EFEITO DO LASER TERAPÊUTICO DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE O PROCESSO DE REPARAÇÃO ÓSSEA EM TÍBIA DE RATO

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1 Rev. bras. fisioter. Vol. 7, No. 2 (2003), Associação Brasileira de Fisioterapia EFEITO DO LASER TERAPÊUTICO DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE O PROCESSO DE REPARAÇÃO ÓSSEA EM TÍBIA DE RATO Marino, J. A. M., 1 Taciro, C., 1 Zuanon, J. A. S.,2 Benatti Neto, C'. 2 e Parizotto, N. A. 1 1 Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Fisioterapia, Laboratório de Eletrotermofototerapia, Rod. Washington Luís, km 235, CEP: , São Carlos, SP 2 Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araraquara, Departamento de Fisiologia e Patologia Correspondência para: Josiane Andrade Moretti Marino, Rua Alvarina Frota, 165, ap. 202, Santa Luiza, CEP: , Varginha, MG, josianemarino@hotmail.com Recebido: 4/12/02 - Aceito: 29/4/03 RESUMO Este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do laser terapêutico de baixa potência sobre o processo de reparação óssea em tíbia de rato. O modelo experimental consistiu na realização de uma osteotomia mecânica por escareação na face mediai da tíbia de 48 ratos machos, utilizando uma broca odontológica de aço cilíndrica. Os animais foram divididos em 3 grupos, sendo que os grupos 1 e 2 foram irradiados com laser na dose de 5 J/cm 2 e 50 J/cm 2, respectivamente, enquanto o grupo 3 (controle) recebeu tratamento piacebo. Foi utilizado o laser diodo Ga-Al-As (830 nm, 60 mw, CW), com densidade de potência de 20 W/cm 2, em aplicações pontuais a cada 24 horas, com intervalo de 2 dias a cada 5 sessões. Cada grupo foi subdividido aleatoriamente em 2 subgrupos para realização das avaliações ao final do 7 2 e do 14º dias do pós-operatório (PO), completando-se 5 e 10 sessões de tratamento, respectivamente. Os parâmetros referentes ao tecido de reparo avaliados foram: 1. comportamento biomecânico ao final de 14 dias PO e 2. morfologia ao final de 7 e 14 dias dopo, referentes ao tecido de reparo. Os achados das análises histomorfológicas dos 7 2 dias do PO demonstraram melhor evolução do processo de reparação no grupo irradiado com a dose de 50 J/cm 2, comparado aos demais grupos. Esses resultados sugerem que, sob as condições experimentais da investigação, a terapia laser de baixa potência (LLLT) favorece o processo de reparação óssea durante seus estágios iniciais. Palavras-chave: laser de baixa potência, osso, osteotomia, rato, biomecânica e reparação. ABSTRACT The purpose of this study was to evaluate the effects of low power therapeutic laser on the process of bone heaiing in rat tíbia. The experimental modei consisted on the realization of a mechanical osteotomy by piercing of the mediai face of the tíbia of 48 male rats, with a cyiindricai steel dental drill. The animais were randomly divided into 3 groups. The groups 1 and 2 were irradiated with laser at a dosage of 5 J/cm 2 and 50 J/cm 2, respectively, while the group 3 was ciassified as the control group and took simuiated treatment without irradiation. The diode laser Ga-Al-As (830nm, 60mW, CW) was used with a density power of 20 W/ cmz, in contact applications every 24 hours, with a 2-day interval at the end of each 5th session. Each group was randomiy subdivided into 2 subgroups for evaluation at the end of the 7th and 14th post-injury (P.I.) day:;, totaling 5 and 10 treatment sessions respectively. The parameters evaluated were: 1) biomechanical behavior at the end of the 14th day and 2) morphoiogy of the repair tissue at the end of the 7th and of the 14th days. The results of the histomorfologicai analysis at the 7th P.I. day reflected an improvement in the healing process in the irradiated group with a dosage of 50 J/cm 2 These results suggest that, under the experimental conditions of the investigation, the low-power laser therapy (LLLT) improves bone heaiing during the early stages. Key words: low-power laser, bone, osteotomy, rat, biomechanical and healing.

