utilizando-se um programa de análise de imagens, SIZE MATER 1.1. Calorimetria Diferencial de Varredura As análises por meio de Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) foram realizadas em um equipamento SHIMADZU, modelo DSC-50, operando com taxa de aquecimento de 10 ºC min. -1, sob fluxo de nitrogênio gasoso de 20 ml min. -1, na faixa de temperatura de ºC. Espectroscopia na região do infravermelho As partículas foram caracterizadas por meio de espectroscopia na região do infravermelho (FTIR). Os espectros foram obtidos em um equipamento Bomem modelo MB-100, operando na

4 região de 4000 a 400 cm -1 com resolução de 4 cm -1 e 37 aquisições por minuto, em pastilhas de KBr. Resultados e Discussão A partir da análise da Figura 1, obtidas por MEV, foi observado a formação de partículas de tamanhos variados. Os diâmetros das partículas foram medidos por meio de um programa de análise de imagens (Size Meter 1.1 ), e o tamanho médio das micropartículas de ZN/QT foi de 4,30 ± 1,93 microns e predominantemente esféricas. Essas microesferas apresentam características esponjosas. Microesferas somente de ZN apresentaram tamanho médio de 1,23 ± 0,47 mícrons e superfícies mais lisas. As microesferas de ZN/QT são formadas a partir da adição vagarosa da solução aquosa de quitosana à solução alcoólica de zeína, sob agitação. Com isso, as partículas formadas precipitam na nova solução, tendo em vista que a zeína é insolúvel em soluções alcoólicas menores que 70%, da mesma forma que a quitosana precipita em soluções alcoólicas e com ph > 5. As microesferas de ZN são formadas pela adição de água pura na solução, precipitando a partir de concentrações também menores que % (v/v) de etanol-água respectivamente. As micrografias das micro e nanoesferas formada nas duas preparações são apresentadas a seguir:

5 a) b) c) d) Figura 1 - Micrografias a) micropartículas de QT/ZN com ampliação de 2400x e escala de 5 microns. b) micropartículas de QT/ZN com magnitude de 1500x e escala de 10 microns. c) micropartículas de ZN com ampliação de 5000x e escala de 2 microns. d) micropartículas de ZN com ampliação de 3000x e escala de 5 microns. As partículas de ZN/QT e ZN foram submetidas à análise térmica, por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) onde foi observado que o perfil da curva das micropartículas (ZN/QT) assemelha-se ao perfil da curva da ZN pura (Fig. 2). Comparando o comportamento térmico das micropartículas (termograma em preto) com os dos polímeros puros QT (termograma em vermelho) e ZN (termograma em azul) é possível perceber que os picos em 118 ºC para QT e em 96 ºC para a ZN deslocam para menores temperaturas no termograma para as micropartículas (81 ºC). Em todas essas curvas, os picos endotérmicos na região de 50 a 120 ºC podem ser atribuídos a perda de água (Guinesi e Cavalheiro, 2006). Já, o pico na região de 314 ºC para a QT é atribuído a decomposição deste polímero puro (Guinesi e Cavalheiro, 2006). Proteínas podem possuir propriedades que são associadas a diferentes tipos de estruturas tridimensionais. Alguns trabalhos (Mothé e col., 2005 e Relkin e col., 1994) mostram que a desnaturação de uma proteína pode ser estudada por análises térmicas. Dessa forma, Mothé e col. (2005) atribuíram a presença de um pico endotérmico, em termogramas obtidos por DSC, à desestabilização de interações físicas, tais como ligações de hidrogênio, interações eletrostática e

