FREQUÊNCIA DE Anaplasma marginale EM BOVINOS DA REGIÃO DE ARAGUAÍNA, ESTADO DO TOCANTINS, BRASIL

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1 Ciência Animal 21(2): , 2011 FREQUÊNCIA DE Anaplasma marginale EM BOVINOS DA REGIÃO DE ARAGUAÍNA, ESTADO DO TOCANTINS, BRASIL (Frequency of Anaplasma marginale in cattle in the region of Araguaína, Tocantins State, Brazil) Hébelys Ibiapina da TRINDADE 1 *; Katyane de Sousa ALMEIDA 2 ; Marlos Gonçalves SOUSA 2 ; Márcia Cristina Alves TEIXEIRA 3 ; Rosângela Zacarias MACHADO 3 ; Maria do Carmo de Souza BATISTA 4 ; Emmanuelle Karine Frota BATISTA 4 1.Programa de Pós-graduação em Ciência Animal Tropical, Universidade Federal do Tocantins; 2.Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal do Tocantins; 3.Laboratório de Imunoparasitologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual; 4.Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Piauí. RESUMO O presente trabalho teve como objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos anti-anaplasma marginale em bezerros da região de Araguaína, Tocantins. Foram coletadas 506 amostras de soros de animais com faixa etária compreendida entre oito e 24 meses, machos e fêmeas, as quais foram processadas por meio do ensaio imunoenzimático de adsorção indireto. O teste estatístico do Qui- Quadrado ( 2 ) foi utilizado como análise estatística. A prevalência obtida para bezerros foi de 89,9% para A. marginale, caracterizando a região de Araguaína como área de estabilidade enzoótica para referida espécie estudada. Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada em relação às diferentes faixas etárias. PALAVRAS-CHAVE: Anaplasma marginale, bezerros, ELISA indireto, estabilidade enzoótica. ABSTRACT This study aimed to determinate the seroprevalence of anti-a. marginale in calves in the region of Araguaína, Tocantins. Blood samples were collected from 506 calves, from 8 to 24 months-old, females and males, which were processed through the indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA-test). The statistical test Chi-square ( 2 ) was used as statistical analysis. The prevalence for calves was 89.9% for A. marginale, characterizing the region as Araguaína area of enzootic stability for the species studied. No statistically significant difference was observed for the different age groups. KEY WORDS: Anaplasma marginale, calves, indirect ELISA, enzootic stability. INTRODUÇÃO A anaplasmose bovina é responsável por causar perdas econômicas, principalmente, em países de clima tropical e subtropical, com alta morbidade e mortalidade em bovinos (Barros et al., 2005; Guedes Júnior et al., 2008), em especial os bezerros (Ribeiro & Reis, 1981), caracterizada por febre, anemia, perda de peso, diminuição na produção de leite, abortamento e icterícia (Oliveira et al., 2003; Ramos et al., 2007; Marana et al., 2009). *Endereço para correspondência: Pós-Graduação em Ciência Animal Tropical, Universidade Federal do Tocantins, Campus Araguaína, BR 153, Km 112, Zona Rural, CEP , Araguaína - TO, Brasil. hebelys@yahoo.com.br Ciência Animal 21(2): ,

2 É causada pela rickettsia intraeritrocítica Anaplasma marginale, transmitida biologicamente por carrapatos e, mecanicamente por díptero s hemató fago s e fômites contaminados por sangue (Souza et al., 2001; Araújo et al., 2003; Carelli et al., 2007). No Brasil, Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o responsável pela transmissão biológica da anaplasmose; entre os carrapatos a transmissão pode ocorrer tanto transest adial co mo intraestadialmente (Kessler, 2001; Pacheco et al., 2004). É importante conhecer a interação entre agente, ho spedeiro e ambiente, para caracterização das hemoparasitoses nas regiões fisiográficas, determinando as áreas endêmicas do país (Gonçalves, 2000). Existem vários métodos sorológicos para detecção de anticorpos ant i-a. marginale, sendo o ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) indireto o mais utilizado, devido à simplicidade do