Óleo essencial de Melaleuca Alternifólia: otimização do método analítico. Essential oil from Melaleuca Alternifólia: optimization of analytical method

Transcrição

1 Óleo essencial de Melaleuca Alternifólia: ARTIGO otimização ORIGINAL do método / ORIGINAL analítico ARTICLE Óleo essencial de Melaleuca Alternifólia: otimização do método analítico Essential oil from Melaleuca Alternifólia: optimization of analytical method Emerson Rolim de Jesus * Ricardo M. Ellensohn ** Claudia Smanioto Barin *** * UniversidadeNorte do Paraná (UNOPAR). ** Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). UniversidadeNorte do Paraná (UNOPAR). *** Universidade de São Paulo (USP). UniversidadeNorte do Paraná (UNOPAR). Resumo Os óleos essenciais, obtidos de partes de plantas por arraste de vapor d água, são misturas complexas de substâncias voláteis, geralmente odoríferas e líquidas. O óleo de Melaleuca alternifolia é de origem australiana, tem em sua composição mais de 100 compostos, sendo seu principal componente o 4-terpineol. Este óleo vem sendo utilizado há várias décadas por sua ação antiinflamatória, antifúngica e antibacteriana. Considerando-se que para este óleo ter maior valor comercial a concentração de 4-terpineol deve ser maior que 30%, é importante dispor de um método rápido e seguro para a análise de sua composição. Palavras-chave: Óleo essencial. Melaleuca alternifólia. Cromatografia gasosa. Abstract Essential oils obtained from parts of plants by steam distillation are complex mixtures of generally odorific and liquid volatile substances. The oil from Melaleuca alternifolia is Australian and consists of more than 100 components. However, its main component is 4-terpineol. This oil has been used for several decades due to its anti-inflammatory, antifungal and antibacterial action. Considering that for such an oil to have higher commercial value the 4-terpineol concentration should be higher than 30%, it is very important to have a quick and safe method for the analysis of its composition. Keywords: Essential oil. Melaleuca alternifolia. Gas Chromatography. 1 Introdução Segundo a ISO (International Standard Organization), óleos voláteis são produtos obtidos de partes de plantas através da destilação por arraste de vapor d água. São misturas complexas de substâncias voláteis, geralmente odoríferas e líquidas, também denominadas óleos essenciais, sendo sua principal característica a volatilidade, o que os diferencia dos óleos fixos, que são misturas de substâncias lipídicas extraídas de sementes. Outra característica é o aroma agradável e intenso em sua grande maioria, por isso são também chamados de essências. São solúveis em solventes orgânicos apolares como éter, daí a denominação de óleos etéreos. Os óleos essenciais têm solubilidade limitada em água, tem sabor geralmente ácido e picante e cor ligeiramente amarelada. São constituídos por hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, entre outros. Tais compostos se apresentam em diferentes concentrações na mistura, daí o fato de um composto majoritário em um óleo essencial estar presente na forma de traços na composição de outro óleo essencial (SIMÕES et al., 2000). O óleo essencial em estudo é o óleo de Melaleuca alternifolia, também conhecida como tea tree (árvore do chá), pertencente ao gênero mytraceae. É nativa de uma região inóspita da Austrália e se desenvolve principalmente em áreas de pântano próximas a rios no seu estado nativo, e por sofrer com as condições hostis do solo, do clima e dos constantes ataques de microorganismos, especialmente fungos, desenvolveu mecanismos de defesa que não podem ser observados em outros ecossistemas (LÁSZLÓ, 2007). Em 1920, o