Estudo do efeito angiogênico do laser de baixa intensidade no trauma ósseo de rato: trabalho experimental em ratos

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1 Estudo do efeito angiogênico do laser de baixa intensidade no trauma ósseo de rato: trabalho experimental em ratos Study of the angiogenic effects of low intensity laser in mouse bone trauma: an experimental study in rats 3 4 Egmont Azevedo das CHAGAS¹, Mariana Rodrigues MAZZOLANI², Juliana Stuginski BARBOSA, Rui Barbosa de BRITO JUNIOR 1. Mestre em Implantodontia, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic, Campinas, SP, Brasil. 2. Graduanda em Odontologia, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic, Campinas, SP, Brasil. 3. Doutoranda em Reabilitação Oral, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil. 4. Professor dos Cursos de Graduação e Pós-graduação, Faculdade de Odontologia São Leopoldo Mandic, Campinas, SP, Brasil. Endereço para correspondência: Egmont Azevedo das Chagas Rua José Rocha Junqueira, 13 Swift Campinas São Paulo Brasil Recebido: 06/04/2012 Aceito: 16/07/2012 RESUMO O uso da terapia com o laser após traumas facilita a vascularização e formação de tecidos ósseos. Na Odontologia, o emprego deste tipo de tratamento tem sido usado com sucesso. O objetivo desta pesquisa foi veri car a e cácia do laser de baixa potência na angiogênese e reparo ósseo em tíbias de ratos. Para isso, foram causados defeitos ósseos nas tíbias direitas e esquerdas de 25 ratos Wistar. Em seguida, as tíbias do lado direito dos animais foram irradiadas pelo laser de baixa intensidade (grupo teste) enquanto as tíbias do lado esquerdo não foram submetidas a nenhum tratamento (grupo controle). A aplicação do laser ocorreu nos pós-operatórios imediato, 24, 48 e 72 horas. Os animais foram sacri cados nos períodos 24 e 72 horas, 7, 14 e 21 dias em (n = 5 animais para cada período). Foram produzidas lâminas histológicas com os fragmentos ósseos da região traumatizada, coradas em hematoxilina-eosina e observadas em microscópio óptico. De acordo com escores pré-determinados (avaliação qualitativa), não foram observadas diferenças estatísticas (p > 0.05) entre o grupo teste e controle nos diferentes períodos avaliados. Contudo, observou-se que, com o tempo, houve um discreto aumento no reparo ósseo, mas a angiogênese se manteve constante. Por meio desta analise qualitativa, pôde-se concluir que a laserterapia utilizada não in uenciou no processo de reparo ósseo e angiogênese. Palavras-chave: Neovascularização siológica. Osteogênese. Terapia a laser de baixa intensidade. ABSTRACT The use of laser therapy after trauma facilitates vascularization and formation of bone tissue. The use of this type of treatment has been used successfully in Dentistry. The objective of this research was to assess the effectiveness of low power laser in angiogenesis and bone repair in tibia of rats. In order to do so, bone defects were made to the right and left tibias of 25 Wistar rats. Then, the right tibiae of animals were irradiated by low intensity laser (test group) while the left tibiae were not subjected to any treatment (control group). Laser treatment occurred in the immediate postoperative stage, 24, 48 and 72 hours. The animals were sacrificed at 24 and 72 hours, 7, 14 and 21 days (n = 5 animals for each period). Histological slides were produced with bone fragments from the traumatized area stained with hematoxylin-eosin and observed under an optical microscope. According to predetermined scores (qualitative assessment) statistical differences were not observed (p > 0.05) between test and control groups in the different assessed periods. However, it was observed that, over time, there was a slight increase in bone repair, but angiogenesis remained constant. Through this qualitative analysis, we concluded that the laser therapy used had no influence on bone repair and angiogenesis. Keywords: Neovascularization, physiologic. Osteogenesis. Laser therapy, low-level. 22 Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:22-26.

