Tempo gasto na análise O MÉTODO ANALÍTICO E SUAS ETAPAS PRINCIPAIS PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANALITOS ORGÂNICOS. Fontes de erro em cromatografia

Transcrição

1 PREPAR DE AMSTRAS PARA ANALITS RGÂNICS Material desenvolvido por: Prof. Dr. Fábio Augusto (Unicamp) Profa. Dra. Maria Elisa Pereira Bastos de Siqueira (Unifal-MG) Profa. Dra. Isarita Martins (Unifal-MG) Por quê é necessário o preparo da amostra?? Amostra coletada x PLC, ou LC-MS/MS Amostra = não apropriada para a análise...pr QUÊ?? Muito suja contém outros componentes na matriz que interferem com a análise Muito diluída analitos não estão concentrados suficientemente para perimitir a detecção Matriz não compatível ou perigosa para a coluna/sistema cromatográfico Métodos de preparo de para análises cromatográficas método analítico e suas principais etapas Preparo de : fundamentos Extração líquido-líquido - ELL Extração em fase sólida - SPE eadspace estático e dinâmico Fontes de erro em cromatografia Contaminação (4%) Introdução da amostra (6%) Cromatografia (7%) Colunas (11%) Integração (6%) Instrumento (8%) perador (19%) Calibração (9%) Processos miniaturizados: SPME, LPME, SBSE, etc utros: extração em fluido supercrítico (SFE), em SPE com polímeros de impressão molecular (MISPE), em membranas, extração acelerada por solventes (ASE), etc Processamento da amostra (30%) Tempo gasto na análise Tratamento dos dados (27%) Coleta (6%) MÉTD ANALÍTIC E SUAS ETAPAS PRINCIPAIS Análise (6%) Processamento da amostra (61%) 1

2 Etapas do procedimento analítico Amostragem Preparo das Coleta de representativas do material a ser analisado Eliminação de interferentes e isolamento dos analitos de interesse amostragem preparodaamostra amostra separação Identificação e/ou quantificação Separação, identificação e quantificação dos analitos quantificação análise estatística tomada de decisões Processamento dos resultados Métodos algébricos/ estatísticos para estimar quantidades e incertezas Avaliação dos resultados Decisão sobre ações a serem tomadas em face aos resultados Método idealizado de preparo de amostra PREPAR DE AMSTRAS: FUNDAMENTS analito interferente matriz Volume Vam da amostra contendo n gramas de analito Concentração = C am Separar analitos quantitativamente dos interferentes da matriz n g de analito concentrados em um volume V am V final << V am C final >> C am Cromatografar a porção concentrada e limpa de analito CG/CLAE Preparo de : finalidades Isolar os componentes de interesse (analitos) de uma matriz. preparo de envolve procedimentos de extração e pode também incluir etapa de purificação (cleanup) para muito complexas. Esta etapa também objetiva trazer os analitos num nível de concentração adequado para a detecção e assim, técnicas de preparo de tipicamente incluem o enriquecimento. Finalidades do preparo de 1. Purificação (clean up) da amostra - eliminação de interferentes que possam danificar o sistema cromatográfico ou que possam interferir na identificação e/ou quantificação dos analitos. 2. Pré concentração dos analitos 2

