PRODUÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA BETA-CICLODEXTRINA, UTILIZANDO COMO SUBSTRATO O AMIDO DE MILHO

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1 PRODUÇÃO, SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA BETA-CICLODEXTRINA, UTILIZANDO COMO SUBSTRATO O AMIDO DE MILHO Tiago A. Balbino 1, Henrique S. Ferrari 2, Luiza P. V. Calsavara 3, Gisella M. Zanin 4 1 Bolsista de Iniciação Científica, discente do curso de Engenharia Química/UEM 2 Discente do curso de Engenharia Química/UEM 3 Discente do curso de doutorado em Engenharia Química/UEM 4 Professor da Engenharia Química da UEM 1,2,3,4 Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Engenharia Química, Av. Colombo 79, Bloco D-9, Maringá-PR, Brasil, CEP: 872-9, Fone , Fax gisella@deq.uem.br RESUMO - As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos produzidos pela ação da enzima ciclomaltodextrina-glucano-transferase (CGTase) sobre o amido, sendo possível obter ciclização de seis, sete ou oito unidades de glicose, originando α, β e γ-cd. Visando aumentar o rendimento na produção da β-cd, estudou-se a influência: da temperatura de reação (6 e 7 C); da quantidade de etanol no substrato (; ; 1 ou 1 %) e da concentração da enzima CGTase (,;,1 ou,2%). Os experimentos foram conduzidos em ph 6, com amido 1% m/v, em reator batelada sob agitação magnética, com volume reacional de 1 ml. As condições ideais foram: 6 C, 1% de etanol e,1% de enzima CGTase, alcançando-se uma concentração em β-cd da ordem de 2 mm. A atividade específica da enzima foi igual a 19,6 U/mg de proteína. Para aumentar a pureza do precipitado contendo as CDs, empregou-se a enzima amiloglicosidase e em seguida carvão ativado. Nesse processo, para um volume de reação de 2 ml obteve-se 3, g de precipitado com 6,4% de pureza, enquanto no experimento sem a utilização da enzima e do carvão obteve-se 3, g com 8,3% de pureza, concluindo-se que não foi vantajosa a utilização dessa enzima na purificação da β-cd. Palavras-Chave: ciclodextrina, amido, etanol. INTRODUÇÃO As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos formados por moléculas de D-glicose unidas por ligações glicosídicas, produzidas pela ação da enzima ciclomaltodextrina-glucano-transferase (CGTase) sobre o amido. As CDs mais conhecidas são as α, β e γ-ciclodextrinas, constituídas por 6, 7 e 8 unidades de glicose, respectivamente. Elas apresentam uma estrutura tridimensional com um exterior hidrófilo e uma cavidade hidrófoba, que possibilita a formação de complexos de inclusão hidrossolúveis com uma grande variedade de moléculas, alterando suas propriedades físicas. A inclusão normalmente aumenta a estabilidade das moléculas inclusas contra a hidrólise, oxidação, fotodecomposição e desidratação, diminuindo odor e sabor desagradáveis da substância, aumentando sua solubilidade e biodisponibilidade. Essas propriedades criam a oportunidade para muitas aplicações industriais das CDs em alimentos, cosméticos, fármacos, produtos agrícolas, separações cromatográficas, processos biotecnológicos e muitas outras (Szejtli, 199; Sá Barreto e Cunha-Filho, 28). A produção de CDs é complicada por vários fatores que influenciam o processo, como, por exemplo: a cinética enzimática extremamente complexa; rendimentos muito baixos; produtos da reação de difícil separação; inibição da enzima por oligossacarídeos de baixa massa molecular e por determinados íons e outras substâncias orgânicas (Dominguez et al., 27). O etanol pode ser utilizado na produção de CDs, por ser praticamente inofensivo e um aditivo que pode facilmente ser evaporado e reutilizado. Além disso, sua presença previne contaminações microbianas durante o processo. O etanol exclui moléculas de água do centro ativo da enzima, prevenindo reações hidrolíticas, bem como as reações reversas, e desta forma retarda a decomposição da CD formada. O efeito do etanol é mais pronunciado para concentrações mais altas do amido, no entanto, para concentrações de etanol acima de 2% um decréscimo abrupto no rendimento de CDs foi verificado, possivelmente por desnaturação da enzima (Mattsson et al., 