DINÂMICA POPULACIONAL DE Araucaria angustifolia COMO MECANISMO PARA VALORAÇÃO DE SERVIÇOS AMBIENTAIS

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1 DINÂMICA POPULACIONAL DE Araucaria angustifolia COMO MECANISMO PARA VALORAÇÃO DE SERVIÇOS AMBIENTAIS 1 Andiara Gonçalves, 2 Rafaela Natali Bueno, 3 MsC. Luciano Medina Macedo, 4 PhD. André Biscaia de Lacerda e 5 PhD. Juliana Vitória Messias Bittencourt 1 Acadêmica de Tecnologia em Alimentos- UTFPR- campus Ponta Grossa, Brasil 2 Acadêmica de Engenharia Química- UTFPR - campus Ponta Grossa, Brasil 3 Doutorando Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos UFPR- Curitiba, Brasil 4 Coordenador projeto de Valoração de Serviços Ambientais,pesquisador EMBRAPA FLORESTAS- Colombo, Brasil 5 Docente da UTFPR - campus Ponta Grossa e coordenadora subprojeto de Caracterização da Variabilidade Genética. Brasil andiaragoncalves@gmail.com Resumo Este trabalho visa comparar a variabilidade genética em uma floresta Araucaria angustifolia conservada e fragmentos com intervenção antrópica. Para tanto, foi realizado extração de DNA para posterior aplicação de marcadores microssatélites a fim de verificar a variabilidade genética na Araucária angustifólia. Os resultados mostram que há diversidade genética similar nas duas condições entre as árvores adultas, já para as progênies demonstram uma manutenção da diversidade na condição de contínuo e aumento para a condição de fragmento. Palavras-chave: Araucaria angustifólia; análise PCR; variabilidade genética. Abstract The objective of this paper is to compare the genetic variability in a Araucaria angustifolia conserved forest and fragments with human intervention. Then, DNA extraction carried out for subsequent application of microsatellites marker to determine genetic variability in Araucaria angustifolia. The results show that genetic diversity is similar in two conditions among adult trees, and for progeny there are a maintenance of diversity in a conserved forest and increased in the fragment condition. Keywords: Araucaria angustifólia, PCR analysis, genetic variability. 1. Introdução Durante o período de colonização do interior do Sul do Brasil no Séc. XIX e início do Séc. XX, a Floresta com Araucária foi submetida à uma intensa exploração extrativista, por se tratar de um recurso natural de alta qualidade e muita abundância naqueles tempos. O resultado deste processo de exploração extrativista refletiu no início do Séc. XXI, onde os remanescentes naturais com esta formação florestal foram reduzidos a menos de 1% da sua área de abrangência [1]. Estudos mostram que a fragmentação de populações é responsável por alterações do fluxo gênico e alterações da variabilidade genética dos remanescentes florestais nativos [2]. Considerando a importância da Araucaria angustifolia para a região sul do Brasil, o

2 presente trabalho tem como objetivo comparar os parâmetros genéticos de um remanescente de florestal nativo e intocado desta espécie (Floresta Nacional de Caçador SC), com remanescentes florestais que sofreram algum tipo de intervenção antrópica, de caráter seletivo ou aleatório. A caracterização da variabilidade genética está intimamente relacionada à valoração da biodiversidade para fins de Serviços Ambientais (SA), que emprega técnicas de biologia molecular como um instrumento de investigação para espécies econômica e ambientalmente relevantes [3]. De cada árvore amostrada foi coletada uma pinha, da qual foi extraído o DNA do embrião de 28 pinhões (tecido diplóide), juntamente com o DNA do endorperma (tecido haplóide de origem maternal). Na Figura 1 é possível visualizar a diferença entre o endosperma e o embrião da semente de Araucária. 2. Matérias e métodos 2.1 Material vegetal Para a caracterização da dinâmica populacional de Araucária, foram coletadas sementes de 40 árvores adultas em três diferentes condições florestais: 15 delas em condição de floresta nativa, situada dentro da Floresta Nacional de Caçador SC (remanescente mais próximo possível de uma floresta não antropizada); outras 12 árvores isoladas em campo agricultável, localizadas no entorno do remanescente nativo avaliado; e outras 13 em remanescentes existentes em propriedades particulares situadas próximas à Floresta Nacional de Caçador. Todas as árvores coletadas tiveram suas coordenadas marcadas por GPS (Global Positioning System). Figura 1-Corte longitudinal da semente de Araucária (pinhão), indicando o embrião (1), o endosperma (2) e a casca da semente (3). 2.2 Extração de DNA O isolamento de DNA foi realizado seguindo o protocolo estabelecido por [4], com ligeiras modificações de acordo com o tipo de material vegetal utilizado como base para a extração. 2.3 Genotipagem Todas as reações em cadeia pela polimerase (PCR) foram conduzidas no termociclador Therm-1000/ Maxygene Versão nº1.4 e o KIT para PCR Multiplex da QIAGEN para amplificação dos locos SSR. As reações de PCR no volume de 10µL foram compostas por 5µL de Master Mix 1x; 1,0µL de Q-Solution 0,2µM; 1,0µL de cada par de primers na

