Seleção de primers de marcadores ISSR para análises genéticopopulacionais de plantas medicinais do Cerrado

Transcrição

1 Seleção de primers de marcadores ISSR para análises genéticopopulacionais de plantas medicinais do Cerrado Jéssica Cristtinny Oliveira de Sousa (PBIC), Flávia Melo Rodrigues (Orientadora) Universidade Estadual de Goiás UnUCET, , Brasil Palavras-Chave: ISSR, marcador, plantas medicinais, savana. 1 INTRODUÇÃO O Brasil possui a mais diversificada flora do mundo, com cerca de espécies vegetais superiores (FRANCE, 1977). O Cerrado é um bioma que chama atenção em termos de diversidade e endemismo de sua flora. Muitas espécies vegetais são utilizadas pelas comunidades locais para os mais diversos fins, se tornando uma alternativa de renda e alimentação humana e de animais, algumas com comprovado uso medicinal. Entretanto, o uso tem sido feito, em muitos casos, de forma indiscriminada causando perdas sem que se saibam sequer quais as espécies estão desaparecendo (PAIVA et al. 2006). A diversidade biológica pode ser compreendida em três níveis: a diversidade de ecossistemas, a diversidade de espécies dentro de um ecossistema e a diversidade genética dentro das espécies (WALTER, 2000). Para a existência da biodiversidade, o componente genético é fundamental para a evolução de toda e qualquer espécie (SOLÉ-CAVA, 2001). À medida que o tamanho das populações animais e vegetais diminui, a perda da diversidade genética reduz sua habilidade de adaptação a mudanças do meio ambiente podendo levar várias espécies à depressão pela endogamia (FRANKHAM et al.,2004). A variabilidade existente é resultado da pressão ambiental nos diversos biomas produzindo características que são muito importantes no trabalho de conservação. Deve-se ter em mente que o 1

2 status da variabilidade genética das plantas medicinais resulta na necessidade de se estabelecer diferentes estratégias de manejo e conservação (MACIEL et al. 2002). Estudos sobre a estrutura populacional dos vegetais são muito importantes, pois vários aspectos da estratégia de vida das espécies na alocação de energia são interpretados através da análise da estrutura populacional (TELLES, 2007). O conhecimento da magnitude e distribuição da varibilidade genética de uma espécie só é possível quando disponibilizamos marcadores genéticos para este fim. Em espécies nativas do cerrado, que ainda não foram estudadas do ponto de vista genético, torna-se necessário a escolha de marcadores genéticos que viabilizem estes estudos. O marcador molceular denominado ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) se baseia na amplificação de fragmentos, distribuídos no genoma, entre regiões de DNA repetitivo (região microssatélites). Sendo assim, o primer é desenhado como sendo parte de uma região microssatélite podendo ser composto somente das repetições (não ancorado) ou contendo bases adicionais, diferentes das repetições, em uma das extremidades (ancorado) (WU et al, 1994). O padrão de herança deste marcador é do tipo dominante, e vem provando ser uma técnica relativamente rápida, simples e barata de acesso a diversidade genética, por também permitir sua aplicação à qualquer espécie, se constui em mais uma ferramenta dentro da classe de marcadores dominante para a análise de variabilidade genética de populações (CASU et al., 2006). A especie medicinal do cerrado escolhida para este trabalho Cochlospermum regium (Figura 1). foi 2

