OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BLENDAS DE FIBROÍNA DE SEDA E QUITOSANA
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1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BLENDAS DE FIBROÍNA DE SEDA E QUITOSANA Mariana A. de Moraes, Grinia M. Nogueira, Raquel F. Weska, Marisa M. Beppu* Faculdade Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Campinas SP beppu@feq.unicamp.br O objetivo deste trabalho foi preparar e caracterizar membranas de blendas de fibroína de seda e quitosana. Além disso, buscou-se verificar uma possível indução de conformação da fibroína para uma forma mais estável devido à adição de quitosana. Foram preparadas membranas de blendas fibroína/quitosana em diferentes proporções e realizadas análises que permitem verificar cristalinidade, conformação estrutural e estabilidade térmica. Os resultados da análise cristalográfica (DRX) indicam a tendência a uma maior organização estrutural com a adição de quitosana. Análises de FTIR permitiram verificar que, principalmente em um conteúdo de quitosana de apenas 25%, a fibroína tem sua conformação induzida para uma forma mais estável. As análises térmicas indicam que a fibroína é bastante estável termicamente, sendo que, quanto maior sua proporção na blenda, maior a temperatura em que é iniciada a degradação. Palavras-chave: Biopolímeros, membranas, conformação estrutural, quitosana, fibroína de seda. Preparation and characterization of blends containing silk fibroin and chitosan The aim of this study was to prepare and characterize blend membranes of silk fibroin and chitosan. Moreover, a conformation of fibroin to a more stable form induced by the addition of chitosan was verified. Blend membranes of fibroin/chitosan were prepared in different proportions and had their crystallinity, structural conformation and thermal stability characterized. The results of crystallographic analysis (XRD) indicated the tendency to higher structural organization caused by the addition of chitosan. FTIR showed that, mainly in a content of chitosan of only 25%, fibroin is present in a more stable form. Thermal analyzes indicate that fibroin is thermally stable and that when its proportion in the blend increases, the temperature in which the degradation is initiated also does so. Keywords: Biopolymers, membranes, structural conformation, chitosan, silk fibroin. Introdução A fibroína é uma proteína fibrosa produzida pelo bicho-da-seda. O casulo do bicho-da-seda é composto primariamente por sericina e fibroína. A sericina atua como uma espécie de cola, envolvendo as fibras da fibroína. Já a fibroína é composta por dois tipos principais de proteínas, com massas moleculares de 25 e 325 kda.¹ A fibroína, como a maioria das proteínas, possui três tipos principais de conformações da estrutura secundária: folha-β, α-hélice e helicoidal aleatória. Normalmente, as três conformações estão presentes, porém em proporções diferentes.² Para o caso específico da fibroína, as conformações α-hélice e helicoidal aleatória são chamadas de seda I, que é uma forma meta estável da fibroína, solúvel em água e menos cristalina. Já a conformação folha-β também é conhecida como seda II, caracterizada por ser uma estrutura bastante estável e insolúvel em água.³ A solução de fibroína apresenta poucas ligações intermoleculares por pontes de hidrogênio, que estabilizam a estrutura β. A fim de promover a transição da conformação seda I, menos estável, para a seda II, alguns pesquisadores propõem tratamentos físicos e químicos utilizando altas
