Bioquímicos e auxiliares de laboratório do setor de hematologia do LAC-HNSC, bem como equipe médica do Serviço de Hematologia do HNSC.

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1 POP: H-20 Página 1 de 6 1. Sinonímia: Reação de Perls. Mnemônico: PFE 2. Aplicabilidade: Bioquímicos e auxiliares de laboratório do setor de hematologia do LAC-HNSC, bem como equipe médica do Serviço de Hematologia do HNSC. 3. Aplicação clínica: Parâmetro considerado "padrão ouro" para o diagnóstico do estado de ferro "in vitro", uma vez que a ausência de ferro na medula é indiscutivelmente indicativo de depleção. O ferro medular desaparece antes das alterações do sangue periférico. Somente os indivíduos com ferro medular diminuído são passíveis de se beneficiarem da terapia. Diagnóstico de sobrecarga de ferro. O ferro está aumentado em: - hemocromatose idiopática; - hemocromatose secundária a captação aumentada, anemias com eritropoiese aumentada, lesão hepática, atransferrinemia; - anemias megaloblásticas em recuperação; - uremia (alguns pacientes); - Infecção crônica (alguns pacientes); - Insuficiência pancreática crônica. O ferro está diminuído em: - Anemia ferropriva (p. ex.: ingesta inadequada, sangramento crônico, malignidade, perda aguda de sangue); - Policitemia vera; - Anemia perniciosa na fase inicial da terapia; - Doenças do colágeno; - Infiltração da medula; - Infecção crônica - Doenças mieloproliferativas (consumo do estoque de ferro). 4. Princípio do teste: A coloração de Perls baseia-se na reação entre o ferrocianeto ácido e o íon férrico (Fe³) da hemossiderina ou material siderótico, com consequente formação de ferrocianeto férrico, que se cora de azul intenso (azul da prússia).

2 POP: H-20 Página 2 de 6 5. Amostra: 5.1 Preparo do paciente: A amostra é coletada e encaminhada ao laboratório pelo médico assistente. 5.2 Tipo de amostra: - Aspirado de medula óssea distendido em lâmina ou "imprint" de biópsia de medula óssea em lâmina. - Sangue periférico em tubo de hemograma (EDTA) para pesquisa de corpos de Pappenheimer (precipitado de ferro nos eritrócitos do sangue periférico) efetuar distensão da lâmina no laboratório. - Lâminas previamente coradas com corantes de Romanowsky podem ser descoradas em metanol por 12 horas. - Sedimento urinário fixado em lâmina. 5.3 Colheita: A colheita de medula óssea por punção em externo ou crista ilíaca posterior ou anterior pode ser realizada a qualquer hora pelo médico habilitado. Para amostras de sangue periférico, observar as precauções universais para punção venosa. A colheita pode ser realizada a qualquer hora, observando as recomendações do médico assistente.usar seringa ou tubo a vácuo contendo EDTA K3 (frascos de tampa roxa) com volume de aspiração preconizado (pediatria: 2,0ml; adultos: 3,0 a 4,5ml). Urina: observar as orientações para colheita do EQU. 5.4 Preservação e transporte: Transportar o material colhido à temperatura ambiente e dentro das normas de segurança legais. 5.5 Identificação da amostra: A amostra não é identificada com etiqueta com código de barras gerada pelo SIL do LAC. A amostra chega ao Laboratório de Hematologia acompanhada do requerimento Solicitação de Medulograma e/ou Avaliação de Sangue Periférico onde consta a solicitação da pesquisa de ferro pela Reação de Perls. 5.6 Armazenamento: À temperatura ambiente, dentro de envelopes de papel, indefinidamente desde que coradas. 6. Reagentes e materiais: Materiais: Vidraria; Pera; Banho-maria 56 C; Lâminas de vidro; Cuba ou recipiente plástico.

3 POP: H-20 Página 3 de Preparo: ÁCIDO CLORÍDRICO (HCl) 2% 2 ml de HCl concentrado 100 ml de água destilada FERROCIANETO DE POTÁSSIO 2% 2 g de ferrocianeto de potássio 100 ml de água destilada SAFRANINA O 1:1000 1g de safranina O 1000 ml de água destilada FUCSINA BÁSICA SOL. ESTOQUE 1% 1g de Fucsina Básica 10 ml de Etanol Absoluto 90 ml de Solução Aquosa de Fenol a 5 % ( 4,5g de Fenol em 90 ml de Água destilada) FUCSINA BÁSICA SOL. DILUÍDA 3 ml de Fucsina Básica Sol Estoque 1% 100 ml de Água Destilada. METANOL Comercial 6.2 Estabilidade: As soluções de uso são estáveis em condições normais de estocagem por aproximadamente 1 ano. O metanol é estável até a data de vencimento. 6.3 Armazenamento: Todos os reagentes devem ser conservados em geladeira entre 2 a 8 C. O metanol é armazenado a temperatura ambiente na embalagem original. 7. Equipamentos: Microscópio ótico Balança semi-analítica. 8. Calibração: 9. Procedimento (passo a passo): Preparação das amostras:

