Declaração de Conflitos de Interesse. Consultora Científica da Sysmex América Latina

Transcrição

1 Declaração de Conflitos de Interesse Consultora Científica da Sysmex América Latina

2 Novos parâmetros em Hematologia 41º Congresso Brasileiro de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial Salvador, 4 de setembro de 2007

3 Introdução Roteiro Uma visão mais profunda do Hemograma Novos parâmetros do Hemograma Contagem automatizada de Granulócitos Imaturos - IG Contagem de Plaquetas Reticuladas - IPF Conteúdo de Hemoglobina dos Reticulócitos - RET-He Conclusão

4 Introdução

5 Uma visão mais profunda do Hemograma Exame mais solicitado nos laboratórios clínicos Características ambíguas Custo TAT (tempo total para realização do exame) Exame de rotina Essencial em serviços de alta complexidade Qualidade

6 Particularidades do Hemograma Grande quantidade de parâmetros Informações quantitativas e qualitativas Diferentes metodologias

7 Contagens Globais Contagem Diferencial de Leucócitos - % e # Dosagem de Hemoglobina Hemograma Microscopia Hematócrito Índices Hematimétricos tricos

8 O Hemograma é tratado como commodity Segundo o dicionário Houaiss: Commodity é qualquer bem em estado bruto, geralmente de origem agropecuária ou de extração (mineral ou vegetal) produzido em larga escala mundial e com características físicas homogêneas, seja qual for a sua origem Segundo a Wikipedia (2005): Commodity é um produto amplamente disponível, oferecido para comercialização, de características homogêneas e facilmente reconhecíveis pelos agentes comerciais. Segundo Prof. Enio Padilha: Commodities são, portanto, produtos sem diferenciação relevante. Coisas do tipo água mineral, leite em caixinha, tangerina-de-beirade-estrada...

9 Por que é tratado como commodity? Automação Alta produtividade Procedimentos padronizados Ferramenta para solução de problemas Permite melhoria dos processos

10 Para se diferenciar... Automação+Tecnologia Novos parâmetros Agregar valor ao Hemograma Fornecer mais informações aos clínicos Diagnóstico Monitoramento Diferencial competitivo

11 Novos parâmetros do Hemograma

12 Parâmetros conhecidos Série Vermelha Série Branca RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW- CV, RDW-SD RET%, RET#, IRF* WBC NEUT%, LYMPH%, MONO%, EO%, BASO%, NRBC% NEUT#, LYMPH#, MONO#, EO#, BASO#, NRBC# Plaquetas PLT-I, PLT-O, MPV, P-LCR, PDW, PCT

13 O que são novos parâmetros? Parâmetros adicionais ao Hemograma Aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration) Realizados por um analisador hematológico Sem reagente adicional Aplicação laboratorial ou clínica

14 Expansão para novos parâmetros Parâmetros: Contagem automatizada de Granulócitos Imaturos - IG Contagem de Plaquetas Reticuladas IPF Conteúdo de Hemoglobina dos Reticulócitos RET- He Plataforma tecnológica única Tecnologia de Citometria de Fluxo Fluorescente Softwares específicos

15 Citometria de fluxo fluorescente Corant ante Sistema Polim limeti óptico etima Neutrófilo Eosinófilo Basófilo Monócito Foto multiplicador Linfócito Laser semicondutor Λ = 633 nm Espelho dicróico Fluorescência Foto diodo Luz dispersa lateral Neutrófilo EosinófiloCelúla de fluxo Basófilo Monócito Linfócito 2 átomos de nitrogênio endocíclicos produzem sinais de luz "brilhantes" Amplificação da fluorescência da ligação com os ácidos nucléicos Excitação e emissão do comprimento do onda com o uso de laser semicondutor Baixo custo e mais confiável Foto diodo Luz dispersa frontal

16 Canal da contagem diferencial Citometria de fluxo fluorescente Fluorescência (conteúdo de RNA/DNA) Linfócitos atípicos Blastos Granulócitos imaturos Células normais Canal de DIFF Intensidade de fluorescência Muito alta Alta Baixa Lisante Stromatolyser 4-DL Corante fluorescente Stromatolyser 4-DS Luz dispersa lateral (estrutura interna celular)