2 temperaturas, solventes orgânicos e umidade elevada, porém com estes tratamentos a membrana de fibroína torna-se bastante quebradiça. 4,5,6 Neste contexto, surge a necessidade de métodos que promovam a transição da fibroína para a forma seda II sem haver perda de propriedade mecânica, e isto pode ser feito através da incorporação de outros biopolímeros na fibroína, como por exemplo, a quitosana, o alginato de sódio, a queratina e a celulose. 7,8,9,10 A quitosana é um produto da desacetilação da quitina, encontrada no exoesqueleto de crustáceos. Ela possui grupos ativos capazes de interagir com as macromoléculas da fibroína, condição necessária para a compatibilidade dos polímeros em soluções e filmes. 11 Chen e colaboradores 4 verificaram que a fibroína pode ter sua conformação induzida para a forma seda I, através da formação de blendas com quitosana. Outros autores estudaram blendas de fibroína com quitosana e verificaram uma transição estrutural da fibroína de seda principalmente em um conteúdo de quitosana de até 40%. 7,12 O objetivo deste trabalho foi obter e caracterizar blendas de fibroína de seda e quitosana, visando uma possível alteração na conformação da fibroína para uma forma mais estável. As membranas foram caracterizadas quimicamente por difração de raios-x (DRX) e espectroscopia de infravermelho (FTIR). Além disso, foram feitas análises térmicas de termogravimetria (TGA) e calorimetria exploratória diferencial (DSC), a fim de verificar a estabilidade térmica das blendas formadas. Experimental Matérias-primas Para a realização dos experimentos foram utilizados casulos do bicho-da-seda doméstico Bombyx mori, fornecidos pela fiação Bratac (Bastos/SP, Brasil). O método utilizado para remoção da sericina e dissolução dos fios foi baseado no método proposto por Li et al. 13 Os casulos foram lavados três vezes com solução aquosa de Na 2 CO 3 1 g/l, durante 30 minutos, à 85 ºC, para a remoção da sericina. Os fios foram então lavados com água destilada em abundância, para evitar qualquer resíduo de Na 2 CO 3. Quando secos, os fios foram dissolvidos em solução ternária de cloreto de cálcio, etanol e água (CaCl 2 -CH 3 CH 2 OH-H 2 O) na proporção de 1:2:8 molar, a 85 C, obtendo-se uma solução salina de fibroína de seda 5% (p/v). A solução salina foi então filtrada e dialisada em água destilada por 3 dias, a 10 ºC, para a remoção dos sais do solvente e obtenção de um material homogêneo. A solução de fibroína obtida foi filtrada e diluída em água destilada a fim de obter-se uma solução de fibroína dialisada 1% (p/v). 2
3 A quitosana utilizada foi da marca Sigma, com grau de desacetilação de 85%, sendo dissolvida em solução de ácido acético 2%, obtendo-se uma solução 1% (p/v). Preparação das blendas de fibroína de seda e quitosana Para a obtenção da blenda foi necessário ajustar o ph das soluções de fibroína e quitosana. O ph das soluções foi ajustado para um valor aproximadamente igual a 5,5 a fim de permitir uma maior interação entre a fibroína e a quitosana e também devido ao fato que, em valores de ph básicos (acima de 6,5) a quitosana torna-se insolúvel 14 e em valores de ph abaixo de 5 ocorre a gelificação instantânea da fibroína 15, impossibilitando a formação da blenda. Yeo e colaboradores 16 também relataram a necessidade de ajuste de ph para a obtenção de blendas de PVA/quitosana/fibroína. As soluções de fibroína e quitosana com ph ajustado foram misturadas sob agitação lenta, por 15 minutos, à temperatura ambiente. As blendas foram preparadas em diferentes proporções para poder ser avaliada a influência da quitosana na membrana de fibroína. As proporções (em massa) estudadas neste trabalho foram fibroína:quitosana 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 0:100. As blendas foram colocadas em placas de poliestireno e deixou-se o solvente evaporar a temperatura ambiente para a formação das membranas. 