3 Benefícios do preparo de 1. Tornar a matriz compatível com a fase móvel e o detector. 2. Proteger o sistema e coluna cromatográfica de contaminação por partículas e material de elevado peso molecular: - aumento da vida útil da coluna; - menor gasto com manutenção; - menos problemas operacionais. Benefícios do preparo de 3. Remover interferências: - simplificando a extração; - diminuindo o tempo de análise; - aumentando o limite de carga/ sensibilidade. 4. Concentrar componentes de interesse: - aumentando a sensibilidade (detectabilidade); - aumentando a reprodutibilidade. Preparo de biológicas Materiais biológicos são complexos: contêm proteínas, sais, bases, lipídeos, carboidratos e compostos orgânicos, às vezes similares quimicamente aos analitos. Analitos: presentes em quantidades muito pequenas na amostra e ainda ligados às proteínas. CM SEPARAR ANALITS, MATRIZ E INTERFERENTES? 1. Propriedades físico-químicas dos constituintes da amostra - analitos, interferentes e matriz são voláteis? - polares? apolares? -amostra: sólida? líquida? gasosa? - analitos são quimicamente e/ou termicamente estáveis? 2. Concentração de analitos e interferentes na amostra - Quais as concentrações esperadas de analitos e de interferentes na amostra? CM SEPARAR ANALITS, MATRIZ E INTERFERENTES? 3. Características da instrumentação disponível - detector é sensível? seletivo? específico? para o analito - Algum componente do sistema é incompatível com constituintes da amostra ou reagentes usados? 4. Requisitos técnico-gerenciais - Existe metodologia oficial/ oficiosa a ser seguida? - Quantas serão analisadas por dia? - Existe pessoal capacitado para cumprir estas demandas? Preparo de s objetivos da análise indicam quanto de esforço deve ser envidado no preparo da amostra. Quesitos para um eficiente preparo da amostra: a) Perda mínima da amostra e boa recuperação do analito; ) p ç ; b) Componentes existentes na amostra e sem interesse devem ser removidos eficientemente; c) Não devem ocorrer problemas no sistema cromatográfico; d) procedimento deve ser feito de forma conveniente e rápido; e) custo da análise deve ser baixo. 3

4 Preparo de : tipos de técnicas 1) Exaustivas objetivo é a remoção completa dos analitos da matriz e sua transferência para a fase extratora. - técnicas de equilíbrio batch (ELL), técnicas flow trough (SPE), extração em fluido supercrítico (SFE), e dinâmica, como em Soxhlet Preparo de : tipos de técnicas 2) Não-exaustivas baseadas em princípios de equilíbrio 2.1 Pequeno volume da fase extratora: SPME, LPME 2.2 Baixa constante de distribuição amostra/fase extratora: headspace Técnicas de preparo: "off-line" e "on-line... e in-line Tratamento prévio de REMÇÃ DE PRTEÍNAS: precipitação, ultrafiltração e diálise Desproteinização requer: (a) temperaturas elevadas (b)alteração da força iônica ou osmótica ou do p; (c) agentes orgânicos de precipitação; (d) enzimas proteolíticas. Tratamento prévio de REMÇÃ DE PRTEÍNAS: VANTAGENS (a) Simplicidade (2 a 3 etapas) (b) Baixo custo (c) Facilidade de automação Tratamento prévio de REMÇÃ DE PRTEÍNAS - PRBLEMAS - precipitação incompleta das proteínas (e algumas globulinas podem permanecer no sobrenadante e passarem para o sistema de detecção); - diluição da amostra (mais usado para concentrações mais elevadas de analitos); - geração de picos no CLAE ou interferência na leitura espectrofotométrica devido ao agente precipitante usado. Tratamento prévio de REMÇÃ DE PRTEÍNAS - Agentes mais usados: a) Solventes orgânicos miscíveis em água (metanol, etanol, acetonitrila, acetona, entre outros) b) Ácidos: tricloracético, perclórico, sulfosalicílico, túngstico c) idróxido de zinco 4

