Isolamento e identificação de Campylobacter spp em amostras clínicas. Grace Theophilo LRNCEB - Fiocruz- IOC
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1 Isolamento e identificação de Campylobacter spp em amostras clínicas Grace Theophilo LRNCEB - Fiocruz- IOC gtheo@ioc.fiocruz.br
2 Bacilos Gram Características gerais Finos, curvos ou em forma de S Móveis com único flagelo em 1 ou ambas extremidades (movimento em saca rolha) Espécies são oxidase + e redutora de nitrito Não fermentam nem oxidam carboidratos Microaerofilia (3-5 % de O 2 e 2-10% de CO 2 ) Espécies termotolerantes C.coli e C lari C. jejuni,
3 Epidemiologia - Zoonose de distribuição mundial - Comensais no TGI (bovinos, suínos, cães, gatos e principalmente aves) - Infecções + freqüente nos meses quentes C. jejuni CDC 2,4 milhões de casos/ano C. coli Alimentos envolvidos - leite - carne de frango - carne bovina - carne suína Dose infectante: 500 mo C.jejuni: 10 4
4 Infecção Período de incubação : 2 a 10 dias Doença é autolimitante Período da infecção: 1 a 7 dias O microrganismo é excretado nas fezes durante várias semanas Infecção depende dos fatores do hospedeiro e do patógeno.
5 Patogenia Transmissão: fecal-oral e pessoa-pessoa -1 coloniza a mucosa intestinal -Invade através da superfície epitelial o tecido subjacente = inflamação na lâmina própria e abcessos nas criptas hemácias e leucócitos nas fezes
6 Sintomas 24 h após início dos sintomas - Dor abdominal, diarréia (aquosa ou com sangue),náusea, dor muscular e febre. - Infecções extra intestinais em imunocomprometidos: Colecistite Pancreatite SUH Síndrome de Guillén-Barré Nefrite
7 Isolamento e identificação Coleta A coleta da amostra pode ser realizada através de swab retal evacuação espontânea (Frasco) processada + rápido possível(sensível ao O 2 ) T >2 horas = meios de transporte
8 Meios detransporte Água Peptonada Alcalina com tioglicolato e cistina meio de Stuart modificado meio de Cary & Blair As amostras em meio de Cary & Blair - armazenadas a 4ºC
9 Preparo da Amostra Fecal Pode ser semeada diretamente em placa de Agar seletivo para Campylobacter suspensão em uma solução tampão (Solução Salina ou Água Peptonada 0,1%)
10 Meios de cultura = Isolamento - Agar Skirrow = chave do sucesso do isolamento Peptonas, sangue de cavalo e antibióticos - Meios c/ sangue : peptonas, sangue (ag. seqüestrante de O 2 ) e antibióticos Ex.: Agar Skirrow, Agar Butzler e Agar Preston LRNCEB Campylobacter Agar Base (Difco/214892)
11 Meios de cultura = Isolamento Meios s/ sangue: proteína, carvão (ag. seqüestrante de O2) e antibióticos Ex:mCCDA e Kamali Agar modificado de carvão, cefoperazona e desoxicolato LRNCEB Campylobacter Blood-free Selective Agar Base (Oxoid/CM 0739)
12 Antibióticos A inclusão dos antibióticos foi crucial para o isolamento: - Vancomicina = inibe cocos Gram + - Polimixina B = inibe enterobactérias e Pseudomonas spp - Trimetoprim = inibe Proteus spp e cocos gram + - Cefalosporina = inibe Enterobacter spp, Serratia spp, P. aeruginosa, alguns Proteus e Yersínia enterocolítica - Anfotericina B = inibe fungos
13 Atmosfera de Incubação - Substituição de uma atmosfera normal por uma mistura apropriada de gases (bomba de vácuo) - Utilização de geradores de gases comerciais. Ex: BBL, Oxoid, Bio-Meriuex e Probac - Geradores opcionais: Para jarra de 2,5 L de capacidade: ½ bombril embebido em solução de sulfato de cobre ½ Alka-Seltzer (em uma placa) acrescida de Sol. Sulfato de cobre
14 Fluxograma de isolamento e identificação presuntiva de Campylobacter sp Plaqueamento em ágar seletivo ágar seletivo + suplemento seletivo (Merck) 42ºC/48h (microaerofilia) Isolamento Identificação Presuntiva Bioquímica
15 Identificação Presuntiva -Coloração de Gram - Motilidade
16 Identificação Presuntiva - Teste de Catalase LRNCEB (Difco/261203) - Teste de Oxidase LRNCEB (Difco/261181)
17 Diferenciação das espécies -Hidrólise do Hipurato LRNCEB Ác. Hipúrico sal sódico (Sigma/H9380) - Termo-tolerância -Hidrólise do Indoxil-Acetato LRNCEB Indoxyl acetate (Sigma/076K1485)
18 Diferenciação das espécies Teste de Sensibilidade a Antibióticos (Ácido Nalidíxico e Cefalotina) LRNCEB (Oxoid) Produção de H2S em TSI
19 Prova C.fetus ssp.fetus C.hyointes tinalis C.jejuni ssp.jeju ni C.jejuni ssp.doylei C.coli C.lari C.upsalie nsis Catalase V Redução de NO Produção de H 2 S (TSI) V - - Hidrólise do: -hipurato V indoxilacetato Crescimento : 25 C + V C C - V V Sensibilidade: Acido nalidíxico V R S S S R S Cefalotina S S R S R R S
20 FIM!!!!!
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Campylobacter jejuni
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