8 Após secas, as membranas da blenda fibroína/quitosana foram lavadas com água destilada e deixou-se a água evaporar a temperatura ambiente e então foram realizadas as análises necessárias. Não foi necessário fazer qualquer tipo de tratamento utilizando solventes nas membranas da blenda, pois as mesmas mostraram-se insolúveis em água. Somente a membrana de fibroína pura mostrouse solúvel, porém, não foi realizado tratamento para torná-la insolúvel, a fim de se realizar uma comparação com as demais membranas, uma vez que o tratamento causaria alteração na estrutura química da mesma. Caracterização Foram realizadas análises das amostras por DRX e FTIR-ATR. Para a realização das análises de raios-x foi utilizado o equipamento X PERT PW3050, da PHILIPS, com radiação Cu- Kα, com comprimento de onda de 1,54Å. A taxa de varredura utilizada foi de 0,6 /min, e 2θ variando de 10 a 35. Para as análises de FTIR-ATR foi utilizado o equipamento Illuminate R2 na região do espectro de 650 a 4000 cm -1. Para a análise de DSC foi utilizado DSC-50 da Shimadzu, com faixa de temperatura de 25 a 500ºC e taxa de aquecimento de 10ºC/min. A análise de termogravimetria foi realizada em TGA-50 3
4 Shimadzu, em uma faixa de temperatura de 25 a 600 ºC, a uma taxa de aquecimento de 10 ºC/min e vazão de nitrogênio de 50 ml/min. Resultados e Discussão Difração de raios-x A Figura 1 apresenta os difratogramas de raios-x das membranas das blendas de fibroína e quitosana. (a) Intensidade (escala arbitrária) (b) (c) (d) (e) θ Figura 1: Difratogramas de raios-x para as membranas da blenda fibroína/quitosana nas proporções 100:0 (a), 75:25 (b), 50:50 (c), 25:75 (d) e 0:100 (e). Pode-se observar que a membrana de fibroína pura, Figura 1(a), apresentou padrão típico de substâncias amorfas (seda I), com a ausência de picos de cristalinidade. Isto era esperado, uma vez que não foi feito qualquer tipo de tratamento para tornar estas membranas mais cristalinas. Com a adição de quitosana nas blendas (Figura 1(b), (c) e (d)), observa-se a formação de picos de cristalinidade em 2θ = 14º e 17º sendo que, quanto maior a proporção de quitosana na blenda, maior a intensidade destes picos. Principalmente no difratograma da blenda com 75% de quitosana (Figura 1(d)), observa-se um pico bastante intenso em 17º. Este pico é atribuído à estrutura seda II, com alta cristalinidade. 17 Isto ocorre possivelmente devido a interação entre as moléculas da fibroína e da quitosana, que são capazes de formar ligações por pontes de hidrogênio, estabilizando a estrutura da fibroína. 18 Também pode ser observado um pico característico da quitosana em 2θ = 20º (Figura 4
5 1(e)), sendo que este pico pode ser notado com diferentes intensidades nos difratogramas das blendas, dependendo da quantidade de quitosana presente nas mesmas. 19 Espectroscopia de Infravermelho A partir da análise do espectro de infravermelho, pode-se determinar a conformação estrutural da fibroína, dependendo do comprimento de onda em que se encontram as bandas de absorção das amidas I, II e III. Os espectros de infravermelho obtidos para as blendas de fibroína e quitosana são mostrados na Figura 2. (a) (b) Transmitância (escala arbitrária) (c) (d) (e) Número de onda (cm -1 ) Figura 2: Espectros de infravermelho para as membranas da blenda fibroína/quitosana nas proporções 100:0 (a), 75:25 (b), 50:50 (c), 25:75 (d) e 0:100 (e). A membrana de fibroína pura (Figura 2(a)) apresentou picos em 1641 e 1632 (amida I) e 1515 cm -1 (amida II) correspondentes à conformação seda II. Também foram observados picos em 1530 (amida II) e 1237 cm -1 (amida III), característicos de conformação seda I. 20 Analisando a Figura 2(e), verifica-se que a quitosana pura apresentou picos característicos, também observados por Kweon e colaboradores. 19 O pico apresentado em 1646 cm -1 é atribuído à ligação C=O e o pico em 1584 cm -1 ao estiramento da ligação NH 2. O pico em 1150 cm -1 corresponde à ligação assimétrica C-O-C e os picos em 1059 cm -1 e 1026 cm -1 às vibrações envolvendo a ligação C-O. Com a diminuição da proporção de quitosana adicionada na blenda, verifica-se uma diminuição de intensidade dos picos correspondentes à ligação C-O da quitosana (1059 e 5