3 concentração de 2µM; 2,0 ng de DNA genômico e água Milli-Q estéril. Os ciclos de PCR tiveram início com uma etapa de desnaturação a 95ºC durante 15 minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 57ºC por 90 segundos e extensão a 72ºC por 90 segundos, mais uma etapa final de extensão na temperatura de 72ºC durante 30 minutos. Ao término dos ciclos de PCR a reação era diluída uma vez acrescentando-se 10µL de água Milli-Q estéril. Para a detecção dos alelos das amostras foi aplicada a análise de fragmentos em equipamento ABI3500 (Applied Biosystems). utilização de proteinase-k para eliminar resíduos proteicos. Já o DNA isolado a partir do embrião e do endosperma de sementes, fezse necessário a utilização do protocolo de extração completo. A quantificação do DNA extraído foi feita em gel de agarose 1% com tampão TBE ((EDTA 0,5M (ph8), tris base, acido bórico,água destilada), corado com brometo de etídio e posteriormente visualizado em luz ultravioleta, podemos observar na Figura Diversidade Genética A diversidade genética intrapopulacional será caracterizada pelos índices: número médio de alelos por loco ( A ), número efetivo de alelos por locos ( A e ), heterozigosidade observada ( H ) e heterozigosidade esperada o segundo as proporções do equilíbrio de Hardy- Weinberg ( H ) [5]. 3. Resultados e De maneira geral, as modificações realizadas no protocolo para o isolamento de DNA a partir do tecido do câmbio vascular consistiram em não realizar uma etapa de lavagem com CTAB 10% (50mM CTAB, 1.4M NaCl, 100ml Tris- Hcl (ph8,0), 20mM EDTA) e também não foi necessária à Figura 2- Foto de extração do DNA Foi utilizado DNA de fago λ de concentração conhecida como padrão de referência para estimar a concentração de DNA nas amostras. Posteriormente as amostras de DNA foram diluídas para uma concentração de 3ng/µL em placas de PCR com 96 poços. Na Figura 3 pode ser verificado o esquema da disposição das amostras nas placas de PCR.

4 Figura 3- Esquema da disposição das amostras nas placas de PCR Foram testadas combinações multiplex de primers em uma mesma reação de PCR (Tabela-1), com o objetivo de determinar quantos pares de primers SSR poderiam ser amplificados com segurança em uma mesma reação de PCR no volume de 10µL. O número médio de alelos por primer entre árvores adultas na floresta contínua foi 8,10, comparado a 5,15 avaliados em fragmento de floresta. As heterozigosidades médias esperadas foram 0,623 para a floresta contínua e 0,579 para o fragmento de floresta, enquanto a heterozigosidade observada foi de 0,571 e 0,723 respectivamente. Subpopulações de fragmentos florestais foram mais distintas do que subpopulações de contínuo, o índice de fixação médio foi de 0,082 para subpopulações na floresta contínua e 0,210 nos fragmentos. Vale notar que os níveis de diferenciação genética entre todas as subpopulações podem ser considerados elevados. Tabela1- Combinação multiplex Multiplex Primer Motif T. A. Range Dye Autores I Ag23 (TA)5(GT)4 58ºC FAM [6] I As90 (CA)10n(CA)8 58ºC HEX [7] I Ag45 (GT)4AT(GT)7 58ºC FAM [6] II CRCAc1 (GA)19 56ºC HEX [8] II Ag62 (TC )13 56ºC HEX [6] III Ag56 (TC )11 54ºC FAM [6] III CRCAc2 (GA)23 54ºC HEX [8] III Ag20 (GA)12 54ºC FAM [6] 4. Discussão Até o presente momento as técnicas moleculares foram aplicadas com sucesso dentro do planejamento idealizado para este projeto. A coleta de material biológico de A. angustifolia em diferentes condições florestais possibilitará determinar a variabilidade genética e fluxo gênico de Araucaria angustifolia em diferentes cenários, permitindo que sejam definidos mecanismos para valoração de serviços ambientais com base na diversidade de remanescentes nativos em propriedades rurais. De acordo com Frankham [9], o maior desafio das estratégias de conservação é encontrar uma metodologia que consiga integrar toda a paisagem da floresta e ao mesmo tempo buscar uma abordagem

