Introdução. Ezequiel de S. Costa Jr. 1, Herman S. Mansur 2 *

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1 PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BLENDAS DE QUITOSANA/POLI(ÁLCOOL VINÍLICO) RETICULADOS QUÍMICAMENTE COM GLUTARALDEÍDO PARA APLICAÇÃO EM ENGENHARIA DE TECIDO. Ezequiel de S. Costa Jr. 1, Herman S. Mansur 2 * 1 Coordenação do Curso Técnico de Mecânica do CEFET-MG escjr50@yahoo.com.br; 2 Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais da UFMG - hmansur@demet.ufmg.br, Rua Espírito Santo, 35/206 - Centro, , Belo Horizonte/MG Brasil Preparation and characterization of chitosan/poly(vinyl alcohol)blend chemically crosslinked by glutaraldehyde for tissue engineering application. In this study, Chitosan/PVA based films were chemically crosslinked by glutaraldehyde in order to achieve structures tailored for tissue engineering application. Both precursors and developed films were characterized by FTIR and XRD in order to determine the presence of chemicals groups and nanostructural order, respectively. The results have showed that the glutaraldehyde crosslinking have altered the crystallinity chitosan and the increase on the C=N bands and decreasing of NH 2 bands suggest that Chitosan/GA crosslinking has preference to occur in the carbon 2 by Schiff s base. The results have showed also evidences that, by controlling PVA and Chitosan as precursors associated with chemical crosslinking, it is possible to tailor the hybrid network aiming for biomedical applications in tissue engineering. Introdução Num sentido amplo a engenharia de tecidos visa fabricar partes de órgãos e tecidos de organismos vivos para sua substituição. Esse ramo do conhecimento tem se desenvolvido devido a crescente demanda por órgãos e tecidos em função de acidentes e/ou tratamentos de enfermidades diversas [1]. No sentido de atender essa demanda as blendas de polímeros naturais e sintéticos tem se mostrado uma alternativa viável, pois é possível trabalhar diversas propriedades a fim de atender as características de cada aplicação. A quitosana (QUI), um polímero obtido principalmente a partir da desacetilação alcalina da quitina, o segundo polímero natural mais abundante depois da celulose que é encontrado nos exoesqueletos de artrópodes e alguns fungos, tem propriedades interessantes para aplicação em engenharia de tecido tais como: biocompatibilidade, biodegradabilidade, acelera a recuperação de lesões, reduz o nível do colesterol sanguíneo, estimula os efeitos do sistema imunológico, além de ter se mostrado um composto bacteriostático e fungistático [2], bem como, os resultados de sua degradação em organismos vivos que são as glicosaminas, substâncias não tóxicas. Uma das características mais importantes da QUI é o seu grau de desacetilação (GD) que representa a proporção de resíduos acetilados ainda presentes na mesma após o processamento para sua obtenção. A (QUI) se degrada pela hidrólise enzimática e apresenta cinética de degradação aparentemente relacionada ao grau de cristalinidade que é controlado principalmente pelo GD [3], entretanto sua resistência mecânica e

2 sua maleabilidade são limitadas principalmente para aplicação como filmes em bandagens, por exemplo, e por isso a mistura da mesma com outros polímeros é um procedimento utilizado para alterar ou obter as propriedades de interesse. O grande desafio consiste em obter um material que resista de forma controlada à degradação em ambiente fisiológico. Com o objetivo de melhorar as propriedades mecânicas e variar a taxa de degradação da QUI utiliza-se a mistura da mesma com outros hidrogéis poliméricos sintéticos tais como o poli(álcool vinílico) (PVA), bem como, com reticulantes; que permitem a formação de ligações cruzadas com a cadeia polimérica principal favorecendo a obtenção de redes, além de bloquear os grupos amino com um agente bifuncional. O PVA é um copolímero produzido pela polimerização do poli(álcool vinílico-co-acetato de vinila) seguida da reação de hidrólise do poli(acetato de vinila) (PVAc) em PVA. A relação entre o percentual de hidroxilas no copolímero final, após a reação de hidrólise, e o número total inicial de radicais ácido acético representa o grau de hidrólise (GH) do PVA. Esse parâmetro é importante na caracterização das propriedades deste polímero. Um aumento do GH implica em redução da solubilidade na água e no aumento da adesão em superfícies hidrofílicas, da viscosidade e da resistência à tração [4]. O hidrogel de PVA possui excelente transparência, consistência macia quando na forma de membrana, além de ser biologicamente inativo e biocompatível [5]. Reticulantes são moléculas de peso molecular muito menor que o peso molecular da cadeia principal entre duas ligações cruzadas consecutivas além de apresentar no mínimo dois grupos funcionais reativos que permitam a formação de ponte entre cadeias poliméricas [2]. Os hidrogéis reticulados são cadeias poliméricas interconectadas pelo reticulante conduzindo a uma formação de rede tridimensional. As propriedades dos hidrogéis reticulados dependem principalmente da sua densidade de ligações cruzadas, notadamente da relação de moles do agente reticulante com os da unidade de repetição do polímero. Exige-se um número crítico de ligações cruzadas por cadeia para permitir a formação da rede. O glutaraldeído (GA) é um agente reticulante normalmente usado na formação de redes de polipeptídios e proteínas devido à reatividade dos grupos aldeídos, que prontamente formam bases de Schiff com os grupos amino das proteínas. É também usado como agente reticulante do PVA e alguns polissacarídeos tais como a heparina, o ácido hialurônico e a QUI [5,7]. A reticulação da QUI com GA a torna mais resistente do ponto de vista físico, químico e microbiológico [8]. Objetivo principal deste trabalho consiste na preparação e caracterização de diversas proporções de misturas de QUI/PVA, com reticulação química por GA, como parte inicial de um trabalho que permita evidenciar os mecanismos envolvidos no controle da taxa de degradação em função das características dos ambientes fisiológicos.