6 1026 cm -1 ). As blendas exibiram bandas de absorção tanto da fibroína quanto da quitosana, variando apenas a intensidade em que se apresentaram, dependendo da proporção destes materiais nas membranas. O espectro da blenda contendo 75% de fibroína (Figura 2(b)) apresentou picos nas bandas de amida I e II com melhor definição. Os picos apresentados em 1620 e 1514 cm -1 são caracterizados por serem picos referentes à seda II, mais estável. Nota-se, portanto, que os picos referentes à seda I apresentados no espectro da membrana de fibroína pura (Figura 2(a)), com exceção do pico referente à banda de amida III (1233 cm -1 ), não mais apareceram no espectro da blenda, indicando a transição da estrutura da fibroína devido a adição de quitosana. Na blenda fibroína/quitosana 50:50, observa-se a presença dos picos referentes às bandas de amida I e II em regiões que correspondem à seda II. O pico referente à banda de amida II foi observado em 1528 cm -1 ; este valor refere-se a conformação seda II, porém, quando comparado com o pico em 1514 cm -1 indica a tendência a uma conformação menos estável (seda I). Além disso, o pico referente à amida III permaneceu em um número de onda correspondente à conformação seda II. Esta tendência é confirmada observando-se o espectro da Figura 2(d), onde o pico referente à amida II está em 1535 cm -1, valor atribuído à conformação seda I. Porém, este espectro apresenta em 1260 cm -1 (amida III) pico atribuído à estrutura seda II, além de um pico em 1622 cm -1 (amida I). Desta forma, pode-se dizer que a quitosana causou modificação na conformação da estrutura secundária da fibroína. Porém, como as duas conformações (seda I e seda II) coexistem nas membranas, consegue-se apenas indicar uma possível transição estrutural através da análise das bandas de amida. Além disso, esta modificação estrutural foi mais pronunciada na membrana da blenda fibroína/quitosana 75:25, indicando que existe um valor máximo de quitosana que deve ser adicionado à fibroína a fim de induzir esta modificação de forma mais intensa. Outros autores estudaram blendas de fibroína com quitosana e verificaram um aumento de estabilidade e cristalinidade em blendas com um conteúdo de quitosana de até 40%. 7,12 Análises Térmicas A Figura 3 mostra os termogramas de DSC para as blendas de fibroína e quitosana. 6
7 (a) (b) (c) Endo (d) (e) Temperatura (ºC) Figura 3: Termogramas de DSC para as membranas da blenda fibroína/quitosana nas proporções 100:0 (a), 75:25 (b), 50:50 (c), 25:75 (d) e 0:100 (e). Foram observados picos endotérmicos localizados abaixo de 150ºC em todas as blendas analisadas, sendo estes picos atribuídos à evaporação da água adsorvida nas membranas. A membrana de fibroína pura, Figura 3(a), apresentou pico endotérmico associado à sua degradação térmica em 283ºC, conforme esperado, já que a presença de pico de degradação térmica de membranas de fibroína em valores de temperatura abaixo de 290ºC é característico de membranas amorfas (seda I), ou seja, membranas que não passaram por nenhum tipo de tratamento físico ou químico para ter sua estrutura alterada para uma forma mais cristalina. 21 Os termogramas das blendas 75:25, 50:50 e 25:75 (Figura 3(b), (c) e (d)), mostraram uma mistura dos dois componentes, com efeitos mais pronunciados dos picos da fibroína quando utilizado 75% de fibroína (Figura 3(b)), e efeitos mais pronunciados da quitosana quando utilizado 75% de quitosana. Comportamento bastante similar foi observado para blendas de fibroína e quitosana por outros autores. 11,19 A membrana de quitosana pura (Figura 3(e)) apresentou pico exotérmico característico em 294ºC. Este pico é atribuído à decomposição da quitosana, que é um processo bastante complexo, incluindo a desidratação dos anéis dos sacarídeos, a despolimerização e decomposição das unidades acetiladas e desacetiladas do polímero. 19 As curvas termogravimétricas das membranas das blendas de fibroína e quitosana são mostradas na Figura 4. 7