3 Figura 1: Representante da especie Cochlospermum regium 2 MATERIAL E MÉTODOS O presente estudo foi desenvolvido no Laboratório de Genética & Biodiversidade na Universidade Federal de Goiás. Foram coletadas amostras de tecido (nervuras principal e secundárias) de folhas de 3 indivíduos da espécie. Para a extração do DNA foram testados três protocolos, sendo que um deles, um kit comercial GFX (Amersham) e os dois outros protocolos descritos na literatura (WASKO et al., 2003). Foi utilizado o preotocolo CTAB para extraçao do DNA. Para a quantificação, o DNA total de cada indivíduo foi comparado com um marcador de peso molecular comercial, por meio de uma eletroforese horizontal, utilizando agarose 1%, com brometo de etídio para a coloração do DNA, em tampão de corrida TBE (Tris Borato EDTA) na concentração de 1X. Para a visualização das bandas, o gel foi fotografado com o auxílio do fotodocumentador KODAK EDAS 120. Depois de quantificado, o DNA foi diluído para uma concentração ideal para ser usada nas reações de PCR. A seleção dos primers foi realizada a partir da amplificação, via PCR (Polimerase Chain Reaction), dos fragmentos de DNA utilizando três indivíduos. Para a seleção de primers ISSR serão utilizadas 20 primers que foram sintetizados pela empresa RWgenes. O produto da amplificação foi submetido à eletroforese horizontal, do mesmo modo como foi descrito para a quantificação do DNA, sendo que a concentraçao do gel de agarose foi de 1,5%. 3

4 Após amplificaçao a codificação dos locos foi feita segundo a presença (1) ou ausência (0) da banda para os marcadores ISSR, que deu origem a uma matriz de dados binários. Como critérios de seleção foram escolhidos os locos cujas bandas foram as mais nítidas no gel, para facilitar a distinção entre eles e foi respeitada uma determinada altura dos locos nos géis, que não ultrapasse 1600 pares de bases e nem inferior a 300pb. Tal matriz foi submetida a uma análise descritiva dos primers com relação ao número total de locos, número de locos polimórficos, utilizando o software POPGENE (versão 1.32). Também foi levado em conta o grau de dificuldade de codificação do primer. Finalmente foi realizada uma análise conjunta dos critérios observados para efetuar a seleção dos melhores marcadores. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Dos 20 iniciadores ISSR testados, 10 apresentaram um bom padrão de amplificação. Os 10 selecionados permitiram a codificação de um total de 81 locos. A análise descritiva realizada por iniciador, apresentou uma média igual a 8,1 locos, variando entre 4 (ISSR 816) e 13 (ISSR 808). O número de locos polimórficos foi igual a 30 representando aproximadamente 37% dos locos, variando entre 0 (ISSR 813 e ISSR 816) e 8 (ISSR 827). Em relação à intensidade do fragmento (banda) no gel, o número de bandas variou entre 2 e 5 fortes e 1 e 10 fracas. A análise conjunta dos critérios avaliados permitiu selecionar os seguintes iniciadores ISSR: 827, 861, 862, 813, 816, 825, 828, 811, 808 e K-20. 4

5 Figura 2- Fragmentos ISSR amplificados utilizando os primers K-20, 808 e 811..As colunas M 100bp, indicam o marcador de peso molecular (100 bp Pair Ladder). Tabela 1-10 primers ISSR, com suas respectivas temperaturas de anelamento. Primer Sequências Melting Temperature (Tm) Tm (s) ISSR K20 CAA GTG TGT GTG TGT ISSR 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT ISSR 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT ISSR 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT ISSR 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA ISSR 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC ISSR 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC ISSR 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG ISSR 861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC ISSR 862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC

6 As plantas produzem substâncias destinadas ao seu crescimento a exemplo dos polissacarídeos, açúcares e proteínas os quais são considerados compostos do metabolismo primário. Compostos especiais, também denominados de metabólitos secundários são sintetizados por diferentes rotas metabólicas produzindo uma imensa diversidade de estruturas químicas dentro da classe dos alcalóides, flavonóides, cumarinas, terpenóides etc. Os metabólitos secundários exercem importantes papéis de proteção contra microorganismos, herbívoros, intempéries ambientais, além de interferirem em processos simbióticos e atração de polinizadores (Briskin, 2000). São também fontes armazenadoras de carbono e nitrogênio que retornam ao metabolismo primário quando isso é requerido pela planta. O balanço entre a atividade do metabolismo primário e secundário da planta é dinâmico e podem ser consideravelmente afetado pelo crescimento da planta, diferenciação dos tecidos, fase vegetativa e estresse ambiental. Mais de compostos secundários de plantas já foram isolados e identificados, e a cada ano centenas de novas descobertas tem aumentado esse número (Verpoorte et al.1988). A eficácia e segurança de muitas plantas medicinais já foram comprovadas cientificamente o que as legitimizam como recurso terapêutico benéfico e indispensável para a humanidade. De acordo com Suman et al. (1999) inúmeras espécies vegetais são produtoras de metabólitos secundários, o que segundo Romano & Brasileiro (1999) podem gerar interferência nos padrões de migração em gel de eletroforese, ou de acordo com Rogstad (2003) interferir na digestão por enzimas de restrição, PCR e sequenciamento. É necessário então otimizações que facilitem a operacionalização da extração de DNA (COUCH & FRITZ, 1990). Devido à presença de metabólitos secundários faz-se necessário otimizar o protocolo de extração para essas espécies. Apesar das inúmeras dificuldades, foi possível selecionar bons primers para a espécie Cochlospermum regium, sendo que as demais não demonstraram resultados satisfatórios. Este resultado demonstra boa capacidade na detecção de polimorfismo através dessa técnica. O mesmo ocorreu em outros trabalhos onde resultados semelhantes foram obtidos por Batista et al. (2008) em Tibouchina papyrus. 6

7 4 CONCLUSÕES Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação A técnica de ISSR se mostrou satisfatória para a codificação de locus da espécie Cochlospermum regium. Foram observadas algumas dificuldades para extração do material genético devido à existência de metabólitos secundários na espécie Cochlospermum regium. Foram selecionados bons primers para a espécie Cochlospermum regium. A técnica de ISSR se mostrou adequada para estudos com populações naturais do Bioma Cerrado. REFERÊNCIAS CASU, M.; CASU D.; LAI, T.; COSSU, P.; CURINI-GALLETTI, M. Inter-simple sequence repeat markers reveal strong genetic differentiation among populations of the endangered mollusc Patella ferruginea (Gastropoda: Patellidae) from two Sardinian marine protected areas. Marine Biology, 149 (5): , COUCH, J.A.; FRITZ, P.J. Isolation of DNA from plants high polyphenois. Plant Molecular Biology Reporter, Tucson, v.8, p. 8-12, FRANCE, G.T. Floristic inventory of the tropics: where do we stand? Ann. Missouri. Bot. Gard., 64: ,1977. FRANKHAM, R., BALLOU, J.D., Briscoe, D.A. Introduction to Conservation Genetics. Cambridge: University Press, MACIEL, M.A.M; PINTO, A.C; VEIGA JÚNIOR, V.F. Plantas Medicinais: A Necessidade de Estudos Multidisciplinares. Quim. Nova, 25 (3): , PAIVA, J.R. Melhoramento genético de espécies agroindustriais na Amazônia. Fortaleza: Embrapa-CNPAT, p. SOLÉ-CAVA, A. M. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In: MATIOLI, S. R. Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Holos Editora, p , SUMAN, P.S.; KHANUJA, A.K.; SHASANI, M.P.; DAROKAR, M.; KUMAR, S. Rapid Isolation of DNA from Dry and Fresh Samples of Plants Producing Large Amounts of Secundary Metabolites and Essential Oils. Plant Molecular Biology Reporter, Netherlands: Kluwer Academic Publisher, v. 17, p. 1-7,

8 ROGSTAD, S. H. Plant DNA extraction using silica. Plant Molecular Biology Reporter, Canada, n. 21, p.463a-463g, Dec ROMANO, E.; BRASILEIRO, A.C.M. Extração de DNA de plantas. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Brasília v. 2, n. 9, p.40-43, TELLES, M. P.C.; SOARES, T. N. DNA Fingerprinting no estudo de populações de plantas do Cerrado. In: PEREIRA, A. M. S. (org) Recursos genéticos e conservação de plantas medicinais do cerrado. Ribeirão Preto: FAPESP, 2007, p WASKO A.P., MARTINS C., OLIVEIRA C., FORESTI F. Non-destructive genetic sampling in fish. An improved method for DNA extraction from fish fins and scales. Hereditas. 138(3): WALTER, B. M. T. Biodiversidade e recursos genéticos: questões e conceitos. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, p. 8