Dr. A. R. Penefold, um químico do Governo em Sydney, Austrália, recebeu o crédito pelo início da pesquisa clínica em seres humanos e documentação dos diversos benefícios associados com o óleo de M. alternifolia. Seus estudos determinaram que este óleo possui um potencial cerca de 11 a 13 vezes mais poderoso que o fenol para matar bactérias e fungos (LÁSZLÓ, 2007). Desde 1996, a composição do óleo de M. alternifolia é padronizada pelo International Standard for tea tree oil intitulado Oil of Melaleuca Terpinen-4-ol type (tea tree oil) e os 14 compostos mais importantes têm especificações a serem cumpridas (Tabela 1). A composição química de suas folhas é bem conhecida, sendo o principal componente o 4-terpineol (Figura 1), que é o principal responsável por suas propriedades medicinais, devido ao seu excelente poder anti-séptico, fazendo deste óleo um potente ativo devastador contra uma larga faixa de microrganismos (fungos, vírus e bactérias) (BARBOSA et al., 2004), bem como a sua boa penetração e escassez de irritação quando aplicado pela via tópica e mucosa. Outra JESUS, E. R.; ELLENSOHN, R. M.; BARIN, C. S. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas. Tecnol., Londrina, v. 6, p , nov

2 característica importante é sua capacidade de se misturar à secreção sebácea e penetrar na epiderme, é por este motivo esta planta vem sendo utilizada com fins medicinais há várias décadas (LÁSZLÓ, 2007). Tabela 1. Composição requerida para o óleo essencial de Melaleuca alternifolia. Composto Mínimo (%) Máximo (%) terpinoleno 1,5 5 cineol - 15 α-terpineno 5 13 γ-terpineno δ-terpineno 0, terpineol 30 - α-terpineol 1,5 8 limoneno 0,5 4 sabineno traços 3,5 aromadendreno traços 7 δ-cadineno traços 8 globulol traços 3 viridiflorol traços 1,5 α-pineno 1 6 OH Figura 1. Estrutura do 4-terpineol. Dentre os diversos tipos de aplicação que este óleo possui, pode-se dizer que o mais interessante é a eliminação de bactérias causadoras de infecções. Pesquisadores australianos demonstraram uma ação rápida in vitro, inferior a uma hora sobre todas as bactérias das colônias estudadas, em diluições que variaram de 0,5% à 1,25%, conforme o tipo de microrganismo (Tabela 2). Foi também estudada a ação do óleo essencial de M. alternifolia sobre um supermicróbio, comumente resistente à meticilina (MRSA), o Staphylococcus aureus, uma bactéria hospitalar que não responde a antibióticos e mata pacientes em todo o mundo. Foi descoberto que apenas uma pequena quantidade deste óleo (numa concentração de 0,25%, equivalente a 5 gotas em 100 ml de água), foi suficiente para inibir o crescimento bacteriano; com o dobro da dosagem (0,5%), este óleo mata esta bactéria. Desta forma, a utilização deste óleo é válida não só para aplicação em infecções, mas também pode ser usado na purificação de água e alimentos (como alternativa ao cloro) e no ar (em difusores ou ar condicionado) (LÁSZLÓ, 2007). O que torna o óleo essencial de M. alternifolia um excelente anti-séptico é a dificuldade que os microrganismos encontram de modificar seu sistema enzimático para criar resistência a ele, este fato se deve a sua composição química complexa, que apresenta mais de 100 componentes (LÁSZLO, 2007). O 4-terpineol, quando usado de forma isolada, apresenta resultados semelhantes ao óleo puro, e de forma ainda mais efetiva. Quanto maior o teor de 4- terpineol, melhor sua ação antimicrobiana. O cineol, também conhecido como eucaliptol (Figura 2), agrega ao óleo, quando presente em grandes porcentagens (15%), potencial expectorante e descongestionante das vias respiratórias. Mas com o aumento do teor de cineol no óleo, diminui o teor de 4- terpineol, diminuindo seu valor comercial e a eficácia do mesmo