teste, alta sensibilidade e especificidade, além de permitir a análise de um número maior de amostras (Braz Júnior et al., 1997; Araújo et al., 1998; Madruga et al., 2000). A anaplasmose pode ser distribuída em áreas livres, as quais possuem condições climáticas não favoráveis à multiplicação dos vetores; em áreas de instabilidade enzoótica, onde as condições climáticas não são totalmente favoráveis ao desenvolvimento dos vetores, porém podem ocorrer em uma determinada época do ano, episódios de infestação temporária em população de risco; e áreas de estabilidade enzoótica o nde têm clima favorável ao desenvolvimento de vetores durante todo o ano (Vidotto & Marana, 2001). A região de Araguaína possui o segundo maior rebanho de bovinos no Estado do Tocantins (ADAPEC, 2008), sendo importante o desenvolvimento de pesquisas a respeito da prevalência de enfermidades que interferem na produtividade dos animais, assim o presente 120 Ciência Animal 21(2): , 2011 trabalho tem como objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos anti-a. marginale em bezerros desta região. MATERIAL E MÉTODOS Área de estudo O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa uma área de 4.000,40 km 2, situada na região norte do Estado do Tocantins, localizando-se entre a latitude 07º11 28" e longitude 48º12 26", com uma altitude média de 227 metros, clima tropical úmido (SEPLAN, 2009), sendo considerada como parte da Amazônia Oriental (Kampel et al., 2001). Amostragem dos soros O cálculo da amostra foi realizado através do programa Epi Info 6.04 considerando-se a população de bovinos na faixa etária de 0-24 meses de animais (ADAPEC, 2008), possibilidade de detecção da doença de 50% (correspondente a doenças de ocorrência desconhecida em determinada população), intervalo de confiança de 95% e o pior resultado esperado de 10%, resultando no N amostral de 384 animais. Esse valor foi acrescido de 10% para reduzir potenciais perdas, resultando assim, num total de 423 amostras. Ao final foram coletados, aleatoriamente, 506 soros de bovinos com 8-24 meses de idade entre machos e fêmeas, das raças Nelo re e Tabapuã, criados ext ensivamente. Foram sorteadas 20 propriedades de bovinos de corte cadastradas na Agência de Defesa Agropecuária do Tocantins (ADAPEC) de Araguaína, sendo coletado 1% dos animais aleatoriamente dessas propriedades. A coleta foi realizada nos meses de março a junho de 2009, onde foram coletados 10 ml de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígea, sendo estes centrifugados a 2000g por 10 minutos para separação dos soros e

3 aliquotados em tubos tipo Eppendorf de 2 ml, os quais foram armazenados a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico; durante as coletas foi verificado se havia presença de vetores e se era realizado o controle dos mesmos. Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto A metodologia para análise dos soros foi a técnica do ELISA indireto descrita por Machado et al. (1997) com algumas modificações. O soro obt ido foi analisado no Laborat ório de Imunoparasitologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária da UNESP (Jaboticabal- SP). Na microplaca de ELISA (Nunclon TM Surface, Nunc, Denmark) em cada poço foram adicionados 100 µl do antígeno so lúvel diluído em tampão carbonat o- bicarbonato de sódio 0,05M ph 9,6, estando a concentração protéica padronizada em 10 µg/ml - 1 (anti A. marginale). As placas foram incubadas overnight a uma temperatura de 4ºC, o excesso de antígeno foi removido por três lavagens com tampão fosfato 0,05% (PBS) de Tween 20. As placas foram bloqueadas com 200 µl de Tween 20 contendo 5% de leite em pó desnatado por 90 minutos a 37ºC, para reduzir a ligação nãoespecífica, sendo removido após a incubação com três lavagens consecutivas de PBS Tween 20. Cada amostra de soro (controle negativo, controle positivo, soro teste) foi diluída (1:100) em PBS Tween 20 com 5% de soro de coelho normal, adicionado em cada poço e incubadas por 90 minutos a 37ºC