3 Materiais e Métodos Todos os sais e reagentes foram utilizados em grau analítico e água Milli-Q foi utilizada em todas as soluções. Uma solução de 1% (em massa) de QUI (Sigma-Aldrich, GD=75,6%) foi preparada pela dissolução de 2,5g em 250ml de solução de CH 3 COOH (Sigma) 2% (em massa). Para a solubilização e homogeneização a solução foi agitada magneticamente por um período entre h. Amostras de PVA com diferentes GH e graus de polimerização (referenciados pelo peso molecular- PM) foram gentilmente doados por Celanese Chemicals. As informações relativas ao GH e PM foram obtidos do relatório de especificações técnicas do fornecedor. O hidrogel de PVA foi preparado pela dissolução de 5g de pó do polímero em 100ml de água Milli-Q, sob agitação magnética à temperatura de 70 o C±2 o C. Após a solução ter sido resfriada na temperatura ambiente o ph foi corrigido para 2,00±5 com HCl 1,0M (Sigma). As soluções de misturas de QUI/PVA nas proporções de 25/75; 50/50 e 75/25, bem como, de QUI e PVA puros foram vertidas em placas plásticas e secas a temperatura ambiente por 72h. A reticulação foi realizada pela adição em cada proporção de mistura de 1% e 5% (em massa) de glutaraldeído ou 1,5 pentanodial (Sigma-Aldrich) usado como agente reticulante que foi comprado como solução aquosa 25%. Os filmes apresentaram-se com espessura entre 50µm e 100µm. Nenhum desvio foi observado no que diz respeito a solubilidade, miscibilidade e segregação de fases ao avaliar as proporções de QUI/PVA, ou seja, pode-se afirmar que o sistema formou uma mistura uniforme. A fim de caracterizar a presença de grupos químicos específicos nos materiais e filmes obtidos foi realizada análise de infravermelho (IV) usando os modos de transmitância e ATR (reflexão total atenuada). Os espectros foram obtidos na faixa de número de onda de 4000 a 650cm -1 durante 64 varreduras, com resolução de 2cm -1 (Paragon 1000, Perkin-Elmer, USA). Os espectros de IV foram normalizados e as bandas de vibração foram associadas aos principais grupos químicos. A determinação do grau de desacetilação da QUI foi realizada através de titulação potenciométrica: 0,2g de QUI foi dissolvida em 20ml de solução padronizada de HCl 0,10N e diluída com 10ml de água destilada. Em seguida, sob agitação constante titulou-se a solução com NaOH 1M padronizado, obtendo-se a curva típica de titulação potenciométrica. Padrão de Difração de Raios-X (DRX) foram obtidos das matérias primas e dos filmes produzidos (PHILIPS, PW1710) usando a radiação Kα do cobre com λ=1,54056å. A análise de DRX foi conduzida com 2θ variando de 3,01 a 90 o com passo de 6 o. O padrão de difração do PVA foi analisado com base na estrutura monoclínica para a célula unitária (a=7,81 Å; b=2,52 Å; c=5,51 Å e