contra infecções (LÁSZLÓ, 2007). Tabela 2. Ação in vitro do óleo de Melaleuca alternifolia MICRORGANISMO DOSAGEM (% V/V) Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae 0.25 Streptococcus faecalis 1.0 Streptococcus pyrogenes 1.0 Streptococcus agalactiae 1.25 Propionibacterium acnes 0.75 Beta haemolytic streptococcus 0.5 Escherichia coli 0.5 Klebsiella pneumoniae Citrobacter spp Shigella sonnei 0.5 Proteus mirabilis Legionella spp Pseudomonas aeruginosa 2.0 Trichophyton mentagrophytes 0.75 Trichophyton rubrum 0.5 Aspergillus niger 1.0 Aspergillus flavus 0.25 Candida albicans 0.5 Microsporum canis 1.0 Microsporum gypseum 1.0 Thermoactinomycetes vulgarus 1.25 Fonte: László (2007) O Figura 2. Estrutura do Cineol (Eucaliptol). 68 JESUS, E. R.; ELLENSOHN, R. M.; BARIN, C. S. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas. Tecnol., Londrina, v. 6, p , nov. 2007

3 As dosagens mais comumente utilizadas do óleo de M. alternifolia são: cosméticos (0,5 a 5,0%); contra infecções resistentes (produto puro); como conservante natural (0,5 a 1,0%). Dentre as principais aplicações deste óleo essencial pode-se destacar: acne, tínea, onicomicoses, queimaduras, picadas de inseto, bolhas, calosidades e verrugas, dermatite e eczema (alívio dos sintomas), erupções da pele, eritema solar, prurido, cortes e abrasões, pé de atleta e mau odor nos pés, crostas nas cabeças de bebês, sangramento de gengivas, mau hálito, infecções na garganta, congestão nasal e sinusite, dores musculares, candidíase, em uso veterinário, desinfecção de ambientes (OFICI- NA DAS ERVAS, 2006). O óleo de M. alternifolia não é comumente indicado para ser utilizado internamente, porém apresenta excelentes resultados quando poucas gotas são diluídas em água e a solução é ingerida, principalmente no tratamento de infecções. Mas, recomenda-se que seu uso seja feito sob a orientação de um especialista que tenha conhecimento sobre as dosagens no uso interno de óleos essenciais (LÁSZLÓ, 2007). A concentração deste óleo volátil na planta está em torno de 2% da massa verde. Comparando com óleos essenciais extraídos de outras plantas de uso comercial como o eucalipto com concentração em torno de 1%, e verificando também a composição da massa verde de plantas (Tabela 3), pode-se concluir que o teor do óleo de M. alternifolia é o maior dentre os demais óleos essenciais (KOKETSU; GONÇALVES, 1991). Tabela 3. Composição presente em um extrato vegetal bruto. Componentes Participação em peso (%) Água Açúcares 5,0 8,0 Compostos nitrogenados 0,5 0,8 Lipídios 0,2 0,5 Óleo essencial 0,2 2,0 Minerais 0,5 0,9 Fonte: Koketsu e Gonçalves, (1991) Hoje, a maior parte da produção do óleo de M. alternifolia encontra-se centralizada na Austrália, mas existem fazendas também na China, Índia, Europa e agora no Brasil. Um trabalho de cultivo iniciado em Viçosa, interior de MG, permitiu a entrada no mercado de um óleo de excelente qualidade e preço competitivo ao do australiano. O óleo de M. alternifolia pode ser classificado em três quimiotipos (QT) principais de acordo com os teores de seus princípios ativos, que podem variar conforme clima, ph do solo, temperatura, etc (LÁSZLÓ, 2007). O QT 1 do tea tree possui o teor mais elevado de 4- terpineol, variando de 30-45%. Óleo comumente de origem australiana e brasileira. O QT 2 possui mais cineol (eucaliptol), chegando a cerca de 15%. Óleo de origem chinesa. A Austrália produz, mas praticamente não entra no mercado. O QT 3 possui mais terpinoleno, que pode ir além de 15%. De origem Australiana. Esta planta foi trazida para o Brasil no início da década de 90 e se adaptou bem ao clima do país, atualmente há plantações nas regiões sul e sudeste e o óleo produzido é