1991). VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 3 de julho de 29 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 Visando à produção, separação e purificação da β-cd, estudou-se a sua produção a 6 e 7 C; a influência da concentração de etanol (; ; 1 ou 1% v/v) e da enzima CGTase (,;,1 ou,2% v/v) no meio reacional. Para a obtenção da β-cd na forma cristalizada, comparou-se os processos em que se utilizou ou não a enzima amiloglicosidase (AMG) e o carvão ativado. MATERIAIS E MÉTODOS O substrato empregado foi o amido de milho comercial Maizena. As enzimas CGTase (Toruzyme 3. L) e amiloglicosidase (AMG 2L) foram doadas pela Novozymes (Dinamarca). Como padrão de dosagem, foi utilizada a β-cd fornecida pela Sigma. Durante o desenvolvimento da pesquisa foram usados os seguintes equipamentos: Balança semi-analítica METTLER PM 4; Balança analítica BEL, Agitador magnético FANEM 27; Agitador de tubos PHOENIX AP 6; Espectrofotômetro UV-123 SHIMADZU; medidor de ph TEC-2 TECNAL; Reator batelada, com banho termostatizado TE 184 TECNAL; Ultra-centrífuga JOUAN GR 2.22; Agitador magnético com aquecimento IKA RH basic KT/C; agitador orbital termostatizado TECNAL TE-422. Com base na literatura consultada (Tardioli et al., 26; Domingues et al., 27), os experimentos foram conduzidos em reator batelada tampado, de 1 ml, sob agitação magnética, com 1% m/v de amido tamponado com 1% v/v de citrato de sódio 1 mm ph 6. Somente para os experimentos de cristalização da β-cd, utilizou-se o volume de reação de 2 ml para a produção de CDs. Para todos os experimentos descritos nesse trabalho, as amostras coletadas, de 1 ml, foram acrescentadas a 1 ml de solução de ácido clorídrico,2 N e levadas ao banho fervente por minutos para inativar a enzima Toruzyme. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 4 C e. x g por 1 minutos e seu sobrenadante diluído e dosado pelo método colorimétrico da fenolftaleína (MCFE) a nm, que é seletivo para a β-cd (Tardioli et al., 26). Temperatura de reação Inicialmente foram realizados ensaios de produção de CDs a 6 e 7 C. Essas duas temperaturas foram escolhidas para teste, pois a temperatura ótima para essa enzima é de 8-9 C (Tardioli et al., 26), mas de acordo com Swinkels (198), 9% do amido de milho é gelatinizado a 72 C. Kim et al. (1977), empregando amido de várias procedências, observaram que a pureza do produto, após separação do amido não reagido, foi maior quando empregaram temperaturas abaixo de 7 C, pois não havia destruição da estrutura do amido. Assim, os experimentos foram conduzidos em ph 6,, com amido 1 % m/v, etanol 1% v/v e enzima CGTase,1% v/v. Concentração de Etanol e Enzima na Reação Definida a temperatura de trabalho, inicialmente fixou-se a concentração de enzima em,1% v/v e variou-se a concentração de etanol no substrato (; ; 1 ou 1% v/v). Em seguida, utilizando-se a concentração de etanol selecionada, variou-se a concentração de enzima (,;,1 ou,2% v/v). O teor de proteína da enzima foi determinado pelo método de Bradford (1976), sendo de,6 mg de proteína/ml de enzima. Atividade Específica da Enzima Nas curvas de progresso da maioria das reações enzimáticas, a velocidade de reação diminui com o tempo, por fatores tais como inibição pelo produto, desativação pela temperatura e ph, dentre outros. Uma vez que no início da reação esses fatores não tiveram tempo de se manifestar e as condições são exatamente conhecidas, a atividade enzimática pode ser determinada a partir da velocidade inicial de reação. Para se obter a velocidade inicial é necessário apenas determinar a primeira parte da curva de progresso da reação e traçar uma tangente a ela a partir da origem. As curvas, na maioria dos casos, são praticamente lineares desde que a conversão de substrato em produto não exceda 2% (Dixon e Webb, 1979). Para determinar a atividade da enzima CGTase pelo método das velocidades iniciais, preparou-se 1 ml de suspensão de amido na concentração de 1% m/v, contendo 1 ml de etanol e 1 ml de tampão citrato de sódio ph 6,. Acrescentou-se,1 ml da enzima CGTase, seguindo os procedimentos já descritos para a reação e amostragem. A reação foi acompanhada por 9 minutos, com