5 Tratamento prévio de IDRÓLISE DE CNJUGADS (a)específica ou enzimática, onde são utilizadas enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases Tratamento prévio de IDRÓLISE DE CNJUGADS (a)específica ou enzimática, onde são utilizadas enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases Fontes: elix pomatia (tbém sulfatases) e a Patella vulgata, elix aspersa e a Escherichia coli. - mais lenta, porém, menos vigorosa e mais seletiva, e não degrada os analitos; - exige que a atividade da enzima seja avaliada periodicamente, através do estudo de sua eficiência no processo de hidrólise; além disto, a atividade da enzima pode ser inibida por componentes da matriz. Tratamento prévio de IDRÓLISE DE CNJUGADS Principais processos físico-químicos de separação usados em metodologias de preparo de A PARTIÇÃ s analitos são removidos da amostra por dissolução em solvente apropriado b) Não-específicos, utilizando-se a hidrólise ácida ou alcalina. B ADSRÇÃ s analitos são coletados na superfície de um sólido com elevado poder adsortivo - utiliza condições extremas de p e de temperatura; - formação de produtos que interferem na extração e derivatização, ou no perfil cromatográfico dos analitos. C VLATILIZAÇÃ s analitos são evaporados seletivamente e separam-se da matriz e dos interferentes PARTIÇÃ: Princípio básico de operação PARTIÇÃ: fundamentos teóricos analito apolar matriz aquosa solvente apolar 1 volume V am da amostra com concentração C am do analito 2 volume V ext do solvente extrator adicionado 3 analitos dissolvem-se no solvente extrator até que ocorra o equilíbrio Como a afinidade dos analitos pelo solvente apolar é maior que sua afinidade pela matriz, eles tendem a se DISSLVER (serem absorvidos) nessa fase apolar, imiscível na matriz Na separação por partição, os analitos são transferidos da matriz para um solvente extrator, formando uma solução No equilíbrio: K = C ext / C res C res concentração residual na amostra C ext concentração na fase extratora K = constante de distribuição Parâmetro básico do equilíbrio de partição 5

6 PARTIÇÃ: fundamentos teóricos Equilíbrio de partição: C ext = n ext / V ext K = C ext / C res K = n ext / n res. V am / V ext PARTIÇÃ: materiais mais comuns 1. Solventes orgânicos: hidrocarbonetos (hexano, éter de petróleo); solventes organoalogenados (clorofórmio, diclorometano), etc. 2. Polímeros: acima da temperatura de transição vítrea (T g ), os polímeros orgânicos têm comportamento dissolvente semelhante aos dos líquidos convencionais C res = n res /V am A constante de distribuição K pode ser expressa em termos do volume de amostra V am e da fase extratora V ext usada, e das massas extraídas n ext e residual (não-extraída) n res Polidimetilsiloxano PDMS, silicona (T g = -120ºC) Poliacrilatos R = metila, etila, etc. (T g = - 24ºC) ADSRÇÃ: fundamento da operação ADSRÇÃ: dessorção dos analitos extraídos Gás inerte + aquecimento dessorção térmica Solvente orgânico dessorção por dissolução Adsorção é temporária!!! s analitos são transferidos seletivamente da matriz para o adsorvente Analitos dissolvidos em gás inerte CG Analitos dissolvidos em pequeno volume de solvente orgânico ADSRÇÃ: fundamentos teóricos Cada sítio ativo: liga uma molécula por vez ADSRÇÃ: fundamentos teóricos K ads = coeficiente de adsorção. DEPENDE da afinidade do analito pelo sólido adsorvente e pela matriz (similar ao K para a partição) A superfície contém número grande, porém finito, de sítios ativos ligação do analito no sítio ativo Atração entre dipolos (van der Waals): FISISRÇÃ Por ligação química covalente: QUIMISRÇÃ fisisorção Quanto mais elevado o K ads, maior a quantidade de analito adsorvida no equilíbrio. 6

7 ADSRÇÃ: classes de material adsorvente 1. CARVÕES: carvão ativo, carvão ativo grafitizado (Carboxeno ), peneiras moleculares carbonáceas (Carbosleves ). Grande afinidade por compostos orgânicos voláteis (e gasosas). Elevada estabilidade térmica (T max = o. C) ADSRÇÃ: classes de material adsorvente 3. PLÍMERS RGÂNICS: grande variedade de materiais Menor estabilidade térmica (T max = o C); podem se decompor e introduzir contaminantes (artefatos) nos extratos. 2. ADSRVENTES INRGÂNICS: quase sempre de alumina (Al 3 2 ) e sílica (Si 2 ) às vezes recobertos por filmes orgânicos quimicamente ligados. Mais usados para compostos orgânicos de diferentes volatilidades ( gasosas e líquidas). Alta estabilidade térmica (T max = o. C) Tenax TA Polioxi de 2,6- difenileno VLATILIZAÇÃ: fundamentos teóricos matriz aquosa ou sólida analito volátil fase gasosa (headspace) interferente não-volátil headspace (espaço confinante) pode ser introduzido diretamente no CG ou passar por outras etapas para isolamento do analito. Técnicas de extração mais usadas para analitos orgânicos de matrizes biológicas Extração líquido-líquido (LLE) Extração em fase sólida (SPE) Extração por headspace (S) Microextração em fase sólida (SPME) EXTRAÇÃ LÍQUID- LÍQUID (ELL) EXTRAÇÃ LÍQUID- LÍQUID (ELL) Baseia-se na afinidade da forma lipofílica do analito por um solvente orgânico 7

