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1 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 1/6 UM MÉTODO SIMPLES PARA A OBTENÇÃO DE β-glucana EM CÉLULAS DE LEVEDURAS LIVRES DE GLICOGÊNIO Ferreira, T. F. 1*, Coelho, M. A. Z. 2 e Rocha-Leão, M. H. M. 2 1 Aluna (Instituto de Química UFRJ), 2 Orientadoras (Escola de Química UFRJ) tatianaiq@yahoo.com.br; mhrl@eq.ufrj.br RESUMO - Neste trabalho, estudou-se em diferentes temperaturas a cinética de degradação de glicogênio, β-glucana e trealose respectivamente, por uma preparação comercial de amiloglicosidase fúngica, contendo glucanase e trealase como impurezas, visando a redução total ou parcial destes sacarídeos in situ. Com base nos resultados obtidos com os sacarídeos de origem comercial, estabeleceram-se condições de tempo e temperatura para atuação de cada enzima presente na preparação enzimática sobre células íntegras e permeabilizadas. Células permeabilizadas com etanol tornaram-se livres de trealose através de sucessivas lavagens intercaladas por centrifugação. Estas células submetidas à ação da preparação enzimática comercial a 65ºC/3 min seguida de ação a 57ºC/2h, e posterior incubação com Na 2 CO 3,125 M a 1ºC/3h mostram que 1% do glicogênio e 7% de β-glucana são degradados. Mas, quando nestas condições se substituiu a etapa de aquecimento em meio básico por abrasão com pérolas de vidro, 1% do glicogênio e 4% de β-glucana foram degradados. Esta estratégia pode ser utilizada na produção de células permeabilizadas livres de trealose e de glicogênio contendo β-glucana parcialmente hidrolisada, mais solúvel e mais bioativa, para incorporação na íntegra como aditivo em alimentos, ou como etapa inicial no processo de produção de β-glucana a partir de levedura. INTRODUÇÃO β-glucana é um polissacarídeo de unidades glicosídicas altamente insolúvel que ocorre na natureza como componente da parede celular de vários vegetais. É o principal componente da parede celular das células de S. cerevisiae onde se apresenta na forma de uma malha fibrosa e por isso conferelhes alta resistência mecânica. É recomendada na dieta humana por apresentar inúmeras propriedades bioativas. É imunoestimulante e reduz o nível de glicose na corrente sanguínea. Quando ingerida parcialmente hidrolisada, i.e. microparticulada, é mais facilmente absorvida pelo organismo e seus efeitos mais apreciados (Park et al., 23). O glicogênio é um polissacarídeo de unidades glicosídicas ligadas por ligações do tipo alfa e, devido ao seu elevado peso molecular e maior ocorrência no espaço periplásmico em células de S. cerevisiae ligado covalentemente à β-glucana, é também bastante insolúvel. Portanto, nestas células ambos são componentes de uma estrutura supramolecular insolúvel sendo por isso de difícil extração, fracionamento e purificação (Zlatkovic et al., 23). No Brasil, são geradas cerca de 11 milhões de toneladas por ano de células de leveduras como subprodutos das indústrias de alimentos e alcooleira.