amostras coletadas nos tempos: 1, 2, 3, 4,, 6 e 9 minutos. Essas amostras foram analisadas pelo MCFE. Com os dados obtidos, foram feitas curvas de concentração de CD em função do tempo de reação, tomando-se o coeficiente angular do intervalo linear e calculando-se a atividade enzimática da CGTase usando-se a Equação 1. Define-se uma Unidade de Atividade Enzimática Internacional (U) como a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micromol de substrato, ou a formação de 1 micromol de produto por minuto, nas condições de ensaio: temperatura, ph, concentração de substrato, etc. Assim, a produção de 1 micromol de CD por minuto, nas condições descritas, equivale a uma Unidade de Atividade Enzimática Internacional (U) para a enzima CGTase e a Equação 1 fornece a atividade específica, que é o

3 número de Unidades de Atividade por mg de enzima. A ( C / t) V R E= (1) VE C P Na qual: A E = atividade específica (U/mg) da enzima; C P = concentração de proteínas da preparação líquida comercial de CGTase (mg/ml) V R = volume reacional (ml); V E = volume de enzima utilizada (ml); C/ t = coeficiente angular da região linear na curva (mm/min); Separação da β-cd por Precipitação Para a separação da β-cd por precipitação, conduziu-se um ensaio de produção de CDs por 12 horas, com volume de reação de 2 ml, nas condições ideais já definidas. O sobrenadante, separado do meio reacional por centrifugação (4 C, 2 minutos, 12 x g), foi acidificado com solução de HCl até ph 3 e mantido por 1 minutos a 8 C para inativação da CGTase. A solução foi então resfriada à temperatura ambiente e alcalinizada com solução de NaOH até ph 4,. Com a finalidade de transformar em glicose os oligossacarídeos remanescentes na solução, adicionou-se,2 ml de amiloglicosidase mantendo-se em agitação por 3 horas a C, e após essa etapa, adicionou-se g de carvão ativado, deixando-se durante 1 hora a 4 C em um agitador orbital termostatizado. A solução foi filtrada, centrifugada (4 C, 2 minutos, 12 x g) e o sobrenadante foi mantido a 8 C até redução do volume a 1/3. Em seguida, essa solução foi resfriada gradativamente (1 C/h) até 2 C, sob agitação magnética, permanecendo nessa temperatura por aproximadamente 12 horas. Em seguida, a solução foi mantida em um banho termostático a 1 C, sem agitação, por 1 horas. A lenta redução da temperatura teve por objetivo, garantir que os núcleos de cristais fossem formados de forma adequada, melhorando a qualidade desses cristais. Após centrifugação (1 C, 3 minutos, 12 x g), o precipitado foi mantido em estufa a C por 12 horas, macerado em um gral de porcelana, peneirado (42 µm) e novamente mantido em estufa a 8 C por 12 horas para retirar a umidade. Foi preparada uma solução de 1 mm (1,13 g) com os cristais obtidos, para ser analisada pelo MCFE. RESULTADOS E DISCUSSÃO Temperatura de reação Na Figura 1, observa-se que para 12 horas de reação, a produção de β-cd alcançou 17 mm para as duas temperaturas testadas. Após 24 horas, aumentou para 18 mm a 6 C e para 21 mm a 7 C. Apesar do rendimento um pouco maior a 7 C, o amido não reagido não era bem separado por centrifugação nessa temperatura, provavelmente por ocorrer ruptura na estrutura do amido. Assim, optou-se pela temperatura de 6 C C 7 C Figura 1 Produção de β-cd a 6 C e a 7 C, com amido de milho 1% m/v, ph 6, 1% v/v de etanol e,1% (v/v) de enzima. Concentração de Etanol e Enzima na Reação Na Figura 2 são apresentados os resultados obtidos com a variação da concentração de etanol no meio reacional. Observa-se uma maior produção de β-cd para as concentrações de etanol de 1 e 1% v/v, sendo de aproximadamente 24 mm nesse experimento. Como não houve uma diferença significativa no aumento da produção para a concentração de 1 % de etanol, optou-se pela concentração de 1 % de etanol Etanol (% v/v): Figura 2 Efeito de diferentes concentrações de etanol na produção de β-cd, utilizando-se amido de milho 1% m/v, a 6 C, ph 6 e,1% v/v de enzima. Para o volume de etanol selecionado, que foi de 1% v/v, observa-se pelos resultados apresentados na Figura 3, que a concentração de,1% v/v de enzima é a mais vantajosa, pois empregando-se o dobro da enzima (,2%), houve

