AVALIAÇÃO PRELIMINAR DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA PARA DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS CONTRA Babesia bigemina
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- Joana Raminhos Dias
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1 AVALIAÇÃO PRELIMINAR DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO RÁPIDA PARA DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS CONTRA Babesia bigemina Cláudio Roberto Madruga z Raul Henrique Kessler 2 Clâudio Tadashi Miguita 3 Midori Miguíta 4 No Brasíl desde 1917, têm sido registradas altas taxas de letalidade nos bezerros doentes por hemoprotozoários do gênero Babesia e, atualmente babesiose ainda é considerada um dos príncipais problemas de saúde animal, não só pela mortalídade, mas também pelo retardamento do desenvolvimento dos bezerros e custo de tratamento. Nos estados do sul do País, em a que há áreas de instabílidade enzoótíca, são observados surtos importantes da do- ença. Apesar destas constatações, no País, pratícamente, não existem dados epidemiológicos ou estudos imunosorológícos, que são fundamentaís para a orientação de métodos preventivos efícientes. Durante as últímas décadas, houve grande avanço das técnicas de díag- nóstico sorológico com o desenvolvímento da imunofluorescencia indireta os testes ímunoenzimáticos. Entretanto, para a preparação e execução des- tas provas, há necessidade de equípamentos e técnicos especializados. Os testes de aglutinação rápida são os que apresentam maíor número de caracter{sticas que possíbilitam ampla utilização, pois são simples na exe- cução, econômicos e não requerem equípamentos e mão-de-obra e os resultados são obtidos rapidamente. No entanto, apresentam gem quanto ã sensibilidade que é inferior aos testes de combinação especialízada e desvanta- primá- imêd.-vet., M.Sc., Pesquisador da EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Corte, BR 262, km 4 - Caixa Postal Campo Grande, MS. 2Mêd.-Veto, Ph.D., Pesquisador da EMBRAPA-CNPGC. 3Laboratorista III - EMBRAPA-CNPGC. 4Téc.Lab.ll - EMBRAPA-CNPGC.
2 PA/37,CNPGC,Jul/87,p-2 PESQUISA EM ANDAMENTO ria, como são os antícorpos fluorescentes e ímunoenzimáticos. O teste do cartão para o diagnóstico de antícorpos contra Anaplasm a marginale elevou a sensibilidade quando se tornou uma reação de conglutinação com adíção do fator serico bovino, que é fonte de conglutinina e complemento. As reações falsas, negativas ocorriam, príncipalmente, com soros de animaís na fase aguda da ínfecção e soros estocados por longos períodos. No.píque de parasitemia de A. marginale a conglutinína diminui ou desaparece, porque transforma-se em imunoconglutina. Recentemente, foi constatado que os níveis de conglutinina e complemento C'3 decresciam nos bovinos com infecções agudas com Babesía bovis, e este fenômeno pode ocorrer na infecção por B. bigemína, pois os níveis de conglutínína baixam durante a fase aguda das infecções sistêmicas. Em vista das razões expostas, foi desenvoivido um teste de conglutina- Cão para o díagnóstíco sorológico de B. bigemina. A obtenção de B. bígemina para a produção de antígeno conseguiu-se com dois bezerros esplenectomizados. No primeiro inoculou-se 26mililitros por via subcutânea de um estabilizado com 7,38% de parasitemia. No oitavo dia pós-ínoculação (PI), a parasitemia (P) era 6, I% e hematócrito (H) 14%~ seguiu-se a inoculação de 100 ml de sangue no segundo anímal que apresentou P de 35,6% e H de 17%, no quarto dia PI. A preparação do antígeno foi da seguinte maneira: o sangue colhido com o antieoagulante citrato de sodio foi lavado três vezes com solução salina normal. Os eritrócitos sedimentados foram lavados com água destilada estéril na relação 1:5 e congelado a -80 C. O sangue parasítado foí descongelado e centrifugado a g por 30 minutos. O sedimento foi. ressuspendido com salina normal, homogeneizado e lavado até o sobrenadante tornar-se totalmente claro. O material antígênico diluído em um volume de 50 rol de salína foi sonícado com 50 watts de baíxa intensidade durante 30 segundos. Sendo após, centrifugado g por 30 minutos a 4 C. O sedí.- mento foí inicialmente lavado três vezes com salina normal e a seguir duas vezes com salina Contendo penicílina. O antígeno foi posteriormente ressuspenso com solução tampão fosfato, ph 7,2, na concentração de 5,5%. Fo-
