Pesquisa de Salmonella spp. em alimentos

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Nathan Deluca Barateiro
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1 Pesquisa de Salmonella spp. em Profa. Samira Mantilla Aluna: Rosemary Araújo

2 1 CARACTERÍSTICAS E TAXONOMIA DO MICRORGANISMO TAXONOMIA Enterobacteriaceae Mais de 2463 sorotipos Algumas mudanças ocorreram na taxonomia da Salmonella. Todas as salmonelas foram agrupadas em duas espécies: S. enterica e S. bongori. E os sorovares (subdivisão das espécies baseadas nas diferenças antigênicas) foram divididos em subespécies, muitas classificadas como S. enterica. Então, a forma existente há muito tempo de tratar sorovares de Salmonella como espécies não é mais válida. Ex: S. typhimurium deve ser referenciada como S. enterica sorovar Typhimurium ou somente S. Typhymurium.

3 CARACTERÍSTICAS BGN maioria é móvel (flagelos peritríquios), não produtores de esporos Anaeróbios facultativos Produzem gás a partir da glicose (menos S. Typhi) antígenos: somáticos = O termoestáveis polissacarídeos membrana flagelares = H termolábeis proteínas dos flagelos capsulares = K termoestáveis polissacarídeos-cápsulas

4 Temperatura ideal: C (mínima 5 e máxima 47 C) ph ótimo pra multiplicação: 7,0 Não resiste a ph <4,0 e > que 9,0 Não toleram concentrações de sal superiores a 9% O nitrito é inibitório

5 Epidemiologicamente, as salmoinelas podem ser distribuídas em três grupos: 1- As que infectam somente os homens: S. Typhi, S. Paratyphi. 2- Sorovares adaptados ao hospedeiro (alguns dos quais são patógenos humanos e costumam ser adquiridos por meio de ): S. Gallinarum (frango), S. Dublin (gado), S. Abortus-equi (equino), S. Abortus-ovis (ovino) e S. Choleraesuis (suíno) 3- Sorovares não adaptados (sem preferência por hospedeiro)- são patogênicos aos homens e animais, incluindo muitos sorovares causadores de infecções alimentares.

6 2 DISTRIBUIÇÃO AMBIENTAL Amplamente distribuídas na natureza, sendo o trato intestinal do homem e de animas os principal reservatório natural. Entre os animas, as aves são as mais importantes (aves podem se portadores assintomáticos=eliminação de Salmonella nas fezes. Alimentos envolvidos: Carnes resfriadas congeladas ph= 4,5-9,0 temperatura até 41-45ºC; ovos, leite cru. Água do mar (3% NaCl): pescado

7 Causas da salmonelose humana consumo contaminados métodos de processamento tecnológico - Transmissão direta (animal animal; humanohumano) fontes residuais (água esgoto); processados Salmonelose impacto: sócio-econômico alimentar saúde coletiva

8 3 CARACTERÍSTICA DA DOENÇA As doenças causadas por salmonelas são divididas em: Febre tifóide (S. Typhi) Febres entéricas (S. Paratyphi) Enterocolites demais salmonelas

9 Febre tifóide Só acomete o homem (água e contaminados com material fecal humano). Sintomas muito graves: septicemia, febre alta, diarréia, vômito Se multiplicam dentro de células fagocitárias Duram 1-8 semanas Antibióticos: cloranfenicol e ampicilina

10 Febre entérica Semelhante a tifóide, mas os sintomas são mais brandos. No máximo 3 semanas Antibióticos mesmo da outra

12 Enterocolites (salmoneloses) A infecção alimentar é causada pela ingestão de que contenham números significativos de sorovares não hospedeiroespecíficos do gênero Salmonella. A S. Choleraesuis foi descrita como a que apresenta a maior taxa de mortalidade (21%). S. Dublin e S. Enteretidis também são as mais patogênicas para o homem. Diarréia, vômito, febre, dores abdominais PI:12-36 h, dura 4 dias geralmente não necessitam de antibióticos Muitos pacientes tornam-se portadores após a cura da doença!!!! Em crianças e imunodeprimidos: pode ser grave: atingir outros orgãos

13 Mecanismos de patogenicidade: Começa na mucosa do intestino delgado e cólon Salmonelas atravessam a camada epitelial intestinal, alcançam a lâmina própria (camada na qual as células epiteliais estão ancoradas) onde proliferam Causam uma mudança na aparência da superfície da célula hospedeira, resultando na internalização da bactéria em uma vesícula este efeito é denominado arrepio. São fagocitadas resultando em resposta inflamatória. Ao contrário das outras doenças (febre entérica e tifóide), neste caso, as salmonelas ficam somente nesta lâmina, não indo para corrente circulatória.

14 Uma vez dentro das células de defesa, as salmonelas permanecem em vacúolos ligados à membrana durante todo o seu estágio intracelular. Após a multiplicação, as células se rompem e o patógeno é disseminado.