e lavadas como descrito acima. Foram adicionados em cada poço 100 μl de conjugado fosfatase alcalina anti-bovino IgG (Sigma Chemical Co.) diluído em 1: e, em seguida, incubadas por 90 minutos a 37 C, sendo lavadas posteriormente. Finalizando o processo foi adicionado 100 µl em cada poço, um substrato p-nitrofenilfosfato diluído em um tampão de dietanolamina ph 9,8. Esta placa foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. A leitura da reação foi realizada em um leitor de microplacas (Dynex Techno logy) a um comprimento de ondas de 405 ηm. Os valores de absorbância (ponto de corte) nos soros foram agrupados em níveis de ELISA (NE), os quais variam de zero a nove preconizado por Machado et al. (1997). A discriminação da absorbância (valor de corte) foi determinada como sendo duas vezes e meia a média do valor de absorção do grupo negativo, considerando as leituras acima do valor de corte positivas. Análise estatística Para análise estatística das variáveis estudadas foi utilizado o teste estatístico do Qui- Quadrado ( 2 ) utilizando o programa estatístico Graphpad Prism. 5 Windows (2009) com intervalo de confiança (IC) de 95%. RESULTADO Durante as coletas de sangue foi verificada alta infestação por carrapatos e presença maciça de insetos hematófagos nos animais das propriedades em estudo, apesar do uso de medicamentos a base de avermectinas para carrapatos e de piretróides como a cipermetrina usada como inseticida e acaricida. A pesquisa de anticorpos anti-a. marginale em bezerros procedentes da região de Araguaína revelou uma prevalência de 89,9%, com diferença significativa para o sexo (p<0,05) (Tab. 1). Não houve diferença significativa entre as faixas etárias analisadas (p>0,05) (Tab. 2). DISCUSSÃO A alta prevalência observada para A. marginale em bovinos da região de Araguaína foi também encontrada em outras pesquisas realizadas no Norte do país como a de Brito et al. (2007) em bovinos de Rondônia e Acre com Ciência Animal 21(2): ,

4 Tabela 1. Prevalência sorológica de anticorpos anti-anaplasma marginale em bezerros segundo Sexo o sexo na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Anaplasma marginale Positivo Negativo Total N % N % N % Macho a ,5 13 6, Fêmea b , , uma prevalência de 98,6% e 92,87%, respectivamente. Entretanto, no nordeste do Estado do Pará, Norte do Brasil, foi observada uma prevalência um pouco mais baixa para a referida enfermidade, 68,3% (Guedes Júnior et al., 2008). A alta prevalência de A. marginale observada nesse estudo corrobora os achados do levantamento formal no momento em que as coletas de sangue foram realizadas, ocasionando altas infestações. Ressalta-se que mesmo com a ut ilização de medicamentos à base de avermectinas e de piretróides como a cipermetrina, a infestação permaneceu alta. A presença maciça de carrapatos bem como de insetos hematófagos, associadas ao clima úmido da região, que favorece a multiplicação dos vetores principalmente na época chuvosa, pode ter contribuído para a alta prevalência. Gonçalves (2000) relata que a disseminação da anaplasmose no Brasil ocorre com maior intensidade nas épocas quentes e úmidas do ano, quando a população de vetores é maior. ² Valor de Classifica-se como área de estabilidade enzoótica quando uma frequência de anticorpos apresenta-se acima de 75%, áreas de instabilidade quando essa frequência é inferior a 75% (Mahoney & Roney, 1972; D Andrea et al., 2006). A prevalência de 89,9% para anticorpos anti-a. marginale encontrado na região de Araguaína classifica a região como área de estabilidade enzoótica. Classificadas t ambém co mo área de estabilidade enzoótica para A. marginale estão a mesorregião norte fluminense (RJ) com prevalência de 91,16% (Souza et al., 2000); a mesorregião do médio Paraíba com uma prevalência de 98,21% (Souza et al., 2001) e as microrregiões de Rondônia e Acre com uma prevalência de 98,6% e 92,87%, respectivamente (Brito et al., 2007), e a região do semi-árido da Bahia onde a prevalência de A. marginale