17 Contagem diferencial de 5 partes Fluorescência (conteúdo de RNA/DNA) Luz dispersa frontal Volume celular Luz dispersa lateral Complexidade interna Luz dispersa lateral (estrutura interna celular)

18 Citometria de fluxo fluorescente Canal de Reticulócitos e Plaquetas Ópticas WBC RET Luz dispersa frontal Volume celular Fluorescência muito alta Fluorescência alta RBC Fluorescência Conteúdo de DNA/ RNA Fluorescência baixa

19 Contagem automatizada de granulócitos imaturos - IG % e #

20 Contagem automatizada de granulócitos imaturos Quantifica células imaturas da linhagem mielóide Metamielócitos Mielócitos Promielócitos Não inclui bastonetes

21 Que células são estas? Bastonetes ou segmentados? Neutrófilo segmentado semelhante a bastonete?

22 E esta? Metamielócito ou mielócito? É importante essa diferença?

23 Reprodutibilidade das contagens diferenciais

24 Células Sangüíneas: Realidade Modelo Ideal!

25 Como se obtém a contagem de granulócitos imaturos? Fluorescência (conteúdo de RNA/DNA) Luz dispersa lateral (estrutura interna celular)

26 Contagem diferencial de 6 partes

27 Contagem de granulócitos imaturos Laboratorio clínico central do hospital da Universidade de Kyoto

28 Aplicação laboratorial Impacto direto na rotina Diminuição de contagens manuais Aumento da quantidade de amostras liberadas automaticamente Diminuição da digitação de resultados LABORATORY BOTTLENECK Menor quantidade de erros Diminuição do tempo para liberação de resultados

29 Contagem de Granulócitos Imaturos Aplicaçã ção o clínica A presença de granulócitos imaturos no sangue é um indicador para o diagnóstico precoce de sepse Estudos evidenciam que o número de granulócitos imaturos é indicativo de sobrevivência de pacientes adultos com sepse e choque séptico Possibilidade de monitorar pacientes com sepse informando o progresso e a gravidade do processo Immature Myeloid Cell Deteccion (IMI, IG) as a Predictive Marker in Adult Sepsis - Axel Nierhaus

30 Referências bibliográficas Evaluation of the diagnostic performance of the Sysmex XT-2000i automated hematology analyser in the detection of immature granulocytes - CENCI A M(Ospedale S. Agostino, Modena, Ita), MACONI M(Azienda Ospedaliera Arcispedale Santa Maria Nuova,Reggio Emilia, Ita), CASOLARI B(Ospedale S. Agostino, Modena, Ita) Inmature granulocytes, inmature myeloid cells and outcome in adult severe sepsis and septic shock Evaluation of the Automated Immature Granulocyte Count (IG) on Sysmex XE-2100 Automated Haematology Analyser vs. Visual Microscopy (NCCLS H20-A) - Th WEILAND, H.K., ALKMAN and H H EIHN (Central Laboratory, Barmbek General Hospital, R-benkamp 148, D-22291, Hamburg, Germany, Institute for Laboratory Medicine, Medical Microbiology and Hospital Hygiene, LBK Hamburg, Stiegkamp 3, Hamburg, Germany and Sysmex Europe GmbH, Norderstedt, Germany Flow Cytometric Method for Enumeration and Classification of Reactive Immature Granulocyte Populations - FUJIMOTO H(Sysmex Corp., Kobe, Jpn) SAKATA T(Sysmex Corp., Kobe, Jpn) HAMAGUCHI Y(Sysmex Corp., Kobe, Jpn) SHIGA S(Kyoto Univ., Kyoto, Jpn) TOHYAMA K(Kyoto Univ., Kyoto, Jpn) ICHIYAMA S(Kyoto Univ., Kyoto, Jpn) WANG F-S(Loma Linda Univ. School Of Medicine, California) HOUWEN B(Loma Linda Univ. School Of Medicine, California)

31 Contagem de plaquetas reticuladas IPF % e #

32 Plaquetas Reticuladas Medula Óssea Sangue Periférico Plaquetas jovens, recentemente liberadas pela medula óssea, com conteúdo de RNA citoplasmático RNA Imaturas Megacariócito Maduras