4 um aumento na produção de β-cd de apenas % após 12 horas de reação e 9,2% após 24 horas. Quanto à concentração de,% v/v, obteve-se um rendimento baixo, com dificuldades na agitação, devido à maior viscosidade da suspensão do substrato ocasionada pela reação mais lenta. β-cd (mm) Enzima (% v/v): 1,,1, Figura 3 Produção de CDs com amido de milho 1% m/v, a 6 C, ph 6, 1% de etanol, variando-se a concentração de enzima. Atividade Específica da Enzima Para o cálculo da atividade específica da CGTase para a β-cd, foi tomado o coeficiente angular obtido a partir da reta ( C/ t) da Figura 4 e aplicado na Equação 1. A atividade específica da enzima foi igual a 19,6 U/mg de proteína y =,116x -,362 R 2 =, Tempo (min) Figura 4 Produção de β-cd com grânulos de amido de milho 1% m/v, a 6 C, ph 6, 1% v/v de etanol e,1% v/v de enzima. Separação da β-cd por Precipitação Os resultados referentes à precipitação da β-cd produzida, para um volume reacional de 2 ml, sem a utilização da amiloglicosidase (AMG) e do carvão ativado e com a utilização dos mesmos, são apresentados na Tabela 1. No experimento em que a precipitação foi realizada após a inativação da CGTase, na ausência da AMG e do carvão, obteve-se 3, g de precipitado com 8,3% de pureza. Com a utilização da AMG e do carvão, obteve-se 3, g de precipitado com 6,4% de pureza; houve uma coprecipitação de glicose e os cristais formados eram aparentemente mais brancos. Concluiu-se que não foi vantajosa a utilização dessa enzima na purificação da β-cd, já que a pureza do precipitado teve um aumento de apenas 7,13%. Tabela 1 Obtenção da β-cd por precipitação, na presença ou ausência da enzima AMG,1% v/v e carvão ativado 2% m/v. AMG e Carvão Sem Com Precipitado obtido (g) 3, 3, β-cd (%) 8,29 6,42 β-cd (g) 2,4 1,96 Glicose (g), Rendimento de β-cd em relação ao amido (%),44,23 CONCLUSÕES As condições ideais para a produção de β- CD com 1% m/v de amido de milho, no ph 6, foram: 6 C, 1% v/v de etanol e,1% v/v de enzima TORUZYME, alcançando uma concentração da ordem de 2 mm. A atividade específica da CGTase para a formação de β-cd nessas condições é de 2,6 U/mg de proteína. A utilização da enzima AMG não foi vantajosa, pois ocorreu a precipitação, juntamente com a β-cd, da glicose formada por essa enzima. Já a utilização do carvão ativado tornou o precipitado aparentemente mais branco, podendo portanto, ser utilizado na purificação da β-cd. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRADFORD, M. M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding, Analytical Biochemistry, 72, DOMINGUES, M. V. J.; ONISHI, V. C.; BOSSONI, M. T. A.; MORAES, F. F. de, 27. Produção de ciclodextrinas com grânulos de amido em presença de etanol, Anais do VII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica, São Carlos-SP (publicado em CD-ROM). DIXON, M., WEBB, E. C., Enzymes, 3 rd ed., London, Longman Group Limited, capítulos 2 e 4. KIM, T. J.; KIM, B. C., LEE, H. S., Production of cyclodextrins using raw corn starch without a pretreatment, Enzyme Microbial Technology, 2, 6-9. MATTSSON, P.; KORPELA, T.; PAAVILAINEN, S.; MÄKELLÄ, M., Enhanced conversion of starch to cyclodextrins in ethanolic solutions by Bacillus circulans var

5 alkalophilus cyclomaltodextrin glucanotransferase, Applied Biochemistry and Biotechnology, 3, SÁ BARRETO, L. C. L.; CUNHA-FILHO, M. S. S., 28. Ciclodextrina: importante excipiente farmacêutico funcional, Latin American Journal of Pharmacy, 27, n. 4, SWINKELS, J. J. M., 198. Sources of starch, its chemistry and physics. In: VAN BEYNUM, G. M. A. and ROELS, J. A. Starch conversion technology. Delft, The Netherlands. Marcel Dekker, Inc., New York, 1-4. SZEJTLI, J., 199. The cyclodextrins and their applications in biotechnology. Carbohydrate Polymers, 12, n. 4, 37. TARDIOLI, P. W., ZANIN, G. M., MORAES, F. F., 26. Characterization of Thermoanaerobacter cyclomaltodextrin glucanotransferase immobilized on glyoxylagarose, Enzyme and Microbial Technology, 39, AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq, à UEM e à Fundação Araucária pelo apoio financeiro e à NOVOZYMES pelo fornecimento das enzimas.