de boa qualidade, já que para se obter maior valor comercial a percentagem de 4- terpineol (agente microbicida) deve estar acima de 30%, enquanto que a percentagem de cineol (agente irritante) deve estar abaixo de 15%, pois deste modo se enquadra na classificação QT 1 de maior valor no mercado (LÁSZLÓ, 2007). Todos os órgãos de uma planta podem acumular óleos voláteis, porém sua composição pode variar de acordo com o órgão em que está acumulado e podem apresentar composição, características físico-químicas e odores distintos (SIMÕES et al., 2000). A composição de um óleo volátil de uma planta além de ser específica para um determinado órgão é característica para o seu estágio de desenvolvimento, mas as condições ambientais como temperatura, umidade relativa, tempo de exposição ao sol e ventos têm influência nesta composição, principalmente em espécies que têm estocagem de óleos em órgãos de superfície. Outro fator que tem influência na composição dos óleos voláteis é a hidratação do terreno e a presença de micronutrientes (N, P, K), estas influências variam de acordo com cada espécie (SIMÕES et al., 2000). A colheita de planta para extração de um óleo volátil deve ser feita nos horários de menor exposição ao sol, pois o sol pode provocar perda significativa do óleo antes de se iniciar o processo de extração. A forma de extração mais apropriada para óleos essenciais é a destilação por arraste de vapor d água (SIMÕES et al., 2000). A conservação de um óleo essencial requer cuidados especiais devido à volatilidade dos analitos que os compõe; um armazenamento mal feito altera sua composição inicial e isto reduz seu valor comercial. Os óleos essenciais devem ser guardados em frascos de pequeno volume, embalagens inertes, feitas de alumínio, aço inoxidável ou vidros âmbar, cheios e hermeticamente fechados, e devem ser armazenados a baixas temperaturas (SIMÕES et al., 2000). Os óleos voláteis apresentam problemas de qualidade, que podem ter origem em variações na sua composição, na adulteração ou falsificação, ou mesmo na identificação incorreta do produto e sua origem, isto porque grande parte dos produtores não identifica corretamente a planta da qual o produto foi extraído (nome científico), já que plantas com nomes científicos diferentes podem ter nomes usuais iguais dependendo da região que se encontram, e também não se identifica a parte vegetal da qual o óleo foi extraído. Sua adulteração e falsificação são conhecidas há muito tempo e podem causar, além dos prejuízos econômicos, problemas à saúde do usuário. Os procedimentos mais comuns para se falsificar óleos voláteis são: mistura com outros óleos voláteis de menor valor e adição de compostos sintéticos de baixo preço. JESUS, E. R.; ELLENSOHN, R. M.; BARIN, C. S. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas. Tecnol., Londrina, v. 6, p , nov

4 Devido às sofisticadas formas de adulteração, é cada vez mais difícil detectá-las por métodos relativamente simples. A composição química dos óleos voláteis é muito complexa e, em virtude desta complexidade, as análises por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) são as mais indicadas e mais utilizadas na identificação dos componentes destes óleos. Devido sua alta seletividade, a cromatografia gasosa é muito utilizada na análise de óleos voláteis, sendo o tempo de análise uma das principais vantagens deste método. O uso de colunas capilares proporciona maior resolução, menores tempos de análise e maior sensibilidade. Em virtude da volatilidade dos componentes do óleo a etapa de preparo da amostra pode ser simplificada, necessitando apenas a solubilização do óleo em solvente adequado, tornando a análise mais rápida. Os