2 168 Marino, J. A. M. et al. Rev. bras. jisioter. INTRODUÇÃO A reparação óssea seguida de trauma corresponde a uma seqüência de eventos biológicos regulados por diversos fatores endógenos e exógenos. Esse é um processo demorado que resulta em prolongada incapacidade e sofrimento, além de trazer um fardo econômico para os pacientes e para a sociedade Diversas técnicas terapêuticas são empregadas na prática clínica na tentativa de promover aceleração e/ou melhora do processo de reparação óssea, dentre elas a terapia laser de baixa potência (LLLT). A magnitude do efeito biomodulatório ou fotobiorregulador atribuído à LLLT ao interagir com os tecidos, os quais podem influenciar nas funções celulares, estimulando ou inibindo atividades bioquímicas e biofísicas, é referida como dependente do comprimento de onda, da dose e da densidade de potência selecionados, assim como da freqüência de tratamento e do tipo de lesão No entanto, os mecanismos de ação de tal modalidade terapêutica ainda não estão totalmente elucidados, o que tem gerado muita discussão, principalmente porque alguns dos estudos experimentais in vitro e in vivo publicados reportam resultados negativos contraditórios Por outro lado, são encontrados numerosos artigos, cujos resultados sugerem que a LLLT pode apresentar efeito estimulatório sobre o processo de reparação e/ou de formações ósseas , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 Em razão da diversidade de achados quanto à eficácia do laser de baixa potência como agente de terapia física sob tal processo, ela permanece controversa na literatura. Portanto, constituiu propósito do presente estudo avaliar os efeitos do laser terapêutico de baixa potência sobre o processo de reparação óssea em tíbia de ratos, aplicado em diferentes densidades de energia, considerando como parâmetros de avaliação: a) comportamento biomecânico e b) morfologia referente ao tecido de reparo neoformado. Procedimento METODOLOGIA Foram utilizados 48 ratos machos (Rattus norvegicus albinus), da raça Wistar, com de 12 a 13 semanas de idade e peso corporal entre 250 e 350 g. Sob efeito anestésico (ketamina. 95 mg/kg e xilazina 2%, 12 mglkg), foi feita incisão longitudinal (8-10 mm) sobre a pele e a fáscia miotendínea para expor a superfície ântero mediai do segmento proximal da tíbia esquerda. Em seguida, utilizando uma broca odontológica cilíndrica de aço para contra-ângulo, acionada por um minidril com rotação de rpm, foi promovida uma osteotomia mecânica por escareação (1,5 mm de diâmetro) no centro da face mediai do osso cortical da tíbia. no nível do terço proximal. Finalizando, a pele foi suturada e foi administrada intraperitonialmente uma dose única de cefazolina (20 mg/1 00 g de peso corpóreo), 15 como profilaxia antimicrobiana. O protocolo de tratamento foi iniciado no dia zero, imediatamente após o término da cirurgia. Para isso, os animais foram divididos em 3 grupos, contendo 16 elementos cada um, sendo que o grupo 1, classificado como grupo controle, recebeu tratamento placebo (O J/cm 2 ), enquanto os grupos 2 e 3 foram tratados com radiação laser nas dose de 5 J/cm 2 e 50 J/cm 2, respectivamente. Foi utilizado o laser diodo Ga-Al-As (830 nm, 60 mw, CW), densidade de potência de 20 W/cm 2, diâmetro do feixe de 0,6 mm e tempo de aplicação de 2,6 s (5 J/cm 2 ) e 0,26 s (50 J/cm 2 ). Cada grupo foi subdividido em 2 subgrupos para a realização das avaliações na data do sacrifício, promovido por meio da inalação excessiva de éter etj.1ico ao final de 7 dias (n = 4) e 14 dias (n = 12) do pós-operatório (PO). Nessa ocasião, o subgrupo 14 dias foi subdividido em duas amostras, sendo n 1 = 4 e n 2 = 8. As aplicações de laser foram executadas por meio da técnica de contato, irradiando-se por fotoestimulação transcutânea