8 EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional A quantidade extraída depende do volume de amostra e de solvente extrator e da constante de distribuição K Eficiência da extração η η = K / K + β β = V am / V ext Aumento do volume do extrator incrementa a fração extraída de um analito em um determinado d volume da amostra, mas pode comprometer o efeito de pré-concentração do analito extraído. corre partição dos analitos entre a amostra aquosa e o solvente extrator orgânico. EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional Escolha do agente extrator: - maior compatibilidade com a ELL: baixo ponto de ebulição e baixa viscosidade; - seletividade maior: solventes menos polares Inalterado x Metabólitos Solvente Solubilidade % Isooctano eptano Ciclo-hexano exano 0,014 Pentano 0,040 Clorofórmio 0,815 Diclorometano 1,6 Éter etílico 6,89 Álcool Isobutílico 8,50 Acetato de Etila 8,70 EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional Tipos de solvente Triagem Mistura de solventes. Análise direcionada Solvente com maior afinidade pelo analito. Ácido hipúrico: acetato de etila EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional Concentração do extrato: Fluxo de N 2 Acelera a vaporização sem aumento da temperatura. t 2 xidar compostos mais sensíveis EFEIT SALTING UT C 2 C N C 3 Na + Cl - EXTRAÇÃ (líquido-líquido) = molécula de água + NaCl (cloreto de sódio) C 2 C C 3 N 8

9 EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID procedimento convencional: efeito do p EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional Extração ácida: p ácido substâncias de caráter ácido prevalecem na forma não ionizada, lipofílica EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional INFLUÊNCIA D p NA IDRSSLUBILIDADE/LIPSSLUBILIDADE substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nordelta -9-TC-C C3 C3 C C C511 ácido 11-nor-delta - 9-TC-C - C 3 C 3 C 5 11 C 3 C 3 C C não- Forma ionizada Forma ionizada EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional Extração básica: p básico substâncias de caráter básico prevalecem na forma não ionizada, lipofílica EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional INFLUÊNCIA D p NA IDRSSLUBILIDADE/LIPSSLUBILIDADE substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas C 2 C N C 3 Anfetamina + + C 2 C N C 3 - Forma ionizada C 2 C N C 3 Forma não-ionizada urina Agitação Centrifugação EXTRAÇÃ (líquido-líquido) Drogas/ metabólitos Separação da fase orgânica Solvente orgânico urina extrato 9

10 EXTRAÇÃ LÍQUID-LÍQUID: procedimento convencional Vantagem: extremamente simples e rápida Desvantagens: grande volume de solventes descarte do material formação de emulsão seletividade sofrível EXTRAÇÃ EM FASE SÓLIDA SLID PASE EXTRACTIN (SPE) efeito de pré-concentração limitado Extração em fase sólida Permite a separação seletiva, purificação e a concentração de compostos presentes em matrizes complexas PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Escolha do cartucho DEPENDE: volume da amostra, tipo de matriz, número e tipo de analitos, entre outros... CARTUC PARA SPE: seringa de polipropileno ou de vidro, contendo uma pequena quantidade de material sorvente ou adsorvente finamente granulado Mais usados: volume pequeno 200mg (1,2 ml amostra); volume grande 500mg (4-5 ml amostra). Massa de sorvente varia entre 25 mg e 10 g 10