componentes do óleo são identificados a partir da comparação do tempo de retenção deste com seu padrão correspondente, para a quantificação percentual de cada componente utilizou-se o método de normalização de área. A análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permite, além da separação dos compostos, um espectro de massas para cada analito, o que permite sua identificação através da comparação do padrão de fragmentação com dados da literatura e banco de dados do equipamento. Atualmente o método utilizado para análise do óleo de M. alternifolia é realizado de acordo com as normas de legislação da International Fragrance Association (IFRA) e Research Institute for Fragrance Materials (RIFM), organizações criadas para controlar e analisar os riscos das substâncias odoríferas. Os materiais utilizados e parâmetros de análise são os seguintes: coluna: BP metros; injetor: split/ splitless - temperatura: 250 C; detector: FID - temperatura: 250 C; gás de arraste (fase móvel) - Hélio; pressão 12 psi modo pressão constante; temperatura da coluna: 60 a 200 C com aquecimento de 2 C/min. O esperado para uma análise de cromatografia gasosa utilizando colunas capilares é que esta tenha uma boa seletividade e que o tempo de análise seja curto. Avaliando os resultados da análise em questão pôdese concluir que a seletividade é muito boa, mas o tempo de análise é relativamente longo, portanto, é possível diminuir este tempo melhorando a temperatura do injetor e a rampa de temperatura (aumentando a velocidade de aquecimento da coluna). O objetivo deste trabalho foi propor modificações na metodologia utilizada atualmente, a fim de reduzir o tempo de análise do óleo de M. alternifolia e manter a boa seletividade do método de referência. 2 Materiais, Métodos e Desenvolvimento O óleo essencial de M. alternifolia utilizado nas análises foi o produzido e comercializado pela empresa LARIX Óleos Essenciais de Viçosa-MG. O equipamento usado nas análises foi um cromatógrafo a gás da marca Hewlett Packard (HP 6890), equipado com detector de ionização de chama (FID) e injetor SPLIT-SPLITLESS; coluna capilar com fase estacionária de polimetilsiloxano (apolar) de sílica fundida, 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 micra (recomendamos o uso de HP-1 P/N 19091Z-433). O gás de arraste foi o H 2 com fluxo de 1 ml/min. A temperatura inicial no injetor foi definida como 150 C, enquanto a temperatura do detector foi mantida como a do método de referência que é de 250 o C. A curva de aquecimento foi definida de 60 a 210 C com uma rampa de aquecimento de 15 C/min. Tabela 4. Composição do óleo essencial de melaleuca alternifolia (%) Amostras Picos Composto α-thujeno 1,17 1,42 1,16 1,12 1,18 1,4 1,18 1,41 2 α-pineno 2,81 3,35 2,77 2,7 2,82 3,32 2,81 3,3 3 β-pineno 0,86 1,03 0,87 0,85 0,82 1,03 0,87 1,02 4 mirceno 0,89 1,05 0,88 0,85 0,87 1,02 0,9 1,05 5 p -cimeno 4,02 3,9 3,46 3,72 3,43 4,21 3,48 3,84 6 α-terpineno 10,09 12,15 10,36 9,94 10,48 11,69 10,54 12,1 7 cineol 4,34 4,4 4,28 4,22 4,31 4,35 4,3 4,36 8 γ-terpineno 20,98 24,48 21,34 20,85 21,52 23,54 21,49 24,29 9 terpinoleno 3,58 4,17 3,63 3,61 3,72 4,03 3,64 4, terpineol 35,91 29,81 35, ,38 30,42 35,14 29,64 11 α-terpineol 3,96 2,66 3,89 3,95 3,85 2,71 3,81 2,65 12 β-gurgujeno 2,27 1,93 2,21 2,23 2,18 2,05 2,31 1,91 13 viridiflorol 2,43 2,29 2,4 2,38 2,34 2,3 2,33 2,32 14 cis -calameno 1,25 1,12 1,21 1,22 1,19 1,13 1,19 1,13 Fonte: Dados da pesquisa 70 JESUS, E. R.; ELLENSOHN, R. M.; BARIN, C. S. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas. Tecnol., Londrina, v. 6, p , nov. 2007