um único ponto sobre a lesão a cada 24 horas, com intervalo de 2 dias a cada 5 sessões, cumprindo-se um total de 5 sessões de LLLT para o subgrupo sacrificado no 7º dia do PO (n = 4) e de 10 sessões de LLLT para o subgrupo sacrificado no 14l! dia do PO (n = 12). Análise de dados Análise histológica: Foi realizada a análise histomorfológica qualitativa da área da fenda produzida no nível da cortical óssea nas amostras n = 4, correspondente ao subgrupo sacrificado no 7 2 dia do PO e n 1 = 4, correspondente a 11 3 do subgrupo sacrificado no 14l! dia do PO. As tíbias retiradas foram fixadas em formalina a 10% por 48 horas, em seguida, submetidas à descalcificação em solução de Morse (citrato de sódio a 20% e ácido fórmico a 50%) e, posteriormente, processadas em parafina. Na seqüência, foram obtidos cortes transversais semi-seriados, com 5 a 6 J..Lm de espessura. Esses cortes foram montados em lâminas histológicas, num total de cinco lâminas por tíbia, contendo de cinco a sete cortes cada, posteriormente, corados com Tricrômico de Masson. Por meio de microscopia óptica, foi investigada a presença dos seguintes critérios morfológicos relacionados ao processo de reparação: a) detritos da inflamação (infiltrado hemorrágico, células da medula óssea e/ou osteócitos mortos); b) osso trabecular; e c) osso cortical. Os achados histológicos foram avaliados qualitativamente, cuja intensidade dos processos foi graduada de acordo com uma escala ordinal de categorias, variando de ausente (0), leve (1), e moderada (2) a intensa (3). Análise biomecânica: O comportamento biomecânico do tecido de reparo foi avaliado por meio do emprego de ensaio biomecânico na amostra n 2 = 8, correspondente a 2/3 do subgrupo sacrificado no 14º dia dopo. Para aplicação dos ensaios, ambas as extremidades das tíbias foram fixadas na posição horizontal em forma de engaste, por meio da inclusão

3 Vol. 7 No. 2, 2003 Laser terapêutico no processo de reparação óssea 169 em blocos de apoio. Esses blocos foram mantidos a uma distância de 7,5 mm a partir da área de lesão, que permaneceu voltada para baixo e no centro, somando ao final 15 mm de distância entre eles. Foram realizados ensaios biomecânicos de flexão em três pontos, utilizando-se a máquina de ensaio universal eletromecânica da marca INSTRON, modelo 4.444, com velocidade de aplicação de carga de 1.0 mm/min. Por meio da análise da curva resposta carga versus deformação, na qual a carga (N) é lançada no eixo da ordenada e a deformação (mm) no eixo da abscissa, foram calculadas as seguintes propriedades biomecânicas (Figura 1): 1. Tensão normal máxima (módulo de ruptura - megapascal, MPa), cujo valor foi calculado pela equação Mr= M.íc/ J, em quem_r= (F.L/4), sendo F= carga máxima atingida no ensaio; L= distância entre os apoios fixos (15 mm); J =momento de inércia inicial (mm 4 ), calculado pela expressão J = 1t.(D 4 - d 4 )/64, sendo D =valor médio dos diâmetros externos (A, B e C) d = diâmetro interno. (canal medular); e c= raio da circunferência externa (mm) do corpo de prova. 2. Rigidez à flexão (megapascal, MPa), cuja medida é correspondente à tangente do ângulo a dada pela equação E = 1:1C- W. 3. Carga máxima (newton, N), correspondente ao maior valor de carga atingido (Cmáx). 4. Resiliência Uoule, J), cujo valor foi calculado considerando a área sob a curva carga versus deformação até o ponto de carga máxima. 