2 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 2/6 Devido à presença de inúmeras substâncias bioativas estas células possuem alto valor nutricional. Mas a degradação da parede celular e a separação dos compostos bioativos presentes na parede ou no interior das células são processos ainda desafiantes. No entanto, substâncias intracelulares de baixo peso molecular são facilmente obtidas após permeabilização das células com solvente orgânico e vigorosa agitação (Serrano et al.,1973). Nestas condições, as membranas do citoplasma e das organelas celulares são rompidas desfazendo-se assim a barreira de permeabilidade celular. As células permeabilizadas após centrifugação podem ser comparadas a partículas micrométricas de materiais poliméricos encapsulados, onde o material de revestimento é a parede celular e o núcleo as macromoléculas intracelulares. Determinou-se neste trabalho as melhores condições de tempo e temperatura de ação da amiloglicosidase, capaz de hidrolisar ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6, da glucanase, que rompe ligações β-glicosídicas, e de trealase, reponsável pela quebra das ligações glicosídicas α-1,1, todas presentes em uma preparação enzimática comercial de amiloglicosidase fúngica de Rhizopus sp. (SIGMA). O objetivo deste trabalho reside em estabelecer um procedimento para obtenção de células permeabilizadas, acessíveis à ação da glucanase, livres de glicogênio, contendo β-glucana parcialmente digerida, sem o emprego de métodos prévios de fracionamento das macromoléculas celulares. Estas estruturas podem ser utilizadas na íntegra para agregar β-glucana a alimentos industrializados, mais ainda empregando-se uma preparação enzimática economicamente viável. MATERIAIS E MÉTODOS Cinética de Hidrólise dos Sacarídeos Glicogênio (1, mg/ml), Trealose (1, mg/ml) e Glucana (,25 mg/ml) foram incubados isoladamente com amiloglicosidade fúngica de Rhizopus (28 U/mL) em tampão acetato,2m (ph 4,8). Alíquotas de 2 μl de cada solução contendo glicogênio, glucana ou trealose foram incubadas com 5 μl de ácido acético 3M, 7 μl de tampão acetato,2m (ph 4,8) e 5 μl da preparação enzimática a 37, 57, 65 e 75 C, respectivamente. Alíquotas foram retiradas ao longo dos experimentos com intervalos de tempo que dependiam da atividade de cada enzima presente na preparação enzimática. Em seguida uma alíquota de 2 μl da solução contendo uma mistura de glicogênio e glucana foi incubada com 5 μl do ácido acético 3M, 7 μl de tampão acetato,2m (ph 4,8) e 5 μl da preparação enzimática. Este ensaio foi incubado a 65ºC/1h e, em seguida, a glicose foi quantificada. A temperatura foi reduzida a 57ºC/2h e a glicose novamente quantificada. Em seguida a temperatura foi reduzida a 37ºC e após 2 horas de incubação a glicose foi mais uma vez quantificada. Paralelamente foi conduzido um ensaio de incubação a 57ºC/2h e a glicose quantificada. Em todos os ensaios a glicose liberada foi quantificada pelo método da glicose oxidase (In vitro Diagnóstica). Os sacarídeos de grau analítico e a preparação enzimática usados neste trabalho foram provenientes da SIGMA. Condições de Cultivo A cepa diplóide utilizada Saccharomyces cerevisiae foi obtida por cruzamento das cepas haplóides reg1 e hxk1.hxk2 gentilmente cedidas pelo Depto. Bioquímica/IQ/UFRJ. As células foram estocadas em meio semi-sólido YPD (1% de extrato de levedo, 2% de peptona, 2% de glicose) a 4 C. Para proliferação, as células foram inoculadas

3 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 3/6 em frascos de 5 ml contendo 1 ml de meio líquido YPD e incubadas a 28 C em agitador a 16 oscilações/min. Após proliferação por 24 horas uma alíquota contendo aproximadamente 1 mg p.s. de células foi retirada e centrifugada para posterior permeabilização. Permeabilização Celular 1 mg de células foram suspensas em 5 ml de tampão acetato 75 mm (ph 4,8), adicionou-se,2 ml de etanol e agitou-se em vórtex / 5 min. Para liberação da trealose o procedimento foi realizado em cinco ciclos de agitação em vórtex / 2 min. com intervalos de 5 minutos entre cada ciclo. As células permeabilizadas, lavadas e esvaziadas de material de baixo peso molecular foram centrifugadas a 4 rpm / 3 min. O resíduo da centrifugação foi suspenso em 5 ml de