foi de 98,9% (Barros et al., 2005). No Brasil, são consideradas as áreas de instabilidade enzoótica para A. marginale a região nordeste do Estado do Pará, com uma p 4,044 0,0443 Variáveis seguidas por mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste do Qui-quadrado ( ²) ao nível de 5% de probabilidade. Tabela 2. Prevalência sorológica de anticorpos anti-anaplasma marginale em bezerros segundo a faixa etária na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Faixa etária (meses) Anaplasma marginale Positivo Negativo Total N % N % N % ² Valor de p ns , , ns ,5 10 6, ns , , ns: não significativo pelo teste de Qui-quadrado ( ²) ao nível de 5% de probabilidade 122 Ciência Animal 21(2): , ,713 0,1562

5 prevalência de 68,3% (Guedes Júnior et al., 2008); Londrina, no Estado do Paraná, na qual a prevalência observada foi de 67,38% (Vidotto et al., 1997); e as regiões de Ponta Grossa, Guarapuava e Laranjeiras do Sul, região centrosul do Estado do Paraná, com uma prevalência de 58,74% (Marana et al., 2009). Algumas regiões demonstram diferenças na epidemiologia da infecção por A. marginale com áreas de estabilidade e instabilidade em uma mesma região ou localidade, ou ainda uma modificação da classificação ao longo dos anos, como foi o caso do estudo realizado por Vidotto et al. (1997) em Lo ndrina, Paraná o nde detect aram uma prevalência de 67,38% classificando a área como de instabilidade e, posteriormente, na pesquisa de Andrade et al. (2001) também em Londrina, onde detectaram uma prevalência 92,9% para A. marginale classificando a área como de estabilidade enzoótica. Na presente pesquisa, em relação ao sexo, houve diferença significativa, porém não se tem uma explicação para este fato devido os animais serem criados no mesmo pasto. Esse dado difere com os encontrados na literatura, que não evidenciou diferença significativa segundo o sexo (Souza et al., 2000; Souza et al., 2001). Em relação à faixa etária os resultados obtidos neste estudo são semelhantes aos encontrados por Souza et al. (2000) na mesorregião norte fluminense (RJ) e Souza et al. (2001) na mesorregião do médio Paraíba, pois não houve diferença significativa nas faixas etárias. Vale ressaltar que bezerros com dias, particularmente, 60 dias, é uma população com potencial risco de infecção e manifestações clínicas, mesmo com a imunidade humoral como um dos fatores de resistência à anaplasmose em animais jovens (Madruga et al., 1985) e que a infecção natural dos bezerros pelo A. marginale após o nascimento é mais dependente dos níveis de anticorpos colostrais absorvidos do que a intensidade da infestação pelo carrapato R. microplus (Pacheco et al., 2004). CONCLUSÃO A região de Araguaína demonstrou uma alta prevalência para anticorpos anti-a. marginale sendo, portanto, classificada como uma região de estabilidade enzoótica para A. marginale, oferecendo risco principalmente na introdução de animais suscetíveis, procedentes de áreas de instabilidade, para esta região. Assim, tornamse necessário o uso de medidas preventivas adequadas e melhores programas de controle de vetores, principais t ransmissores dessa enfermidade. AGRADECIMENTO À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, pela bolsa de estudo concedida. REFERÊNCIAS ADAPEC- Agência de Defesa Animal do Estado do Tocantins. Rebanho bovino vacinado contra febre aftosa, Novembro ANDRADE, G. M.; VIDOTTO, O.; VIDOTTO, M. C.; YOSHIHARA, E.; KANO, F. S.; AMARAL, C. H. S. Seroprevalence of Anaplasma marginale in dairy cattle and, studies on the dynamics of natural infection of Holstein calves in Southern Brazil. Semina: Ciênicas Agrárias, v.22, n.2, p , ARAÚJO, F. R.; MADRUGA, C. R.; LEAL C. R. B.; SCHENK, M. A. M.; KESSLER, R. H.; MARQUES, A. P. C.; LEMAIRE, D. C. Co mparison bet ween enzyme-linked immunosorbent assay, indirect fluorescent antibody and rapid conglutination tests in detecting antibodies against Babesia bovis. Ciência Animal 21(2): ,

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