6 dipolo-dipolo em proteínas que causam a desnaturação. Dessa forma, os picos em 311 ºC para ZN pura e em 316 ºC podem ser atribuídos à perda de estrutura tridimensional da ZN. Apesar do perfil do termograma das micropartículas (ZN/QT) ser semelhante ao perfil do termograma da ZN pura, houve pequenos deslocamentos em alguns picos, o que caracteriza a presença dos dois polímeros. A partir disso infere-se que há interação entre as cadeias de QT e ZN e as microesferas formadas a partir das soluções de QT e ZN são constituídas desses dois polímeros, porém com quantidade de ZN bem superior à de QT. EXO ZNQT QT ZEINA 314 ºC ENDO 81 ºC 96 ºC 118 ºC 311 ºC 316 ºC Temperatura C Figura 2 - Termograma ZN pura; QT pura e QT + ZN. Na Figura 3 são apresentados os espectros de FTIR da quitosana pura (em preto), da zeína pura (em azul) e das partículas constituídas de ZN e QT (em vermelho). É possível observar que o espectro das partículas ZN/QT tem características bem semelhantes ao espectro da zeína pura. Porém, há no espectro das partículas de ZN/QT o aparecimento de uma banda com pouca intensidade em 1082 cm -1, característica de ligações C-O predominantes da QT. Giner e col. (2009) mostram em seu trabalho que essa região é característica da presença de QT em blendas de ZN/QT. Diferente do trabalho de Giner e col. (2009) não é utilizado, no presente trabalho, um solvente comum para QT e ZN, mas sim não-solventes para ambos polímeros. Dessa forma, a banda em 1082 cm -1 caracteriza a precipitação simultânea de QT e ZN na formação das micropartículas. Na precipitação, os polímeros podem interagir por ligações de hidrogênio devido à presença dos grupos aminoácidos da proteína (ZN) e dos grupos amino da QT, além de tornarem-se insolúveis na

7 presença do não-solvente (etanol para QT e água para ZN). Com isso, é possível inferir que as micropartículas são constituídas principalmente de ZN com pouca QT. No entanto, estudos mais aprofundados são necessários para uma melhor caracterização e aplicação deste material. Transmitância (u.a.) -OH 3420 C-H 2917 ZN QT micro ZN/QT 1695 C=O C-O Nº de onda (cm -1 ) Figura 3: Espectros de FTIR de: ZN; QT; e de partículas de ZN + QT. Conclusões Com o método de síntese empregado, foi possível obter esferas de QT/ZN de diferentes tamanhos. Essas microesferas são formadas a partir da redução da concentração de álcool na solução de ZN, inicialmente próximo de 40% (v/v). A partir da análise das micrografias (MEV), as partículas de ZN/QT apresentaram maior porosidade em relação às partículas de ZN, bem como diâmetros maiores, o que foi concluído como sendo ocasionadas devido à presença da QT nas microesferas. Com os espectros de FTIR foram observadas semelhanças entre os espectros das partículas constituídas de ZN/QT e o espectro de ZN, diferenciando-se apenas em um pico sutil em 1082 cm -1, atribuído às ligações C-O predominantes na estrutura da QT, e não presentes na estrutura da ZN. A partir das análises térmicas, foi verificado que não há diferenças significativas entre a curva de ZN e das micropartículas de ZN/QT. Assim, foi concluído que há predominância de ZN nas micro e nanopartículas de QT/ZN.

8 Agradecimentos V.M agradece à Prati, Donaduzzi e Cia Ltda. (Toledo-PR) pela concessão de bolsa de iniciação científica. A.R.F. agradece à CAPES pela concessão de bolsa de mestrado. J.F.P., S.L.F., E.C.M., e A.F.R. agradecem ao CNPq pelo auxílio financeiro. Referências Bibliográficas 1. J. C. Middleton; A. J. Tripton Synthetic Biodegradable Polymers as Medical Devices. Disponível em Acesso em abril de Y. Gerelli; M. T. Di Bari; A. Deriu; L. Cantu; P. Colombo; C. Como; S. Motta; F. Sonvico e R. May, J Phys-Condens Mat 20 (2008) A. Nascimento; M.C. Laranjeira; V.T. Favere; A. Josue J. Microencapsulation 18 (2001) M. N. V. R. Kumar; React Funct Polym 46 (2000) M. N. V. R. Kumar; R. A. A. Muzzarelli; C. Muzzarelli; H. Sashiwa e A. J. Domb Chem Rev 104 (2004) P. Picklesimer, Inside Illinois 17 (2005). 7. J. W. Lawton, Am Assoc Cer Chem, 79 (2002) L. S. Guinesi; E. T. G. Cavalheiro Thermochim Acta 444 (2006) C. G. Mothé; A. Damico; M. da G. S. Machado Ciência e Tecnologia de Alimentos 25 (2005) P. Relkin, Thermochim Acta 246 (1994) S. T. Giner; M. J. Ocio; J. M. Lagaron Carbohyd Polym 77 (2009)