tampão acetato,2 M (ph 4,8) para posterior ensaio com amiloglicosidase comercial. Homogeneizado livre de células: Obtido por desintegração celular com pérolas de vidro - Alíquotas de 75 μl da suspensão de células permeabilizadas foram incubadas com 1,5 g de pérolas de vidro. A suspensão foi submetida a três ciclos de 1 min. de agitação em vórtex com intervalos de 1 min. para resfriamento da suspensão em banho de gelo. Obtido por incubação das células em meio básico e aquecimento - Alíquotas de 75 μl da suspensão de células permeabilizadas, centrifugadas e lavadas foram suspensas em Na 2 CO 3,125M e incubadas a 1ºC / 3h. Hidrólise dos sacarídeos presentes na parede celular: Tanto as células obtidas por desintegração com pérolas de vidro como as obtidas com a incubação em meio básico foram submetidas à ação da preparação enzimática. 15 mg de células foram incubadas com 5 μl do ácido acético 3M, 9 μl de tampão acetato,2m (ph 4,8) e 5 μl da preparação enzimática 7% mais concentrada capaz de hidrolisar todo o glicogênio a 65ºC / 3 min. (levou-se em consideração o erro proveniente da dosagem de uma pequena porcentagem da β-glucana). A temperatura foi então reduzida a 57 C / 1h para a degradação parcial da glucana. Ensaio controle: Células íntegras foram suspensas em Na 2 CO 3,25 M e incubadas a 1ºC/ 1,5 h (Rocha-Leão et al., 23). A seguir, 15 mg de células foram incubadas com 5 μl de ácido acético 3M, 9 μl de tampão acetato,2m (ph 4,8) e 5 μl da preparação enzimática 7% mais concentrada capaz de hidrolisar todo o glicogênio a 65ºC / 3 min (levou-se em consideração o erro proveniente da dosagem de uma pequena porcentagem da β-glucana). A conversão total de glucana foi obtida a 57ºC / 2h, e a conversão total de trealose foi obtida a 37ºC / 2h tanto no sobrenadante da permeabilização quanto nas células permeabilizadas como trealose residual. Obtenção das imagens: As imagens foram produzidas usando-se microscópio óptico modelo E2 (NIKON) acoplado a uma câmera digital (NIKON 3,3 Mega Pixels) de resolução. As fotos foram obtidas em campo claro utilizando um aumento de 1 vezes. RESULTADOS E DISCUSSÕES A Figura 1 mostra que nas temperaturas de 37 e 57ºC, todo o glicogênio é hidrolisado. A 65ºC a amiloglicosidase só é capaz de hidrolisar cerca de 6% do glicogênio, enquanto que a 75ºC, a inativação da enzima ocorreu em torno de 15 minutos de incubação e nestas condições 4% do glicogênio é convertido em glicose. A Figura 2 indica que a trealose é totalmente convertida a 37ºC. Porém, a 57ºC a trealase só é capaz de hidrolisar 15% desse sacarídeo. Nas temperaturas mais elevadas a trealase encontra-se

4 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 4/6 inativa e não há aparecimento de glicose no meio. A Figura 3 apresenta os dados obtidos para a β-glucana, que é totalmente hidrolisada a 37ºC. Observa-se 5% de hidrólise deste sacarídeo a 57ºC e a 65ºC somente 9%. A 75ºC a glucanase encontra-se totalmente inativa. Concentração (mg/ml) 1,2 1,8,6,4, tempo (min) 37ºC 57ºC 65ºC 75ºC Figura 1: Cinética de degradação de glicogênio comercial a diferentes temperaturas Concentração (mg/ml) Concentração(mg/mL) 1,2 1,8,6,4,2 57ºC 37ºC 65 e 75ºC tempo (horas) Figura 2: Cinética de hidrólise de trealose comercial a diferentes temperaturas,3,25,2,15,1, tempo (horas) 57ºC 37ºC 65ºC 75ºC Figura 3: Cinética de hidrólise de β-glucana comercial a diferentes temperaturas Com base nos resultados obtidos nos experimentos de cinética de hidrólise dos três sacarídeos isoladamente e da mistura β-glucana / glicogênio em diferentes temperaturas (Tabelas 1 e 2), foi estabelecido um procedimento objetivando acesso de amiloglicosidase, glucanase e trealase aos seus respectivos substratos presentes nas células e para degradação de glicogênio, β-glucana e trealose in situ. As células foram inicialmente permeabilizadas e lavadas para liberação de trealose. Estas células foram divididas em duas frações. Uma fração foi incubada com Na 2 CO 3,125 M a 1ºC/ 3h. A outra fração foi submetida à homogeneização com pérolas de vidro. Em seguida ambas as frações foram incubadas com a preparação enzimática para degradação total de glicogênio e parcial de β-glucana. O sobrenadante obtido na etapa de permeabilização foi igualmente submetido à