5. Tenacidade Uoule, J), cujo valor foi calculado considerando a área total sob a curva carga versus deformação. No presente estudo, o valor do diâmetro interno, necessário para o cálculo da propriedade tensão normal máxima, foi obtido por meio do emprego de um software desenvolvido para estimar o valor da área e, conseqüentemente, do diâmetro interno, dado o valor de três diâmetros externos, sendo dois respectivamente perpendiculares à face corticallesionada e o terceiro paralelo à mesma. Tal programa apresenta cada elemento do conjunto como uma seqüência de quatro valores (três diâmetros externos e uma área interna) e funciona por meio de estimativa probabilística, usando redes neurais artificiais com grau pré-definido de erro de 0,01. Ou seja, calcula o valor requerido por equivalência dos dados amostrais armazenados. Estes por sua vez, foram obtidos a partir da mensuração das áreas correspondentes em cortes de amostras ósseas paralelas (n = 6), feita com o emprego do software analisador de imagens LEICA, modelo QUANTIMET 600. As propriedades biomecânicas foram analisadas por meio das médias e dos desvios-padrão. Para verificar a existência ou não de diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, aplicou-se o teste ANOVA. Quanto aos achados histológicos, foram empregadas técnicas de análise estatística não paramétrica. Utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis, adequado às situações em que se tem interesse em comparar k > 2 tratamentos. Em ambos os casos foi definido o valor de p < 0,05 como determinante de significância estatfstica. 'a --~ ~ 0,00 "'-----'!io!!:d::..... L J 0,00 Deformação (mm) Figura 1. Exemplo da curva resposta carga versus deformação da amostra submetida ao ensaio biomecânico. Rigidez: tangente do ângulo a (AC/áD); resiliência: área sob a curva até o ponto de carga máxima (Cmáx.); tenacidade: área total sob a curva; e F: ponto de fratura.

4 170 Marino, J. A. M. et al. Rev. bras. fisioter. RESULTADOS E DISCUSSÃO As Figuras 2 e 3 mostram os achados da análise histomorfológica comparativa promovida ao final de 7 e 14 dias dopo, sendo que a Figura 2 (A-C) corresponde ao grupo irradiado na dose de 50 J/cm 2 e a Figura 3 (D-F), ao grupo controle (O J/cm 2 ). As áreas de tecido de reparação e do tecido íntegro são identificadas, respectivamente pelas letras r e i. Pode-se observar no referido grupo irradiado (Figura 2 A) que, ao final de 7 dias do PO, a área da lesão, delimitada por bordas (setas horizontais) indicando a descontinuidade da cortical óssea, encontra-se preenchida com trabéculas ósseas (OT) bem desenvolvidas (graduação intensa), geralmente mais espessas e com avançado grau de deposição mineral em relação à ocupação por tecido osteóide não mineralizado. O periósteo* encontra-se espessado no nível da fenda cortical e áreas adjacentes, estando em estreita ligação com as neoformações trabeculares descritas. O conjunto em si caracteriza a formação de um calo externo e interno de fratura, situado, respectivamente, ao redor e entre as extremidades dos fragmentos ósseos. Entre os espaços trabeculares há presença mínima (graduação leve) de detritos da inflamação (hematoma, células da medula óssea e/ou osteócitos mortos). Osteoblastos são vistos dispostos em séries lineares ao redor das trabéculas neoformadas (seta), aparentando estarem ativos pelo maior contato entre os mesmos e a matriz óssea recém-produzida por eles (Figura 2 B). Ao final de 14 dias dopo (Figura 2C), a união dos fragmentos com osso compacto neoformado (OC) está quase completa (graduação moderada). Figura 2. Fotomicrografia dos achados histomorfológicos comparativos aos 7 2 e 14º dias dopo do exemplar do grupo exp~rimental in:adiado com a dose de 50 J/cm 2 (A-C), analisado por meio de microscopia óptica. Aos 7 2 dias do PO observa-se em A um mawr preenchimento da fenda cortical (setas horizontais) por trabéculas ósseas (OT) espessas e bem definidas. (B) Intensa presença de osteoblastos (OB). Aos 14 dias observa-se em C a fenda cortical parcialmente preenchida com osso compacto (OC). Escala de aumento: A e C x 63, B x 160. r: Tecido de reparação, i: tecido íntegro e (*): periósteo. Masson-Zeiss.