4 β=91 o 42 ) [9]. A QUI foi avaliada segundo a estrutura ortorrômbica (a=8,9å, b=10,25å e c=17,0å) e monoclínica com β=88 o [10]. Resultados e Discussão A espectroscopia de IV foi usada para avaliar os grupos químicos dos polímeros (QUI e PVA), bem como, a reticulação dos filmes com glutaraldeído. A Figura 1 apresenta as principais bandas usualmente presentes na QUI, e um espectro típico da mesma. Amida I C=O CH Amina II 1260 Estrutura Sacarídea 3435 N-H C-H 1379 Amina III Amina I C-O Figura 1 Principais bandas de IV e respectivos grupos químicos, e espectro de IV típico da QUI (GD=75,6%) BRUGNEROTTO [11] apresenta um resumo sobre os métodos utilizados atualmente para avaliar o grau de desacetilação de quitina e quitosana onde se verifica a utilização das bandas de referência como sendo as de: 3450cm -1 ; 2878cm -1 ; 1430cm -1 ; 1070cm -1 ; e 1030cm -1 e as bandas características como as de: 1655cm -1 ; 1630cm -1, 1560cm -1, além disso, apresenta as bandas de 1420cm -1 e 1320cm - 1, como de referência e característica, respectivamente. Sugere ainda, que para qualquer GD de quitina ou QUI, a relação de absorbância entre as bandas de 1320cm -1 e 1420cm -1 como sendo as bandas mais estáveis para compostos independentemente da técnica, estado e estrutura secundária. A partir da equação abaixo se obtém o GD de 80,8% com desvio de 6,9% em relação ao valor fornecido pelo fabricante. A A = 0, (100 GD) A Figura 2 apresenta as principais bandas usualmente presentes no PVA e PVAc, e um espectro de IV típico.

5 0, ν as (=C-O-C) 1084 ν(c-o)-c-oh 0, ν (OH...OH) 1329 δ(oh)-c-oh δ(ch)-ch δ(ch)-ch δ(c-c) ν(ch) ν(c=o) Número de Onda (cm -1 ) Figura 2 Principais bandas de IV e respectivos grupos químicos, e espectro típico da PVA (GH=80%) A Figura 3 apresenta o grupo de espectros dos filmes de QUI reticulados. A reticulação química da QUI com o GA ocorre a partir do nitrogênio nucleofílico do grupo amino (-NH 2 ) que reage com o carbono do aldeído, o qual desloca o oxigênio do aldeído e resulta na perda da molécula de água formando assim a ligação C=N ( 1648cm -1 ), base de Shiff. Quando o ph do ambiente da reação é neutro ou alcalino ele facilita a formação do NH 2 ( 1558cm -1 ) da QUI (pka=6,3), que é essencial para a formação da base de Shiff. Em ambiente ácido, entretanto, -NH + 3 (1548cm -1 ) tem mais possibilidade de se formar, pois ele reduz significativamente a nucleofilicidade do nitrogênio, diminuindo a atividade da reação da base de Shiff [6]. a b c d Figura 3 Espectros de IV dos filmes de QUI pura e dos filmes reticulados com 0,5; 1,0 e 5,0% de GA, respectivamente a,b,c e d Semelhante ao obtido por WANG [6] e MONTEIRO Jr. [12], comparando os espectros de FTIR, primeiramente observa-se a banda de 1648cm -1, atribuída à ligação imina (C=N), e a segunda em 1558cm -1 associada à ligação amina(-nh 2 ). Na região de 1720cm -1, relacionada aos grupos aldeídos

6 livres (-COH), não se observa variação com o aumento do teor de GA o que sugere que todo o GA foi ligado à quitosana, possivelmente, em função relação de grupos aminas disponíveis na quitosana e do grupos carbonila do GA. O aumento do teor de GA também causa um aumento na intensidade da freqüência de 1562cm -1 associada às ligações etilênicas; e o mesmo comportamento foi observado na freqüência de 2922cm - 1 relativa ao estiramento dos grupos C-H. Este fato pode ser atribuído ao aumento das contribuições da molécula de GA na reação QUI-GA que promove o aumento na reticulação da cadeia. O aumento da intensidade das bandas relativas à ligação imina também sugere que a reticulação do GA ocorre preferencialmente via base de Shiff no carbono 2 do anel glicossídico em detrimento da ligação com os grupos hidroxilas nos carbonos 3 e 6, as Figura 4, e 5 evidenciam essas observações. Aminas X [GA] 1 0,98 0,96 0,94 0,92 0,9 0,88 0,86 0% 0,50% 1,00% 5,00% [GA] Figura 4 Relação entre a intensidade das bandas relativas ao grupo amina e a concentração de GA Iminas X [GA] 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0% 0,50% 1,00% 5,00% [GA] Figura 4 Relação entre a intensidade das bandas relativas ao grupo imina e a concentração de GA A Figura 5 apresenta a curva de Titulação potenciométrica obtida a partir da solução de QUI. A diferença de volume entre os pontos de inflexão corresponde ao ácido consumido para a protonação