11 PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Pre-tratamento da amostra, dependendo de: - tipo de analito; - tipo de matriz; - natureza da retenção química. ENVLVE: - ajuste de p; - centrifugação; - filtração; - diluição; - adição de tampão, etc PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 1 Condicionamento do dispositivo de extração Passagem de pequeno volume de solvente apropriado para umedecer o sorvente (grupos funcionais ligados) e garantir interação consistente Natureza do solvente: depende do sorvente [sílica e sorventes apolares metanol; sorventes polares solventes orgânicos] e da matriz PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 1 Condicionamento do dispositivo de extração - depende da aplicação do material de recheio; - necessário para ativar a fase; - não permite que o material seque. PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 2 Eluição da amostra (líquida ou aquosa) Passagem da amostra no sorvente Equilibrio: Sorvente/ fase é tratada com solução similar (em polaridade, p, etc) à matriz para maximizar a retenção dos analitos. PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 2 Eluição da amostra (líquida ou aquosa) - volume de μl al; - ajustes de p, força iônica pode ser feito; (analito permanece na forma não dissociada para ficar mais retido no adsorvente) Base fraca: p 2 acima do pka Ácido fraco: p 2 abaixo do pka - passar a amostra com vácuo ou pressão; - fluxo pode afetar a eficiência. PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 3 Lavagem do sorvente (clean up) Natureza do solvente para clean up: poder de dissolução suficiente para dessorver materiais fracamente sorvidos (interferentes?) mas não espécies fortemente sorvidas (analitos?) descarte 11

12 PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 3 Lavagem do sorvente (clean up) - eluição do material não desejado ou não retido é lavado com mesmo solvente da amostra; - passando um solvente mais forte que a amostra pode remover algumas impurezas indesejáveis (pode retirar o analito. Perigoso para a análise). PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 4 Dessorção dos analitos Solvente: deve possibilitar dessorção completa (quantitativa) dos analitos Volume do solvente: o menor possível (pré- concentração) Preferência a solventes voláteis Análise cromatográfica Aplicação da SPE: analitos não-voláteis e semi voláteis em aquosas + separação cromatográfica PERAÇÃ BÁSICA DE SPE Etapa 4 Dessorção dos analitos REGRAS N US DA SPE Analito deve ser adsorvido no sorvente da SPE - eluição com pequeno volume de solvente adequado (forte); Concentra o analito - duas alíquotas pequenas são mais eficientes que uma grande; - interação por vários segundos aumentam a eficiência da extração. Deve haver tempo suficiente de contato analito/sorvente Interferentes endógenos da amostra devem ser seletivamente separados dos analitos Analitos devem ser capazes de ser eficientemente removidos do sorvente SPE: Mecanismos de separação 1. Adsorção: material sólido que não apresenta filme líquido depositado na partícula - sílica gel SPE: Mecanismos de separação 2. PARTIÇÃ: com fase quimicamente ligada (comportamento similar a de um filme de sorvente líquido na superfície = partição) - fase normal: polar + matriz apolar retém analitos polares e os apolares são eluídos Sílica: diâmetro da partícula: μm Superfície: m 2 /g 12

13 FASE NRMAL : polares -INTERAÇÕES PLARES (Dipolo-dipolo, pontes de ) SPE: Mecanismos de separação CN Cianopropil Si C N N 2 Aminopropil Si N -fase reversa: apolar + matriz polar retém analitos apolares eospolares são eluídos 90% de uso em análises de fármacos e toxicantes 2 Diol Si N Deseja reter um analito apolar não dissociado num meio aquoso. Matriz polar: urina SPE FASE REVERSA: REGRAS Retenção: mecanismos não-polares ou interações hidrofóbicas Matriz (amostra): aquosa (fluidos biológicos, águas) Características ti dos analitos: exibirem grupos funcionais não polares (a maioria de analitos orgânicos) Esquema de eluição: interações hidrofóbicas são rompidas com soluções mais hidrofóbicas ou com solventes (metanol, diclorometano, etc ou combinação de água ou tampões/solventes) FASE REVERSA: apolares -INTERAÇÕES NÃ-PLARES (Van der Waals) C8 ctila C Ciclo hexila Si Si P Fenila Si Papel crítico do p em SPE SPE: Mecanismos de separação -fases especiais e mecanismos mistos: fase mista contém parte da molécula apolar e parte com radicais polares: usadas para reter analitos polares e apolares Pouco eficiente: retém muitos interferentes 13