2 ARTIGO ORIGINAL Chagas EA, Mazzolani MR,Barbosa JS, Brito RB Jr INTRODUÇÃO Atualmente, vários estudos possuem como objetivo o desenvolvimento de tratamentos que proporcionem o maior grau de sucesso possível nos procedimentos implantodônticos. Por este motivo, houve um amplo avanço nesta área, principalmente após a descoberta do laser de baixa intensidade que 8 obteve grande êxito nas aplicações em cirurgia oral. Os lasers podem promover diversos efeitos como, por 12 9 exemplo, o de analgésicos, antiin amatório e 15 reparador tecidual. Na década de 60, os lasers de baixa intensidade começaram a ser estudados devido a sua capacidade de alterar o comportamento celular, por efeitos fotoquímicos e fotofísicos, na ausência de aquecimento, a menos de 0.5ºC de aumento de 2 temperatura. Entretanto para uma reposta biológica adequada, é necessário observar os parâmetros de escolha do comprimento de onda, densidade de energia, densidade de potência, tipo de operação do laser e número de aplicações. Com a nalidade de 14 aumentar a velocidade de reparação tecidual, a laserterapia é um dos meios auxiliares mais desejados pela moderna odontologia e se torna uma necessidade para o desenvolvimento de novas técnicas de tratamento. Partindo deste principio, este trabalho teve como objetivo observar a e ciência do laser de baixa de intensidade em tíbias de ratos, em relação ao efeito angiogênico e reparação tecidual. Os animais foram subdivididos inicialmente em cinco grupos com cinco animais cada, de acordo com o tempo em que iam sofrer eutanásia: a- Grupo 1: sacrifício em 24 horas após o experimento; b- Grupo 2: sacrifício em 72 horas após o experimento; c- Grupo 3: sacrifício em 7 dias após o experimento; d- Grupo 4: sacrifício em 14 dias após o experimento; e- Grupo 5: sacrifício em 21 dias após o experimento. Depois da subdivisão dos grupos, foi realizada anestesia geral intraperitoneal, com uma solução de 2:1 de xilazina e quetamina na posologia de 0.5 ml por 200 g de peso e tricotomia da região antero-medial das tíbias esquerda e direita seguida de assepsia e antissepsia com PVPI tópico. O PVPI Tópico é um produto a base de Polivinil Pirrolidona Iodo em solução aquosa, o qual deve ser aplicado com o auxílio de uma gaze esterilizada. Para a realização dos defeitos ósseos nas tíbias, foi feito uma incisão com lâmina 15 (Figura 2), ruptura dos tecidos moles até exposição das tíbias e perfurações (3 mm) com micromotor (Driller, São Paulo, SP, Brasil) e contra-ângulo (Anthogyr, Sallanches, França) para implantes a 1200 rpm com brocas de 1.2 mm de diâmetro sob farta irrigação (Figura 3). MATERIAL E MÉTODOS Para a confecção deste estudo, foram utilizados vinte e cinco ratos (Rattus norvegicus albinus, Wistar), machos, com peso variando entre 250 gr a 300 gr, saudáveis (Figura 1). Figura 2 - Incisão com lâmina 15. Figura 1 - Ratos mantidos em gaiolas comerciais. Figura 3 - Micromotor e contra ângulo para implantes a 1200 rpm, com broca de 1.2 mm de diâmetro produzindo defeito ósseo em tíbia. Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:

3 Estudo do efeito angiogênico do laser de baixa intensidade no trauma ósseo de rato: trabalho experimental em ratos Os tecidos moles foram reconduzidos à suas posições e suturados (Figura 4). Nas tíbias direitas, foi aplicado laser de baixa intensidade, GaAlAs (Gallium Aluminum Arsenide), emitido de um aparelho Modelo Twin Flex (Mmoptics, São Carlos, SP, Brasil). O escore para o efeito angiogênico na região do defeito ósseo foi de nido baseado na seguinte descrição: a- (1) sem vasos b- (2) quantidade mínima de vasos c- (3) quantidade mediana de vasos d- (4) quantidade grande de vasos O número de ratos associados a cada escore foi comparado através do teste exato de Fischer no programa Minitab. RESULTADOS Figura 4 - Sutura realizada. A aplicação ocorreu nos pós-operatórios: imediato, 24h, 48h e 72h (Figura 5). Nas tíbias esquerdas, nada foi realizado. Os animais foram submetidos