7 dos grupos amina e permite a determinação do GD da quitosana [13]. Após a correção do valor da concentração de NaOH obtém-se o valor de 75,66% para o GD segundo Tan [14]. 12 1,0 10 0,8 ph Titulação Derivada primeira 0,6 0,4 DpH/Dv 2 0, Volume (ml) Figura 5 Relação entre a intensidade das bandas relativas ao grupo imina e a concentração de GA O difratograma da QUI, Figura 6, mostra dois picos, um de alta intensidade em 19,8 o e um de menor intensidade em 37,7 o que evidenciam a parte cristalina e uma ampla faixa abaixo dos picos, variando de aproximadamente 8 o a 80 o, onde predomina a forma amorfa do material. A cristalinidade calculada a partir da relação de áreas entre os picos e o total do gráfico foi de aproximadamente 17%. 1,0 0,8 <2,> QUITOSANA GD=75,6% 16% -18% cristalinidade Intensidade (u.a.) 0,6 0,4 <3,1,4> 0, Θ (graus) Figura 6 Difratograma da QUI com GD de 75,6% O difratograma do PVA GH=80%, Figura 7, apresentou três picos característicos de cristalinidade em 19,35 o (alta intensidade), 22,47 o (menos definido) e 40,28 o (menor intensidade) e uma ampla

8 faixa abaixo dos picos, variando de aproximadamente 10 o a 75 o, onde predomina a forma amorfa do material. A cristalinidade calculada semelhantemente ao descrito acima foi de 23%. 1,0 <1,0,-1> 0,8 Poli(álcool vinílico) GH=80% Sigma Aldrich Intensidade (u.a.) 0,6 0,4 <2,> <2,0,2> cristalinidade 22% - 24% 0, θ(deg) Figura 7 Difratograma do PVA com GH de 80% Na Figura 8 se observa o difratograma de filmes de QUI pura e reticulados com GA. Os filmes de QUI pura, reticulado com 1,0% e 5,0% apresentaram um grau de cristalinidade de 23%, 22% e 18%, respectivamente, o que sugere que o aumento no grau de reticulação diminui o grau de cristalinidade do filme. 1,0 0,9 0,8 Intensidade (u.a.) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 QUI-GA QUI-GA 1,0% QUI-GA 5,0% θ a b c Figura 8 Difratograma do QUI pura e com [GA] de 1,0% e 5,0%, a, b e c respectivamente Conclusões A incorporação do glutaraldeído alterou a cristalinidade da quitosana, sugerindo que o aumento da reticulação diminui o grau de cristalinidade do filme.

9 Na análise do espectro de infravermelho, o aumento na intensidade da banda de iminas e o decréscimo da intensidade na banda de amina sugere que a reticulação da quitosana pelo glutaraldeído ocorre preferencialmente no carbono 2 através da formação de base de Schiff. A estrutura cristalina obtida a partir dos dados de DRX é muito semelhante e o grau de cristalinidade obtido pelo DRX e o IV é muito similar (22% e 23% respectivamente). O resultados também apresentam forte evidência de que controlando o PVA e a QUI, como precursores, associado a reticulação química é possível obter híbridos orgânico-orgânico, naturalsintético, para aplicações biomédicas no tratamento de lesões. Agradecimentos O autores agradecem o suporte financeiro do CPGEM/UFMG, CAPES e FAPEMIG/Brasil. E. S. Costa Jr. também agradece ao CEFET-MG as horas investidas neste trabalho. Referências Bibliográficas 1. J. L. Drury; D. J. Mooney Biomaterials 2003, 24, J. Berger; M. Reist; J. M. Mayer; O. Felt; R. Gurny Euro. J. Pharm. Biopharm. 2004,57, J. K. F. Suh; H. W. T. Matthew Biomaterials 2000, 21, A. A. P. Mansur; H. S. Mansur in Anais do 8 o Congresso Brasileiro de Polímeros,2005, Vol. 1, W. Lin; D. Yu; M. Yang Colloids an Surfaces B:Biointgerfaces 2006, 47, T. Wang; M. Turhan; S. Gunasekaran Polym. Int. 2004, 53, A. P. Rokhade; S. A. Patil; T. M. Aminabhavi Carbohydrate Polymers 2007, 67, M. M. Beppu; E. J. Arruda; C. C. Santana Polímeros 1999, Out/Dez, C. W. Bunn Nature 1948, 4102, G. L. Clark; A. F. Smith J. Physical Chemistry 1936, 40, J. Brugnerotto; J. Lizardi; F. M. Goycoolea; W. Argüelles-Monal; J. Desbrières; M. Rinaudo Polymer 2001, 42, O. A. C. Monteiro Jr.; C. Airoldi Inter. J. Biological Macromolecules 1999, 26, A. Tolaimte; J. Desbrères; M Rhazi; A. Alagui; M. Vincendon; P Vottero Polymer 2000, 41, S. C. Tan; E.Khor; T.K. Tan; S. M. Wong Talanta 1998, 45, 713.