15 Endotoxina (LPS) seu papel como agentes causadores de diarréia é questionado Todos os sorovares de S. enterica apresentam ilhas de patpgenicidade (SPI)-regiões do DNA bacteriano que possuem um número de genes de virulência. Enterotoxina: acredita-se que esta é responsável pelo processo diarréico Adesinas:fímbrias Citotoxina: inibidora da síntese protéica Proteína SpiC previne a fusão das vesículas com os lisossomos (capacidade de x dentro dos fagócitos)

16 4 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO 4.1 ENRIQUECIMENTO NÃO SELETIVO OU PRÉ-ENRIQUECIMENTO Meio Caldo nutritivo não seletivo Água Peptonada Tamponada (APT) Incubação C/24h

17 4.2 ENRIQUECIMENTO SELETIVO Meio Caldo nutritivo seletivo Meios : Caldo Rappaport e Caldo Selenito Cistina Caldo Tetrationato tb pode ser usado Incubação: banho-maria 41 C ± 0,5/24h (ou /24h)

18 4.3 PLAQUEAMENTO SELETIVO Classificação dos meios: baixa, média e alta seletividade Baixa seletividade Ágar Mac Conkey Ágar Eosina Azul de Metileno Média seletividade Ágar Salmonella Shigella Ágar Hektoen Alta seletividade Ágar XLD (xilose lisina desoxicolato) Ágar BPLS (verde brilhantevermelho de fenol-lactose-sacarose) Incubação C/24h

19 Ágar Hektoen: colônias verdes ou pretas (H2S)

20 Ágar XLD: colônias vermelhas, da cor do meio ou pretas (H2S)

21 4.4 TRIAGEM Selecionar duas colônias características de cada placa Meios: Ágar Triple Sugar Iron (TSI) indicador: vermelho de fenol Ágar Lisine Iron (LIA) indicador púrpura de bromocresol

22 TSI Se a bactéria fermentar apenas a glicose (presente em baixa concentração 0,1g), a quantidade de ácido produzida será suficiente somente para provocar a viragem no fundo do tubo. Mas se a bact utilizar tb lactose e/ou sacarose, produzirá muito ácido, virando todo o meio para amarelo.

23 Leitura: TSI: Base amarela com ou sem produção de gás; produção de sulfeto de hidrogênio: muitos aa contém enxofre e a salmonela pode usá-lo produzindo H2S. O ágar TSI contêm sal de ferro. A reação do sal de ferro com o H2S produz sulfeto ferroso que é um sal preto; bisel rosa ou inalterado Não inoculado Típico de Salmonella

24 LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original). A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)

25 Leitura LIA: Não muda de cor + Observa-se produção de sulfeto Descarboxila a lisina meio alcalino

26 LIA: a bactéria fermenta a glicose (fica amarelo), depois que acaba a glicose do meio, a salmonela vai utilizar o aa lisina, gerando metabólitos alcalinos, virando a cor do meio para púrpura novamente (meio volta a cor púrpura original). A bactéria que não descarboxila a lisina continua com o meio ácido (amarelo)

27 4.5 SERIAÇÃO BIOQUÍMICA Uréia (-) Caldo uréia Meio SIM(sulfeto, indol, motilidade) (+) (-) (+) Caldo uréia e meio SIM:Incubação C/24h Oxidase (-) palito esterilizado tiras. Leitura em segundos.

28 Leitura: Caldo uréia permanece da mesma cor (uréia negativo) não produz a enzima urease SIM- produção de sulfeto, motilidade e indol negativo Teste do indol: verifica se a bactéria é capaz de desaminar o aa triptofano libera indol que é detectado pelo reativo de Kovacs. A reação do indol com o reativo de Kovacs gera uma coloração avermelhada. Oxidase: verifica a presença da enzima citocromo c oxidase (transfere elétrons na cadeia). O reativo, ao receber os elétrons, na cadeia respiratória de oxida e muda de cor =azul

29 SIM

30 Comportamentos atípicos: Fermentação da lactose: TSI todo amarelo Fermentação sacarose: TSI com o bisel amarelo Não produção de sulfeto (14% não produz sulfeto) Não descarboxilação da lisina (meio ácido). 4 a 5% são lisina negativo Produção do indol (anel vermelho no meio SIM). 1% são indol + Não motilidade: algumas são imóveis

33 4.6 SOROLOGIA Triple Sugar Iron Ágar Nutriente Suspensão Bacteriana Soro Polivalente Aglutinação

35 Resultado Positivo para Salmonella spp. quando as culturas apresentarem reações típicas nas provas bioquímicas E reação sorológica + (antisoro polivalente O) Resultado: Presença ou ausência em 25g

36 5 MEDIDAS PREVENTIVAS Calor Exclusão competitiva: impede que a Salmonella colonize o TGI das aves no início de suas vidas: culturas microbianas mistas contendo bactérias inócuas que ocuparão os sítios de ligação das salmonelas reduz a presença deste patógeno na granja

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