à eutanásia de acordo com os grupos divididos inicialmente para a confecção de lâminas histológicas. As lâminas histológicas da pesquisa foram analisadas por um único avaliador por meio de um microscópio Axioskop 2 plus (Oberkochen, Alemanha) marca Carl Zeiss acoplado a uma câmera Axiocam HRc Carls Zeiss (Oberkochen, Alemanha) com aumento padronizado de 40x e 100x. A partir da análise, o avaliador atribuiu escores para o crescimento/reparo e vascularização do defeito ósseo. O escore para a neoformação óssea foi de nido baseado na seguinte descrição: a- (1) sem osso; b- 2) quantidade mínima de osso; c- (3) quantidade mediana de osso; d- (4) quantidade grande de osso; e- (5) defeito ósseo totalmente reparado. De acordo com a Figura 6, podemos observar que apenas oito animais, 32% da amostra total, apresentaram diferença entre os escores atribuídos a tíbia direita e esquerda, em relação a formação óssea, sendo que em um animal, do grupo 4 (14 dias), a tíbia não irradiada recebeu escore mais alto do que a tíbia irradiada. Figura 6 - Número de ratos de acordo com o escore para reparo ósseo atribuído em cada período (p > 0.05). A Figura 7 traz o número de ratos de acordo com o escore para angiogênese atribuído em cada período. Figura 5 - Aplicação de laserterapia no pós operatório imediato. Figura 7 - Número de ratos de acordo com o escore para angiogênese atribuído em cada período (p > 0.05). 24 Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:22-26.

4 ARTIGO ORIGINAL Chagas EA, Mazzolani MR,Barbosa JS, Brito RB Jr Com relação à vascularização, apenas em oito animais pode ser observada diferença entre os escores dados a tíbia direita e esquerda, dando ênfase em três animais que apresentaram tíbias não irradiadas com escore maior. Em ambos os grá cos, não houve estatisticamente uma diferença (p > 0.05). DISCUSSÃO Neste estudo, o uso do laser de baixa potência não demonstrou efeito signi cativo. Com a interpretação dos resultados obtidos, observou-se que, em um mesmo animal, o processo de angiogênese e formação óssea permaneceram semelhante independente do tempo. Levando como exemplo outros estudos que objetivaram veri car o efeito da laserterapia sobre 1,3-4,6-7,10-11,13 defeitos ósseos, este trabalho optou por realizar o experimento em ratos, especi camente em suas tíbias. Comparando-se com outros locais anatômicos, a tíbia apresenta algumas vantagens sobre a calota craniana e o ângulo da mandíbula, por exemplo, que possuem estruturas muito delgadas. Apesar de apresentarem origens embriológicas distintas, a tíbia e o osso mandibular possuem um processo de cicatrização semelhante, in uenciada pelas forças musculares do gastrocnêmio, no caso da tíbia, e do masseter e pterigóideo medial, no caso da mandíbula. Para promover uma cicatrização similar nas duas patas, a perfuração foi realizada evitando que o rato exercesse forças musculares excessivas em uma das patas em detrimento a outra. A escolha do diâmetro do defeito ósseo realizado neste estudo (3 mm) durante 1,3,6-7,10-11,13 a osteotomia foi baseada em estudos prévios, respeitando os limites da cortical da metá se das tíbias dos ratos operados e evitando áreas de ossi cação endocondral. Vários trabalhos da literatura mostraram-se interessados em estudar a laserterapia com o intuito de acelerar o processo cicatricial em defeitos ósseos. Ao contrário deste estudo, estes 5,13 trabalhos mostraram que, tanto em vasos quanto em 1,6,10-11,13 tecido, a neoformação foi antecipada nos defeitos ósseos que receberam a laserterapia de forma signi cativa. Entretanto em nenhum dos estágios observados neste estudo (24 e 72 horas, 7, 14 e 21 dias) pode-se observar este efeito. Por diversos motivos que serão levantados a seguir, deve-se ter cautela ao comparar os resultados encontrados neste estudo e nos demais relatados na literatura. O primeiro motivo está relacionado com o tipo especí co de laser utilizado, que no caso foi o GaAlAs (Gallium Aluminum Arsenide). Outro