3 PA/37,CNPGC,Jul/87,p.3 PESQUISA EM ANDAMENTO ram obtidas alíquotas de 2 ml deste antígeno e congelado a -80 C durante 24 horas. Após este período, foi descongelado, homogeneizado e sonicado a 20 watts de baixa íntensidade por 30 segundos. Apôs foí centrifugado g por 30 minutos a 4 C, e o sedimento ressuspendido com tampão fosfato na concentração de 5,5%. O corante "fast Green" foi adicionado na relação 1:20 de antígeno e deíxado sob agitação constante por 24 horas em câmara fria. Após este tempo foi centrifugado a g durante 30 minutos a 4 C, e em seguida foi ressuspenso com solução tampão fosfato ph 7,2 na mesma concentração anterior. A execüção do teste foi basicamente de acordo com o teste de cartão para o diagnóstico de anticorpos de A. marginale descrito por Amerault & Roby (1972), exceto o tempo para leitura que foi de 5 minutos, e o cartão que foi substituído por placa de vidro. A intensidade da reação foí classificada: +++ muito forte positívo; ++ forte positivo; + fraco positivo e negativo. O desempenho do antígeno e do teste foi avaliado da seguínte forma: a) com soros de seis anímaís inoculados experimentalmente com B. bígemína e comparados com a prova de imunofluorescência indireta; b) com soros de animais positivos a B. bígemína, B. bovís e com anímais negativos a ambas infecções; c) com soros de bovinos criados extensivamente em área endêmica a B. bígemina e comparados com IFI. O TAR detectou a presença de anticorpos contra B. bigemina, após o surgimento da parasítemia em cínco dos seís animais ínoculados experímentalmente, enquanto que a IFI evidenciou a presença de imunoglobulinas específícas a B. bigemina, em todos os bezerros no momento em que foi verificada a primeíra parasitemia apesar do bezerro n 6 apresentar soroconversão negativa logo após, a primeíra e unica parasitemía observada (Tabela I). Isto evidencia que a IFI tem uma maíor sensíbilidade que o TAR, embora este tenha também apresentado uma boa sensíbílidade, pois demonstrou a presença de anticorpos, logo após o aparecimento da primeira parasitemia (Tabela I). O TAR, como uma prova qualitativa, apresentou uma boa concordâncía de resultados com IFI, mesmo no período de infecção aguda.
4 PESQUISA EM ANDAMENTO PA/37, CNPGC, Jul/87,p. 4 TABELA I. Detecção de anticorpos contra B. bigemina pelos testes de aglutinação rápida (TAR) e imunofluorescência indíreta (IFI) em bezerros, esplenectomizados e ínoculados experimentalmente. Bezerros Días Parasítemía inoculados pôs inoculação (%) Resultado IF I sorológico TAR i 6 0,01 1 :80-7 0,01 1 : , ,40 1 : ,26 1 :40-9 0,00 1 " ,09 1 :40-6 0,00 1 : ,35 O ,80 1 : ,01 1 : ,00 0 m m
5 PESQUISA EM ANDAMENTO PA/37, CNPGC, Jul/87,p.5 A determínação mais tardia da presença de anticorpos pelo TAR pode ser justificada por tratar-se de soros de bezerros esplenectomizados que pro- porcionam um retardamento na produção das imunoglobulinas M., que são imunoglobulinas principais, detectadas pelos testes de aglutinação. as A sensibilidade calculada com os soros conhecidamente posítívos foi de 100% nas avaliações realízadas aos 2, 75 e 135 dias após a produção doantígeno e de 91% aos 30 dias quando um dos soros apresentou reação negativa (Tabela 2). Apenas um soro dos sete anímais desafiados com B. bovis apresentou uma reação posítiva incompleta nas duas primeiras avaliações, e todos soros provenientes de bezerros livres de infecção foram sorologicamente negatívos ao TAR. Considerando os soros dos animais destes doís últimos grupos, a especificidade foi 93% nas duas prímeíras avalíações e 100% nas últimas (Tabela 2). O exame do soro dos 30 bezerros com a idade média de 7 meses, criados na mícrorregião Pastoril de Campo Grande revelou 96,6% de anímaís com antícorpos contra B. bigemina, tanto no TAR como na IFI, portanto, com concordância de 100% entre as duas provas em relação a prevalência, embora o úníco anímal negativo de cada prova tenha sido diferente. Em base às análises realizadas, concluímos que os níveis de sensibilídade e especifícidade apresentados pelo TAR, qualífícam este teste como de grande efícíêncía para se realizar estudos epídemiológicos e avalíar a produção de anticorpos em bovinos vacinados ou pré-ímunizados com B. bígemína.
6 PESQUISA EM ANDAMENTO PA/37, CNPGC, Ju 1/87,p. 6 *Reação incompleta. Tiragem: 800 exemplares
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