33 Plaquetas reticuladas Análogas aos reticulócitos da série eritrocítica Ingraham e Coopersmith (1969): estudos em cães New Methilene Blue + microscopia óptica

34 Plaquetas reticuladas São mais densas e reativas que as plaquetas maduras * Contribuem na avaliação da supressão e consumo plaquetário ** Refletem a velocidade de trombopoiese O conteúdo de RNA nas plaquetas está correlacionado com a atividade megacariocítica Presentes em diferentes patologias * McCabe e col., 2004; Mohan e col., 2006 ** Saxon e col., 1998

35 Contagem de plaquetas reticuladas Diferenciar as causas de trombocitopenia Falha da medula óssea Plaquetas reticuladas(%) baixas Aumento da produção devido ao consumo ou destruição Plaquetas reticuladas(%) altas

36 Metodologia tradicional Citometria de Fluxo (CF) Com anticorpo monoclonal + fluorocromo Sangue colhido com citrato de sódio (3,2%) Plasma rico em plaquetas (PRP) Micro volume de PRP, lavado com tampão (ph=7,4) e fixado com paraformaldeído (1%) Anticorpos monoclonais: anti-cd41a: complexo GP IIb/IIIa anti-cd61: GP IIIa Marcador de RNA: thiazole orange (TO) Aquisição e edição de resultado: Citômetro de Fluxo CD41a+ ou CD61+ TO

37 Considerações sobre a metodologia tradicional Utiliza anticorpo monoclonal Necessita citômetro de fluxo Técnica padronizada Resultados precisos Alto custo Emissão de resultado > 1hora Necessidade de profissionais especializados Difícil implantação CD41a+ ou CD61+ TO

38 Parâmetro hematológico laboratorial para contagem de plaquetas reticuladas Fração de plaquetas imaturas - IPF Plaquetas reticuladas podem ser expressas como uma fração das plaquetas imaturas (IPF) Citometria de Fluxo Fluorescente Fluorocromo: Polimetina e Oxazina Sangue total colhido em anticoagulante EDTA Processado no analisador hematológico, sem preparação, reagente ou volume adicional Volume celular Canal de reticulócitos IPF Fluorescència

39 Fração de plaquetas imaturas - IPF Analisador hematológico Sysmex XE-2100 Laser de diodo semi-condutor Canal de reticulócitos e plaquetas ópticas - PLT-O Reagente com corante fluorescente Sistema de separação de populações

40 Determinação de IPF PLT-O Eritrócitos Reticulócitos Dispersão frontal: VOLUME PLTs maduras IPF Fluorescência : conteúdo de RNA

41 Exemplos de casos Normal ITP/PREG Platelet count 227 (x10 9 /L) Platelet count 74 (x10 9 /L) IPF 3.4% IPF 53.8% Platelets IPF Platelets IPF

42 Exemplos de casos Púrpura Trombocitopênica Idiopática (PTI) Anemia Aplástica (AA) Abe e col., 2006

43 Considerações sobre IPF Parâmetro incluído no hemograma Utiliza os mesmos reagentes do hemograma Emissão de resultado < 1 min. Baixo custo Trabalhos científicos de avaliação e padronização Briggs e col., 2006 Abe e col., 2006 Briggs e col., CF somente com fluorocromo

44 Validação do parâmetro IPF 50 adultos normais 22 pacientes com PTIA (púrpura trombocitopênica idiopática autoimune) 11 pacientes com PTT (púrpura trombocitopênica trombótica) 30 pacientes em quimioterapia 8 pacientes que realizaram transplantes autólogos 7 pacientes que realizaram transplantes alogênicos Briggs C et al 2004 British Journal of Hematology 126, 93-99

45 Resultados obtidos 0,2 0,1 0,4 0 4,8 0,8 3,46 Quimio 16,5 5,4 10, ,3 5,0 PTT (rem) 9,1 1,2 5, ,9 11,2 17,2 PTT 34,3 1,6 7, ,3 9,2 22,3 PTIA < 38,6 1,6 8, ,1 2,3 16,8 PTIA 16,4 3,1 8,6 6,1 1,1 3,4 Normal Máx. Mín. Média Máx. Mín. Média Grupo IPFx10/L % com IPF alto IPF% 50 x10 /L 9 9