5 Vol. 7 No. 2, 2003 Laser terapêutico no processo de reparação óssea 171 Tal processo de maturação se deu em decorrência da modificação progressiva na disposição e na densidade das trabéculas ósseas, das quais permaneceram na área poucos remanescentes (graduação leve). Nesse período, os osteócitos derivados dos osteoblastos envoltos pela matriz mineralizada passam a ser as células predominantes. Em relação ao grupo controle, pode-se observar na área de lesão, ao final de 7 dias do PO (Figura 3D), a presença de um trabeculado ósseo menos desenvolvido (graduação leve) e com menor grau de deposição mineral. Além disso, pode ser observada presença maior (graduação intensa) de infiltrado hemorrágico (hematoma), juntamente com células da medula óssea e osteócitos mortos, considerados detritos remanescentes do processo inflamatório. De forma similar, o periósteo* encontra-se espessado no nível da fenda e áreas adjacentes. Tais estruturas, por sua vez, caracterizam, respectivamente, a formação de calo de fratura externo e interno. Células osteoblásticas não são claramente visualizadas entre os espaços trabeculares em razão da ocupação por infiltrado hemorrágico (h) cobrindo a área da lesão (Figura 3E). Após 14 dias (Figura 3F), pode-se observar que a área da fenda está parcialmente preenchida com osso compacto (OC) (graduação leve), a partir da condensação ou aumento progressivo da espessura das trabéculas ósseas. Porém, comparado ao grupo irradiado, tal área apresenta maior permanência de remanescentes de osso trabecular (graduação moderada). A partir dos dados comparativos referentes aos três diferentes grupos experimentais, podemos inferir que a efetividade do tratamento laser mostrou uma relação dose-dependente, visto que ao final dos 7º e 14º dias dopo o grupo tratado com a dose de 5 J/cm 2 não apresentou diferença estatisticamente significativa (p > 0,05) quando comparado ao grupo controle. Figura 3. Fotomicrografia dos achados histomorfológicos comparativos aos 7º e 14º dias dopo do exemplar do grupo experimental controle (D-F), analisado por meio de microscopia óptica. Aos 7 dias do PO observa-se em (D) um trabeculado ósseo menos desenvolvido, presente na área de lesão da cortical óssea (set!ls horizontais). (E) Intenso infiltrado hemorrágico (h). Aos 14 dias observa-se em (F) a fenda cortical parcialmente preenchida com osso compacto, porém há permanência maior de remanescentes de osso trabecular. Escala de aumento: D e F x 63, Ex 160. r: tecido de reparação, i: Tecido íntegro e(*): periósteo. Masson-Zeiss.