fator relevante que pode ter ocasionado a diferença entre os diversos estudos e este seria o numero de sessões que foram submetidas às amostras. Neste estudo, o primeiro grupo sofreu eutanásia com apenas uma sessão de laserterapia sendo que a aplicação diária do laser por mais de sete dias produziria uma melhora na neoformação trabecular, pois os osteoblastos cariam dispostos lado a lado, disposição característica de osteoblastos ativos e 3 engajados na síntese de matriz óssea. Nas pesquisas realizadas e publicadas na literatura o número de 1 10,13 sessões variou entre duas a 12 sessões. CONCLUSÃO A análise dos resultados obtidos no presente trabalho nos permite concluir que, de acordo com a amostra apresentada: a laserterapia não produziu efeitos sobre a angiogênese e neoformação óssea nos defeitos ósseos produzidos em tíbias de ratos, em avaliação qualitativa. AGRADECIMENTOS Á Instituição de Ensino Superior por intermédio do Prof. Dr. Thomaz Wassall, Pró Reitor de Ensino e Desenvolvimento da Faculdade de Odontologia. Ao Prof. Dr. Rui Barbosa de Brito Júnior, por sua dedicação, orientação e companheirismo, neste trabalho. REFERÊNCIAS Barushka O, Yaakobi T, Oron U. Effect of lowenergy laser (He-Ne) irradiation on the process of bone repair in the rat tibia. Bone. 1995;16(1): Chow RT, Barnsley L. Systematic review of the literature of low-level laser therapy (LLLT) in the management of neck pain. Lasers Surg Med. 2005;37(1): Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:

5 Estudo do efeito angiogênico do laser de baixa intensidade no trauma ósseo de rato: trabalho experimental em ratos Garavello-Freitas I, Baranauskas V, Joazeiro PP, Padovani CR, Dal Pai-Silva M, Cruz-Hö ing MA. Low-power laser irradiation improves histomorphometrical parameters and bone matrix organization during tibia wound healing in rats. J Photochem Photobiol B. 2003;70(2):81-9. Guzzardella GA, Torricelli P, Nicoli Aldini N, Giardino R. Laser technology in orthopedics: preliminary study on low power laser therapy to improve the bone-biomaterial interface. Int J Artif Organs. 2001;24(12): Khadra M, Kasem N, Haanaes HR, Ellingsen JE, Lyngstadaas SP. Enhancement of bone formation in rat calvarial bone defects using low-level laser therapy. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2004;97(6): Luger EJ, Rochkind S, Wollman Y, Kogan G, Dekel S. Effect of low-power laser irradiation on the mechanical properties of bone fracture healing in rats. Lasers Surg Med. 1998;22(2): Nicola RA, Jorgetti V, Rigau J, Pacheco MT, Reis LM, Zângaro RA. Effect of low-power GaAlAs laser (660 nm) on bone structure and cell activity: an experimental animal study. Lasers Med Sci. 2003;18(2): Pecaro BC, Garenhime WJ. The CO2 laser in oral and maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg. 1983;41(11): Sakurai Y, Yamaguchi M, Abiko Y. Inhibitory effect of low-level laser irradiation on LPSstimulated prostaglandin E2 production and cyclooxygenase-2 in human gingival broblasts. Eur J Oral Sci. 2000;108(1): Trelles MA, Mayayo E. Bone fracture consolidates faster with low-power laser. Lasers Surg Med. 1987;7(1): Turner J, Hode L. Low level laser therapy - clinical practice and scienti c background. Suecia: Prisma Books; Yu W, Naim JO, Lanzafame RJ. The effect of laser irradiation on the release of bfgf from 3T3 broblasts. Photochem Photobiol. 1994;59(2): Silva AN Jr, Pinheiro AL, Oliveira MG, Weismann R, Ramalho LM, Nicolau RA. Computerized morphometric assessment of the effect of lowlevel laser therapy on bone repair: an experimental animal study. J Clin Laser Med Surg. 2002;20(2): Takeda Y. Irradiation effect of low-energy laser on alveolar bone after tooth extraction. Experimental study in rats. Int J Oral Maxillofac Surg. 1988;17(6): Tam G. Low power laser therapy and analgesic action. J Clin Laser Med Surg. 1999;17(1): Innov Implant J, Biomater Esthet. 2012/2013;7/8:22-26.

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