5 O solvente adotado para o método foi a acetona PA. Para o preparo da amostra foram pesados 100 mg de amostra do óleo de M. alternifolia em balão volumétrico de 25 ml e avolumado com acetona PA, injetando-se 1 ml de amostra. A razão de SPLIT foi 1:100. É fundamental que os parâmetros descritos no método estejam previamente ajustados antes da injeção da amostra. Os resultados são calculados pelo próprio software de aquisição de dados e estão expressos em porcentagem de área. Algumas das amostras foram submetidas à análise de CG-MS para confirmação da identidade dos seus componentes. 3 Resultados e Discussão Definidos os parâmetros de análise, foram analisadas oito amostras diferentes do óleo essencial de M. alternifolia (Tabela 4). Em todas as amostras analisadas, o percentual de 4-terpineol ficou acima dos 30% (exceto amostras 2 e 8 que estão dentro da margem de erro analítico 1%) enquanto o percentual de cineol ficou entre 4,22% e 4,36%. Observou-se também que quando há diminuição no teor de 4-terpineol, há um aumento nos teores de á-terpineno e g-terpineno, este resultado indica que os parâmetros do óleo essencial analisado estão de acordo com o padrão de qualidade da International Standart Organization (ISO, 1996), colocando o óleo produzido no Brasil entre os melhores do mundo. As alterações realizadas no método padrão permitiram a redução do tempo de análise de 70 para 10 minutos, o que representa economia de tempo e redução dos custos envolvidos. O perfil cromatográfico obtido com os novos parâmetros é idêntico àquele obtido pela metodologia padrão recomendada pela ISO e pode ser, portanto, o método de escolha para a análise do óleo de M. alternifolia ( Figura 3). Figura 3. Perfil cromatográfico obtido conforme Tabela 4. Fonte: Dados da pesquisa. 4 Conclusão A identificação e quantificação dos componentes do óleo essencial de M. alternifolia é de grande importância, sendo a cromatografia gasosa um dos métodos mais utilizados para este fim. Os resultados alcançados neste trabalho, além de comprovarem a qualidade do óleo de M. alternifolia produzidos no Brasil, contribuíram para uma significativa economia de tempo e de redução no custo de análise. Referências BARBOSA, L. C. A. et al. Constituintes químicos de Melaleuca alternifolia. Quím. Nova, São Paulo, v. 27, n. 4, p , jul./ago CARSON, C. F.; RILEY, T. V., Safety, efficacy and provenance of tea tree (Melaleuca alternifolia) oil. Contact Derm, v. 45, n. 2, p. 65-7, Aug INTERNATIONATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO). Essential oils: oil of Melaleuca, 4-terpineol type (tea tree oil). ISO Geneva, KOKETSU, M.; GONÇALVES, S.L. Óleos essenciais e sua extração por arraste de vapor. Rio de Janeiro: EMBRAPA-CTAA, LÁSZLÓ, F. Tea Tree Disponível em: <www. aromalandia.org/tea_tree.htm>. Acesso em: 13 maio OFICINA DAS ERVAS - Melaleuca Disponível em: < htm>. Acesso em: 19 fev SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRG, JESUS, E. R.; ELLENSOHN, R. M.; BARIN, C. S. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas. Tecnol., Londrina, v. 6, p , nov

6 Emerson Rolim de Jesus* Discente do curso de Química Industrial da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR). Ricardo M. Ellensohn Pós-Doutorado em Síntese Orgânica pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Docente do curso de Química Industrial da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR). Claudia Smanioto Barin Pós-Doutorado em Química da Universidade de São Paulo (USP). Docente do Curso de Química Industrial da Universidade Norte do Paraná (UNOPAR). * Endereço para correspondência: Rua Sampaio Vidal, 71 CEP Londrina, Paraná, Brasil. 72 JESUS, E. R.; ELLENSOHN, R. M.; BARIN, C. S. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas. Tecnol., Londrina, v. 6, p , nov. 2007