4 POP: H-20 Página 4 de 6 O médico encaminha ao laboratório de 3 a 6 lâminas já propriamente distendidas e secas ao ar, juntamente com a requisição Solicitação de Medulograma e/ou Avaliação de Sangue Periférico solicitando a coloração para pesquisa de ferro. Técnica de coloração: 1. Fixar o esfregaço em metanol comercial (em cuba própria) por 2 a 24 horas. 2. Preparar o reagente azul da prússia: 20 ml de HCl 2% + 20 ml de ferrocianeto de potássio. Homogeneizar. Aquecer a mistura (em recipiente próprio) em banho-maria 56 C por 2 minutos. Colocar a lâmina e deixar atuar por 15 minutos. 3. Lavar em água corrente por 20 minutos no próprio recipiente utilizado para corar. 4. Contracorar com Safranina O por 2 minutos ou Fucsina básica diluída por 5 minutos. Lavar em água corrente. Secar. 5. Observar ao microscópio. Avaliação microscópica da amostra: As lâminas coradas pela reação de Perls são avaliadas pela equipe médica do Serviço de Hematologia do HNSC. Após coloração das lâminas, o médico vem ao setor realizar a avaliação microscópica. 10. Controle de qualidade: 10.1 Interno: Utilizar sempre uma lâmina conhecida com ferro aumentado (controle +) Externo: 11. Resultados: A equipe médica do Serviço de Hematologia do HNSC é responsável pela liberação dos resultados. Critérios de graduação para depósito de ferro em aspirado de medula óssea: - Grau zero: Não se observam grânulos de ferro. - Positivo + : grânulos pequenos em células reticulares vistos apenas em lâminas com imersão. - Positivo ++ : alguns grânulos visíveis com lentes de baixo aumento. - Positivo +++: grânulos pequenos numerosos em todas as partículas medulares. - Positivo ++++: grânulos grandes em pequenos agregados. - Positivo : agregados grandes e densos de grânulos. - Positivo : depósitos muito grandes, obscurecendo o detalhe da medula óssea Unidades: O resultado é expresso em forma de cruzes (+) Cálculos:

5 POP: H-20 Página 5 de Critérios de aceitação: Resultados cujas amostras foram preparadas rigorosamente dentro das condições estabelecidas. 12. Valores de referência: Na medula óssea: Hemossiderina: Crianças e Mulheres: positivo + a positivo +++ Homens: positivo ++ a positivo +++. Sideroblastos: raros Sideroblastos em anel: ausentes No sangue periférico: ausência de Corpuscúlos de Pappenheimer. 13. Valores críticos: 14. Especificações de desempenho: 15. Fontes potenciais de Variabilidade: 16. Limitações do método: 17. Interpretação dos resultados: Sideroblastos (eritroblastos policromatófilos com grânulos citoplasmáticos de ferro não heme) encontram-se em número aumentado em anemias hemolíticas, anemias megaloblásticas, hemocromatose e hemossiderose. Sideroblastos em anel (grânulos de ferro são depositados na mitocôndria e frequentemente parecem estar arranjados em forma de colar em volta do núcleo por defeito da síntese do heme) diagnosticam anemias sideroblásticas (congênita, adquirida primária (por deficiência de vitamina B6), secundária (por intoxicação por chumbo) alcoolismo, artrite reumatóide).

6 POP: H-20 Página 6 de 6 A quantificação da Hemossiderina na medula óssea, livre e ou em fagócitos diagnostica a anemia ferropriva quando ausente ou em pequena quantidade. Indicativo de reservas de ferro altas quando em grande quantidade. Em grande quantidade nos fagócitos é também característica de anemia diseritropoéticas. 18. Biossegurança: Usar equipamento de proteção individual (luvas, óculos e máscara) para as colorações. Muita atenção ao manusear o metanol que é tóxico e inflamável. Fazer a descontaminação de bancadas e equipamentos conforme as normas de segurança do laboratório. Descartar resíduos de acordo com as Boas Práticas de Laboratório e com as normas federais, estaduais e locais. Vide POP L-15 - Manual de Biossegurança e POP L-50 - Gerenciamento de Resíduos. 19. Anexos: 20. Bibliografia: Williams J. Williams Hematologia 1.ed. Rio de Janeiro :Ed. Guanabara Koogan Bain, Bárbara J. Células sanguíneas: um guia prático 2 ed. Porto Alegre Artes Médicas, 1997 ISBN Wallach, Jacques. Interpretação de Exames Laboratoriais 7ª ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan, 2003 ISBN Wintrobe,s Clinical Hematology, 9Th edition, 1993.

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