5 genética. A ausência de tais informações em relação à quase todas as espécies arbóreas, na maioria das áreas de florestas tropicais limita as possibilidades para um manejo efetivo de seus recursos genéticos, bem como a sua valoração. A adequada valoração das áreas verdes está relacionada com a importância que ela apresenta para o ecossistema na qual está inserida. A incorporação do efeito dos elementos da paisagem no fluxo gênico e dinâmica populacional da Araucaria angustifolia, permitirá quantificar e valorar com maior precisão as mudanças nos níveis dos serviços ambientais em remanescentes florestais onde esta espécie é presente, para fins de conservação da biodiversidade e gestão e planejamento territorial na Região Sul do Brasil. de nível Superior (CAPES) pela bolsas concedidas. 6. Referências [1]FUPEF - FUNDAÇÃO DE PESQUISAS FLORESTAIS DO PARANÁ. Diagnóstico dos Remanescentes Florestais. In: Projeto de Conservação e Utilização Sustentável da Diversidade Biológica Brasileira - PROBIO, Subprojeto Conservação do Bioma Floresta com Araucária. Relatório Final, vol. I, 121p., [2]BITTENCOURT, J. V. M. Genetic Diversity and Dynamics in Remnant Patches of Araucaria angustifolia Forest in Paraná State, Brazil; Implications for Conservation and Restoration. Reading, The University of Reading. Tese de PhD: 226 p., Agradecimentos Este projeto é resultado de uma parceria entre o Laboratório de Bioengenharia da UTFPR (Campus Ponta Grossa) com a Embrapa Florestas e Pós-Graduação em Biotecnologia da UFPR, para o desenvolvimento de serviços biotecnológicos a partir da análise de variabilidade molecular de espécies florestais ecologicamente relevantes. Agradecemos em especial a Fundação de apoio a educação, pesquisa e desenvolvimento cientifico e tecnológico da Universidade tecnológica Federal do Paraná (FUNTEF) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal [3]MATIOLI, S.R. & PASSOS-BUENO, M.R.S. Métodos baseados em PCR para análise de polimorfismos de ácidos nucléicos. In: MATIOLI, S.R. (Ed.). Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Holos, p [4]MAZZA, M. C. M.; BITTENCOURT, J. V. M. Extração de DNA de tecido vegetal de Araucaria angustifolia (Araucariaceae). Boletim de Pesquisa Florestal, Colombo, n. 41, p , [5]LEWIS, P.O.; ZAYKIN, D. GDA - Genetic Data Analysis: version 1.1 for Windows 95/NT.

6 [6] SALGUEIRO F.; CARON H.; DE SOUSA MIF.; KREMER A.; MARGIS R. Characterization of nuclear microssatellite loci in South American Araucariaceae species. Mol Ecol Notes 5; , [7] ROBERTSON A.; HOLLINGSWORTH P.M.; KETTLE C.J; ENNOS R.A.; GARDNER M.F Characterization of nuclear microsatellites in New Caledonian Araucaria species. Molecular Ecology Notes 4, [8] SCOTT L.J., SHEPHERD M., HENRY R.J., Characterization of highly conserved microsatellite loci in Araucaria cunninghamii and related species. Plant Systematics and Evolution 236, [9]FRANKHAM, R. Conservation genetics. Annual Review of Genetics, Palo Alto, v. 29, p , [10]MARSHALL, T.C., SLATE, J., KRUUK, L.E.B.; PEMBERTON, J.M. Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology, 7: , 1998.