46 Diferentes situações clínicas XE IPF % Normal ITP ITP <50 TTP at diagnosis TTP in remission Chemo

47 Comportamento do IPF na PTA Briggs e col., 2004

48 Púrpura Trombocitopênica Autoimune IPF % R = Plts x 10^9/L Correlação inversa entre IPF% e contagem de plaquetas

49 Aplicação Clínica - IPF ITP Plt x 10^9/L IPF % IPF PLT 0 Day 1 Day 7 Day 14 Day 21 Day 35 0

50 Aplicação Clínica - IPF Acute TTP Plt x 10^9/L IPF% PLT IPF 0 Day 1 Day 3 Day 4 Day 7 Day 12 Day 16 Day 21 Day 25 Day 30 Day 36 Day 39 Day 51 Day 54 Day 67 0 Enquanto o IPF% se mantiver elevado, não aumenta a contagem de plaquetas

51 Transplante autólogo de células progenitoras em Linfoma não Hodgkin NHL Auto PBSCT 2 units plts Plts x10^9/l IPF% PLT IPF Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 6 Day 7 Day 8 Day 9 Day 10 Day 13 Day 14 Day 15 Day 16 0 O aumento do IPF% antecede de 1 a 2 dias o aumento das plaquetas

52 Considerações finais IPF% é útil no diagnóstico das trombocitopenias IPF% aumentado destruição /consumo aumentado de plaquetas IPF% diminuído deficiência da medula óssea A Clinical Evaluation of High Fluorescent Platelet Fraction Percentage in Thrombocytopenia Thomas S. Kickler, MD, Sinichiro Oguni, and Michael J. Borowitz, MD, PhD

53 Considerações finais Fornece um método rápido, com alta sensibilidade e especificidade, para diagnóstico e monitoramento da resposta dos pacientes em tratamento de PTA e PTT O aumento do IPF% pode predizer o tempo da recuperação das plaquetas pós-trasplantes e quimioterapia Quimioterapia: 1-2 dias antes do aumento de plaquetas

54 Considerações finais Transplantes: Transplante autólogo de células progenitoras: 1 a 2 dias antes Transplante alogênico de células progenitoras: 1 a 2 dias Transplante alogênico de medula óssea: 2-7 dias antes Não é um bom indicador em caso de sepsis e para pacientes que já receberam transfusão de plaquetas O IPF pode ser utilizado na decisão da necessidade de transfusão de plaquetas Otimização deste processo Redução da quantidade de procedimentos

55 Artigos sobre aplicações das Plaquetas Reticuladas Aumento de Plaquetas Reticuladas - PR(%) - em pacientes submetidos à diálise (Himmelfarb e col., 1997) aumento da atividade trombopoiética: repetitivas ativações: interação entre PLT e membrana de diálise Aumento de Plaquetas Reticuladas - PR(%) - em pacientes com Insuficiência Renal Crônica tratados com rhuepo (Tàssie e col., 1998) melhora das funções das PLTs - agregabilidade: céls mais ativas Aumento de Plaquetas Reticuladas - PR(%) - nos acidentes vasculares cardioembólicos (Nakamura e col., 2002) aumento da atividade trombopoiética: constantes ativações das PLTs aumento do turnover plaquetário

56 Artigos das aplicações das Plaquetas Reticuladas Diminuição de Plaquetas Reticuladas - PR(%) em pacientes com LMA, AA e trombocitopenia induzida quimioterapia(watanabe e col, 1997) redução da trombopoiese Aumento de Plaquetas Reticuladas - PR(%) - trombocitemia essencial (Harrison e col., 1998) produção global e o turnover estão elevados na TE elevado nível de trombopoietina (TPO) Aumento de Plaquetas Reticuladas - PRs (%) - em pacientes com hipertiroidismo (Stiegler e col., 1998) aumento da produção de PLTs: redução do tempo de vida destas células devido a presença de anticorpos anti-plaquetas Aumento significativo das Plaquetas Reticuladas - PR(#) - na crise vaso oclusiva (CVO) nas Síndromes Falciformes (Noronha e col., 2007) elevada atividade trombopoiética - repetitivas interações de plaquetas, eritrócitos falcizados e endotélio vascular sugerem a participação das PRs na trombogênese da CVO