8 F/Q 100:0 F/Q 75:25 F/Q 50:50 F/Q 25:75 F/Q 0:100 Massa Residual (%) Temperatura (ºC) Figura 4: Curvas termogravimétricas das membranas da blenda fibroína/quitosana nas proporções 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 e 0:100. Para todas as curvas verifica-se uma perda de massa inicial, abaixo de 100ºC, atribuída à evaporação da água. Com o aumento da proporção de fibroína nas blendas, a temperatura de degradação térmica das membranas aumentou, indicando que, quanto maior a quantidade de fibroína presente nas membranas, maior a estabilidade térmica das mesmas. Massa Residual (%) ,0005 0,0000-0,0005-0,0010-0,0015-0,0020-0,0025-0,0030 DTGA (massa %/seg) Temperatura (ºC) -0,0035 Figura 5: Curvas de massa residual e massa residual diferencial para a membrana da blenda fibroína/quitosana 50:50. 8
9 A Figura 5 apresenta as curvas de massa residual e massa residual diferencial para a membrana da blenda fibroína/quitosana 50:50. Todas as demais blendas apresentaram comportamento semelhante, com pico de perda de massa abaixo de 100ºC (perda de água) e pico de degradação térmica próximo a 300ºC. Foi observado que, quanto maior a quantidade de fibroína presente na blenda, maior era a temperatura de degradação térmica, havendo um aumentou em torno de 4ºC para cada blenda. Conclusões Foram preparadas membranas de blendas de fibroína e quitosana após ter sido verificada a necessidade de ajuste de ph das soluções para que a blenda fosse homogênea e sem indícios de separação de fases. A caracterização das blendas mostrou que as estruturas seda I e seda II coexistem na fibroína, porém verificou-se que, quando adicionado 25% de quitosana na fibroína tem-se a existência de uma forma mais estável e cristalina. Além disso, as blendas com maior quantidade de fibroína são mais resistentes termicamente. Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro. Referências Bibliográficas 1. G.H. Altman; F. Diaz; C. Jakuba; T. Calabro; R.L. Horan; J. Chen; H. Lu; J. Richmond; D.L. Kaplan Biomaterials 2003, 24, S.V. Canevarolo Jr., Ciência dos polímeros: um texto básico para tecnólogos e engenheiros, Artliber Editora, São Paulo, A. Motta; L. Fambri; C. Migliaresi Macromol. Chem. Phys. 2002, 203, X. Chen; W. Li; T. Yu J. Polym. Sci. Pol. Phys. 1997, 35, Y. Kawahara; K. Furukawa; T. Yamamoto Macromol. Mater. Eng. 2006, 291, S. Putthanarat; S. Zarkoob; J. Magoshi; J.A. Chen; R.K. Eby; M. Stone; W.W. Adams Polymer 2002, 43, H. Kweon; H.C. Ha; I.C. Um; Y.H. Park J. Appl. Polym. Sci. 2001, 80, K.G. Lee; H.Y. Kweon; J.-H. Yeo; S.-O. Woo; J.-H. Lee; Y.H. J. Appl. Polym. Sci. 2004, 93, A. Vasconcelos; G. Freddi; A. Cavaco-Paulo Biomacromolecules 2008, 9, E. Marsano; M. Canetti; G. Conio; P. Corsini; G. Freddi J. Appl. Polym. Sci. 2007, 104, E.S. Sashina; G. Janowska; M. Zaborski; A.V. Vnuchkin J. Therm. Anal. Calorim. 2007, 89, S.J. Park; K.Y. Lee; W.S. Ha; S.Y. Park J. Appl. Polym. Sci. 1999, 74, M. Li; S. Lu; Z. Wu; K. Tan; N. Minoura; S. Kuga Int. J. Biol. Macromol. 2002, 30, J.-K.F. Suh; H.W.T. Matthew Biomaterials 2000, 21, U.-J. Kim; J. Park; C. Li; H.-J. Jin; R. Valluzzi; D.L. Kaplan Biomacromolecules 2004, 5, J.H. Yeo; K.G. Lee; H.C. Kim; Y.L. Oh; A.-J. Kim; S.Y. Kim Biol. Pharm. Bull. 2000, 23,
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