6 172 Marino, J. A. M. et al. Rev. bras. jisioter. Por outro lado, em relação aos critérios a) detritos da inflamação (p = 0,03) e b) osso trabecular (p = 0,04), ao final de 7 dias do PO os dados revelam valores de significância estatística entre os grupos irradiado com a dose de 50 J/cm 2 e o controle. Já no período subseqüente a 14 dias dopo, há forte indicação da existência de diferenças entre os mesmos grupos. Porém, em relação aos critérios b) osso trabecular (p = 0,06) e c) osso cortical (p = 0,06), os valores mostram não haver significância estatística (p > 0,05). Esses resultados sugerem que a LLLT favorece o processo de reparação óssea durante os estágios iniciais do mesmo. Os mecanismos estimulatórios de tal terapia não estão completamente elucidados. No entanto, com base na literatura, supõe-se que o laser possa ter atuado estimulando a proliferação e/ou a diferenciação das células mesenquimais osteoprogenitoras imaturas, transformando-as mais rapidamente em osteoblastos, favorecendo, conseqüentemente, a formação precoce de osso reparador (presença de trabeculado espesso e intenso). Outro importante aspecto a ser ressaltado é a existência de uma suposta ação biomodulatória sobre o processo inflamatório, atribuída à LLLT. São reportados na literatura efeitos como: reabsorção mais rápida de exsudatos, aumento da atividade fagocitária de limpeza, controle da emergência de fatores quimiotáticos, e/ ou aumento da vascularização Essa ação certamente contribuiu para uma osteosíntese inicialmente mais ativa, ao propiciar a instalação de condições ambientais favoráveis. Por outro lado, provavelmente tal efeito estimulatório não se estenda a estágios tardios subseqüentes, em que células maduras altamente diferenciadas passam a predominar, visto que não houve aumento estatisticamente significativo da efetividade do tratamento com o aumento da freqüência do mesmo, evidência constatada ao final de 10 sessões de LLLT (14º dia dopo). Esse aspecto é corroborado por vários outros estudos prévios, nos quais a LLLT mostrou-se efetiva quando aplicada em situações ativas e iniciais de reparação tecidual e/ou em cultura de células imaturas. Por outro lado, mostrando-se não efetiva quando aplicada sobre tecidos normais, estágios tardios do processo de reparação e/ou maturação celular Em relação à análise biomecânica promovida ao final de 14 dias dopo, os grupos não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05). No entanto, acredita-se que a explicação para tais resultados possa ser baseada na suposição de que a ação estimulatória da LLLT ocorra nos estágios iniciais proliferativos e/ou de diferenciação dos precursores imaturos. Ainda não havendo, provavelmente, a extensão desse efeito estimulatório a estágios tardios subseqüentes, em que células maduras altamente diferenciadas passam a predominar. Portanto, o emprego do ensaio biomecânico no respectivo modelo em um único período experimental (14 dias do PO) tàlvez não tenha sido ideal.. Nossos achados coincidem com os do estudo de Pinheiro et al. 26 que, por meio de estudo histomorfométrico, investigaram o efeito estimulatório da LLLT sobre o processo de reparação óssea no modelo de fratura experimental em fêmures de ratos. Como resultado, encontraram diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratado e não tratado após 3 sessões de LLLT, não havendo, por sua vez, diferenças entre os mesmos após 12 sessões de tratamento. Os autores consideram que o potencial osteogênico das células mesenquimais seja dependente de diversos fatores indutores exógenos e endógenos. Assim, a LLLT poderia agir como um fator indutor, estimulando a formação de osso em estágios precoces do processo de reparação. Da mesma forma, Ozawa et a/., 25 em estudo feito com cultura de células de linhagem osteoblástica irradiada com laser em vários estágios de maturação, reportam que a ação estimulatória da radiação laser possivelmente ocorra somente nos estágios proliferativos e iniciais de diferenciação dos precursores imaturos e não após estágios tardios, visto que células altamente diferenciadas não respondem mais à irradiação. Esses resultados corroboram os achados de Kawasaki & Shimizu 21 e Saito & Shimizu, 27 que investigaram o efeito estimulatório da LLLT sobre a regeneração óssea, respectivamente, no modelo experimental de movimentação dentária e no de expansão do maxilar em ratos. Como resultado, evidenciaram uma aceleração do processo mediante aplicação de laser durante os estágios iniciais do período experimental. Os autores sugerem que a irradiação laser pode potencialmente estimular o recrutamento e/ou a maturação de osteoblastos a partir da ação direta sobre células precursoras imaturas. CONCLUSÃO Sob as condições experimentais da investigação, podemos propor que o laser estimula o processo de reparação óssea durante os estágios iniciais do mesmo, não havendo provavelmente a extensão desse efeito a estágios tardios subseqüentes. Os resultados do presente estudo estabelecem a possibilidade do uso da LLLT em situações clínicas. No entanto, estudos futuros precisam definir quais são os parâmetros adequados para o tratamento em humanos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. BUCKWALTER, J. A., GLIMCHER, M. J., COOPER, R. R. & RECKER, R., 1995, Bone Biology. PartI: Structure, blood supply, cells, matrix and mineralization. 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