57 Conteúdo de Hemoglobina dos Reticulócitos RET- He (pg) Parâmetro utilizado para o diagnóstico precoce da deficiência funcional de ferro

58 Anemia Em condições normais a eritropoese faz um balanço entre formação e destruição de eritrócitos Normal Normal Formação (medula óssea) Destruição (baço) Desbalanceamento = Anemia Diminuída Normal Normal Aumentada ou Produção inadequada e destruição normal de eritrócitos Produção normal e grande destruição de eritrócitos

59 Primeiro trabalho que descreveu alterações da concentração de ferro em doenças Locke A: J Clin Invest 1932;11:527

60 Definição de anemia (Organização Mundial da Saúde-OMS) Redução da concentração de hemoglobina Homem < 13,0 g/dl (8.1 mmol/l) Mulher < 12,0 g/dl (7.5 mmol/l) Redução do hematócrito Homem < 40% (0.40 L/L) Mulher < 36% (0.36 L/L) Anemia é um sintoma tardio da deficiência de ferro!!!

61 Anemia por deficiência de ferro Principais causas: Diminuída Normal Produção inadequada e destruição normal de eritrócitos 1. Suprimento insuficiente Má nutrição, comportamento nutricional 2. Absorção deficiente Gastrite crônica, cirurgia do estômago, intolerância ao glúten, doença de Crohn, tetraciclinas, laxantes Aumento da solicitação de ferro Gravidez, bebês, crianças em fase de crescimento

62 Anemia por deficiência de ferro 5. Perda sangüínea Diminuída Normal Menstruação, procedimentos cirúrgicos, úlceras gastroduodenais, doadores de sangue, atletas 6. Deficiência funcional do ferro Produção inadequada e destruição normal de eritrócitos Estoques de ferro estão completos, mas o ferro não está disponível para ser usado na síntese de hemoglobina Eritropoiese deficiente em ferro (Cavill:Blood 1993;82:1377)

63 Anemia por deficiência funcional do ferro Anemia de doença crônica (ADC) Anemia em diferentes condições Inflamação crônica Tumores Doença renal em estágio avançado Causas principais Deficiência de eritropoetina Produção defeituosa ou supressão por citocinas Deficiência de ferro funcional 20% dos casos Reticulocyte hemoglobin equivalent (ret He) and assessment of iron-deficient states C. Brugnara, B. Schiller, J. Moran

64 Reticulócitos no sangue periférico Estágio 1 (0,1%) Estágio 2 (7%) Estágio 3 (32%) Estágio 4 (61%) Reticulócitos são precursores dos eritrócitos Fase de maturação de 3-5 dias na MO, quando são expelidos para a corrente sangüínea onde completam sua maturação após 1 dia. A presença de reticulócitos no sangue demonstra a atividade eritropoiética da medula óssea Reticulócitos com conteúdo de hemoglobina < 28 pg são chamados de reticulócitos hipocrômicos A presença de reticulócitos hipocrômicos no sangue demonstra a deficiência na síntese de hemoglobina na medula óssea A diminuição do conteúdo de hemoglobina nos reticulócitos está relacionada com a deficiência de ferro Boa correlação com a coloração de Azul da Prússia da medula óssea

65 Parâmetro hematológico de Conteúdo de Hemoglobina dos Reticulócitos Bayer - parâmetro CHr H*3 e Advia Metodologia óptica, após coloração com reagente fluorescente. Calculado pelo volume e concentração de hemoglobina de cada célula Sysmex - parâmetro RET-He XE-2100 Identificado após coloração com reagente fluorescente pela posição num dispersograma, de acordo com a fluorescência e a luz dispersa frontalmente RET-He e CHr são virtualmente idênticos Valor de referência: pg