14 SPE: Mecanismos de separação 3. Pareamento iônico Fase apolar + matriz polar com analitos iônicos. Adição de contra-íon neutraliza o analito que é retido na fase apolar (=mecanismo da fase reversa) dentro da própria matriz passa um íon e depois um contra íon SPE: Mecanismos de separação 4. Troca iônica Fase modificada com funcionalidade iônica; analito de carga oposta à fase será retido. Trocadores aniônicos fortes (tetra alquilamôneo) e fracos (amina) Trocadores catiônicos fortes (ácido sulfônico) e fracos (ácido carboxílicos) SPE: TRCA IÔNICA -INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática) SPE TRCA IÔNICA : regras Mecanismos de retenção interações eletrostáticas - o sorvente e os grupos funcionais do analito devem ter cargas opostas CBA Ácido carboxílico Si C - + N 3 R SCX Ácido benzenosulfônico Si S N 3 Amostra (matriz) não polar ou polar com baixo teor de sais ( < 0,1 M) Características do analito troca catiônica para compostos básicos (ex: aminas) troca aniônica para compostos acídicos (ex. ácidos carboxílicos, ácidos sulfônicos, fosfatos) SAX Trimetil aminopropil Si N + (C 3 ) 3 - S 3 R Esquema de eluição! quebra de ligações eletrostáticas - modificação do p para neutralizar grupos funcionais do analito ou sorvente; - aumento da concentração de sal ( < 0,1 M) - uso de um contra-íon de grande seletividade para o sorvente com relação ao analito Natureza dos solventes x SPE Se for usada a partição: K = C ext / C res afinidade sorvente K = f { afinidade matriz/ solvente de eluição Concentração no equilíbrio: C ext = na fase sorvente extratora C res = na amostra ou solvente de eluição Eluição da amostra Clean up Dessorção dos analittos Sorção dos analitos Dessorção de interferentes Dessorção de analitos INSTRUMENTAÇÃ PARA SPE SPE pode trabalhar on line (analitos transferidos diretamente do SPE para o CG ou PLC) ou off line (analitos coletados em tubos e transferidos para o cromatógrafo) K alto K baixo K baixo Matriz com menor afinidade pelos analitos de que o solvente Solvente com maior afinidade pelos interferentes de que o sorvente Solvente com maior afinidade pelos analitos de que o sorvente 14

15 INSTRUMENAÇÃ PARA SPE DISCS DE SPE peração similar à filtração à vácuo DISCS DE SPE Recomendados: para grandes volumes de amostra contendo material particulado Extração mais rápida de que em cartuchos, permitindo uso de vazões elevadas de amostra. Volumes maiores de amostra podem ser necessários para aumentar a detectabilidade dos analitos. DESVANTAGENS DA SPE Maior dificuldade para otimizar seu uso (desenvolvimento do método) Grande variedade de substâncias químicas, muitas escolhas para manipular solventes Várias etapas e maior tempo requerido Maior custo por amostra VANTAGENS DA SPE uso de pequeno volume de solvente pouco manuseio da amostra ausência de emulsão facilidade na automação baixo consumo de vidrarias menor tempo de análise menor custo de mão de obra 15

16 EXTRAÇÃ PR EADSPACE DETERMINAÇÃ DE VLÁTEIS Amostra (urina, seringa sangue ou saliva) ESTUFA 70 C + sulfato de sódio + PI 30 min GC 16