ação da preparação enzimática para hidrólise total da trealose. Tabela 1: Ação da preparação enzimática sobre a mistura de glicogênio e glucana comerciais a diferentes temperaturas. Temperatura (ºC) T(h) % hidrólise % glicogênio % glicogênio 5% β-glucana % glicogênio 1% β-glucana Tabela 2: Ação da preparação enzimática sobre a mistura de glicogênio e β-glucana comerciais a 57ºC. Temperatura (ºC) T(h) % hidrólise % glicogênio 5% β-glucana Verificou-se que após a aplicação do método, as células submetidas a homogeneização com pérolas de vidro se encontram livres de todo glicogênio e de mais de 9% da trealose. Além disso, têm aproximadamente 4% de sua glucana hidrolisada (Tabela 3). Nas

5 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 5/6 células tratadas em meio básico, a porcentagem de glucana hidrolisada caiu para aproximadamente 7% (Tabela 4). O ensaio controle mostra a composição desses sacarídeos nas cepas utilizadas (Tabela 5). Tabela 3: Células permeabilizadas e tratadas com pérolas de vidro mg de glicose/mg de células Glicogênio,13 β-glucana,46 Trealose,14 residual Tabela 4: Células permeabilizadas e tratadas com Na 2 CO 3,125 M/3h mg de glicose/mg de células Glicogênio,13 β-glucana,8 Trealose,14 Residual Tabela 5: Células íntegras mg de glicose/mg de células Glicogênio,13 β-glucana,12 Trealose,15 As Figuras 4, 5 e 6 mostram que a permeabilização esvazia as células de material intracelular e que as forças de cisalhamento decorrentes do contacto abrasivo da parede das células permeabilizadas com as pérolas de vidro promove a formação de estruturas fibrosas. Mais ainda, que a ação das enzimas da preparação enzimática sobre o glicogênio e, principalmente sobre a β- glucana das células permeabilizadas, alterou significativamente a morfologia da parede celular provavelmente tornando estas células mais porosas. Trabalhos futuros mostrando imagens obtidas com microscopia eletrônica de transmissão poderão comprovar o aumento da porosidade da parede celular obtida nas condições experimentais desenvolvidas neste trabalho. Figura 4: Células íntegras (1x) Figura 5: Células permeabilizadas e tratadas com pérolas de vidro (1x) Figura 6: Células permeabilizadas após ação da preparação enzimática (1x) CONCLUSÕES Neste trabalho, a estratégia de uso da ação da preparação enzimática comercial de amiloglicosidade fúngica aplicada a células permeabilizadas em diferentes tempos e temperaturas se mostrou eficaz para produção de células permeabilizadas livres de glicogênio e de 9% de trealose, porém constituídas de β-glucana parcialmente hidrolisada. Este sistema pode ser usado, na íntegra ou

6 VI Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 6/6 como matéria-prima para obtenção de β- glucana solúvel, ambos como aditivo em alimentos industrializados. Mais ainda, com base na observação de que há glucanase e trealase ativas na preparação enzimática comercial de amiloglicosidase fúngica, paralelamente estabeleceu-se um procedimento simples de quantificação de glicogênio, β-glucana e trealose em células de S. cerevisiae sem necessidade de fracionamento prévio das três substâncias. Tal fato significa que é também proposta uma nova metodologia que evita perdas nas etapas de extração e purificação dos polissacarídeos. A observação ao microscópio das diversas amostras obtidas mostra claramente a eficiência do método usado. REFERÊNCIAS ROCHA-LEÃO M.H.M., COELHO M.A.Z. e ARAÚJO O.Q.F. (23), Impact of the reg1 mutation on glycogen accumulation and glucose consumption Rates in S. cerevisiae cells based in a macro kinetic model., Braz.J.Chem.Eng, vol.2 n 3 p PARK, Y. K.; IKEGAKI M.; ALENCAR, S. M. e AGUIAR, C. L. (23), Determinação da concentração de β- glucana em cogumelo Agarius blazei muril por método enzimático., Ciência e Tecnologia de Alimentos, vol.23 nº3. p SERRANO, R.; GANCEDO, J. M. e GANCEDO, C.(1973), Assay of Yeast Enzymes in situ. Eur.J.Biochem, vol.61, p ZLATKOVIC, D. ;JAKOVLJEVIC, D.; ZEKOVIC, D. and VRVIC, M. M. (23), A glucan from active dry Baker s yeast (Saccharomyces cerevisiae): A chemical and enzymatic investigation of the structure. J.Serb.Chem.Soc,. vol.68, p AGRADECIMENTOS Ao CNPq, pelo financiamento. Aos queridos colegas do laboratório E113, pela compreensão e paciência.