66 RET- He Citometria de Fluxo Fluorescente Canal de reticulócitos RET Y RBC Y Dispersão frontal RBC LFR IRF Plaquetas fluorescentes Dispersão frontal Fluorescência Fluorescência RET-Y é a média da luz desviada frontalmente pelos reticulócitos RBC-Y é a média da luz desviada frontalmente pelos eritrócitos RET-He (pg) é calculado pela luz desviada frontalmente dos reticulócitos (RET-Y)

67 Caso clínico: Criança de 7 anos com anemia hipocrômica severa 3 dias após tratamento com r-huepo e administração de ferro i.v. apresentou aumento da concentração de reticulócitos e da hemoglobina dos reticulócitos. Contagem global de eritrócitos só aumentou 6 dias após início da terapia

68 Analitos utilizados na avaliação da situação do ferro na anemia de doença crônica Analito Ferro Transferrina Ferritina Zinco Protoporfirina - ZPP Receptor de transferrina - stfr stfr/log ferritina CRP Conteúdo de Hemoglobina do Reticulócito CHr e RET-He Eritrócitos hipocrômicos (%) Reticulócitos (%) Utilização clínica em ADC Não é importante na avaliação do status Fe Solicitação de ferro Nível de estoque de ferro Solicitação de ferro para eritropoiese Solicitação de ferro para eritropoiese Suprimento de ferro para eritropoiese Detecção de inflamação Deficiência funcional de ferro parâmetro em tempo real Deficiência funcional de ferro parâmetro calculado Resposta da medula óssea Não utilizado Utilização limitada Muito utilizado

69 Analitos utilizados na avaliação da situação de ferro na anemia de doença crônica Analito stfr/log ferritina CRP Conteúdo de Hemoglobina do Reticulócito RET-He, CHr Utilização clínica em ADC Suprimento de ferro para eritropoiese Detecção de inflamação Deficiência funcional de ferro parâmetro em tempo real Possibilita distinção entre deficiência de ferro e deficiência de ferro funcional

70 Thomas Plot Ferro disponível para eritropoiese Conteúdo de Hemoglobina dos Reticulócitos 1 Estoque ferro repleto, eritropoiese normal Anemia causada por deficiência de eritropoetina ou por redução da vida útil dos eritrócitos (80% com ADC ou IRC estágio final) Terapia: Eritropoetina 3 Deficiência funcional de ferro com estoque de ferro normal Diminuição da hemoglobinização dos eritrócitos (20% com ADC) Terapia: Eritropoetina + Ferro i.v 2 Deficiência de ferro latente Pacientes tem suprimento de ferro diminuído, mas ainda sem eritropoese deficiente em ferro Terapia: Ferro (oral) 4 Anemia por deficiência de ferro clássica Depleção do estoque de ferro e do ferro funcional Terapia: Ferro (oral) Índice stfr / log ferritina Depleção do estoque de Ferro

71 Conteúdo de Hemoglobina nos Reticulócitos Aplicação Clínica Quantidade real de ferro para a síntese de hemoglobina na medula óssea Detecção precoce do nível da deficiência de ferro, quando os marcadores bioquímicos podem sofrer interferência pelos quadros de infecção, inflamação ou gravidez Monitora a terapia com eritropoetina nos pacientes com anemia crônica

72 Referências na literatura Thomas C, Thomas L: Biochemical markers and hematologic indices in the diagnosis of funcional iron deficiency - Clin. Chem. 2002,48:1066 Franck S, Linssen J, Messinger M, Thomas L: Potential utility of RET-Y in the diagnosis of ironrestricted erythropoesis - Clin. Chem. 2004,50:1240 Hinzmann R: Iron metabolism, iron deficiency and anaemia from diagnosis to treatment and monitoring Sysmex Journ. Intern. 2003, 13:65

73 Conclusão

74 Conclusão Os novos parâmetros vieram agregar importantes informações ao Hemograma Campo de aplicação muito amplo Muitos estudos em desenvolvimento Utilização bem estabelecida na Europa e Estados Unidos Disseminação de informação para a comunidade médica brasileira

75 Muito obrigada!!! Muito obrigada!!! Maria Silvia C. Martinho