UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS. Soroprevalência de tristeza parasitária em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Soroprevalência de tristeza parasitária em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil Hébelys Ibiapina da Trindade Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre, junto ao Programa de Pósgraduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins. Área de Concentração: Produção Animal ARAGUAÍNA 2010

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4 3 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Soroprevalência de tristeza parasitária em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil Hébelys Ibiapina da Trindade Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre, junto ao Programa de Pósgraduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins. Área de Concentração: Produção Animal Linha de pesquisa: Patologia Animal aplicada à Parasitologia Orientador(a): Prof a. Dra. Katyane de Sousa Almeida ARAGUAÍNA 2010

5 4 T833s Trindade, Hébelys Ibiapina da Soroprevalência de tristeza parasitária em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. / Hébelys Ibiapina da Trindade. -- Araguaina: [s.n.], f.: il. Orientador: Profª. Dra. Katyane de Sousa Almeida Dissertação (Mestrado em Ciência Animal Tropical) - Universidade Federal do Tocantins, Bezerros. 2. Anaplasma marginale. 3. Babesia bovis. 4. Babesia bigemina. I. Título CDD 636.3

6 5 SOROPREVALÊNCIA DE TRISTEZA PARASITÁRIA EM BEZERROS NA REGIÃO DE ARAGUAÍNA, ESTADO DO TOCANTINS, BRASIL HÉBELYS IBIAPINA DA TRINDADE Dissertação aprovada como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre, tendo sido julgado pela Banca Examinadora formada pelos professores: Presidente: Profª Dra. Katyane de Sousa Freitas UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Prof. Dr. Fagner Luiz da Costa Freitas UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Prof. Dr. Giovanny Rebouças Pinto UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ Araguaína, 24 de Fevereiro de 2010

7 6 À Deus, meu Pai e amigo nas minhas alegrias e tristezas, minha eterna gratidão!!!!! Aos meus pais Valdeni e Zeneide, e minha irmã Hylka pelo amor e apoio, sem vocês não teria conseguido!!!!! Aos meus amigos, Fagner e Katyane, pelas longas conversas e risadas!!!! A minha orientadora Profª Dra. Katyane pela dedicação e carinho demonstradas nos momentos mais difíceis. Aos meus amigos de longas datas e aos novos amigos do mestrado, vocês são muito importantes na minha vida!!!!!

8 7 AGRADECIMENTOS À Deus pela presença constante em minha vida. Meus Pais Valdeni e Zeneide, pelo exemplo de vida, amo vocês! Minha irmã Hylka, pelo carinho e cuidados sempre dedicados a mim, te amo! A Fátima, amiga para todas as horas, você é tudo de bom em minha vida. A minha avó Iracy, pelo apoio e carinho. Aos avôs Tico, Onezi e Dico (In memorian) que onde estiverem estão me iluminando nessa caminhada. A toda minha família pelo apoio e carinho dedicados a mim. A Profª. Dra. Katyane de Sousa Almeida pela amizade, cumplicidade e orientação, nesta etapa tão importante da minha vida. Gostaria de ratificar sua competência, sabedoria e empenho durante todo este trabalho. Ao Prof. Dr. Fagner Luiz da Costa Freitas pela amizade, cumplicidade e conselhos, obrigada por aceitar participar da minha banca. A Profª Dra. Rosângela Zacarias Machado pela oportunidade de realizar a segunda etapa deste trabalho, além de aceitar participar desse grande momento da minha vida. Ao Prof. Dr. Giovanny Rebouças Pinto por aceitar participar da formação da banca, obrigada pela disponibilidade. Ao Prof. Dr. Severino Vicente Silva pelos incentivos e apoio nessa nova jornada. A Profª Dra. Tânia Vasconcelos Cavalcante por tudo. Aos meus queridos amigos e irmãos da UFPI: Agrícola Neto, Elizângela e Maria Christina, pela força dada sempre na hora certa. Aos amigos de Codó, todos moram no meu coração. Aos amigos Lidiane, Gina Kathaline, Antonio Júnior e Bruna sem o apoio de vocês não teria chegado aqui. Aos novos amigos do mestrado da UFT, essa turma sempre será uma família: Ernestina, Joana Patrícia, Josemara, Thássia, Kedma Nayra, Carla, Obede, Iberê, Raylon, Wagner, Daiene, Suzana. E todos que direto e indiretamente participaram da minha vida aqui em Araguaína, sou uma pessoa muito feliz por Deus ter sempre enviado almas grandiosas, que se tornaram grandes amigos que sempre iram morar no meu coração. Muito obrigado!

9 8 Ao amigo Gleisom Ribeiro pela ajuda e disponibilidade, que foi fundamental para a realização deste trabalho. A secretária da Pós-graduação Eline de Sousa Costa sempre atenciosa e disposta a ajudar. A todos os funcionários da UFT, que direto ou indiretamente ajudaram nesse trabalho, em especial aos técnicos de laboratório: Paulo, Cristiane, Evanês, Carmem, Leyde, que sempre me ajudaram. A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal Tropical, pelos ensinamentos. Muito obrigada!!!

10 9 BIOGRAFIA DA AUTORA HÉBELYS IBIAPINA DA TRINDADE, filha de Zeneide Maria Ibiapina da Trindade e Valdeni Lins da Trindade, nascida em Teresina, Estado do Piauí, em 28 de agosto de Em 1996, concluiu o Ensino Médio, no Colégio Decisão, ingressando no ano de 1998 no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí UFPI, onde obteve o grau de Bacharel em Medicina Veterinária, em março de Realizou pós-graduação (latu-senso) em Saúde Pública na Universidade Federal do Piauí em No mesmo ano, foi professora substituta na área de Zootecnia, no Instituto Federal do Maranhão (IFMA) campus de Codó-MA. Em junho de 2008, iniciou o curso de Mestrado no Programa de Pós-graduação em Ciência Animal Tropical na área de concentração em Produção Animal na Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal do Tocantins-UFT, tornando-se bolsista CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) em dezembro de 2008.

11 10 O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis Fernando Pessoa

12 11 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CAPITULO I 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Tristeza Parasitária Bovina Babesiose bovina Histórico Agentes etiológicos Biologia parasitária Epidemiologia Imunologia Patogenia Sinais clínicos e achados de necropsia Anaplasmose bovina Histórico Agente etiológico Biologia parasitária Epidemiologia Patogenia Sinais clínicos e achados de necropsia Diagnóstico Tratamento Controle REFERÊNCIAS CAPITULO II Soroprevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil RESUMO ABSTRACT... 44

13 12 1 INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODO Área de estudo Amostragem dos soros Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto Análise estatística RESULTADO DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS CAPITULO III Soroprevalência de anaplasmose bovina na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODO Área de estudo Amostragem dos soros Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto Análise estatística RESULTADO DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 68

14 13 RESUMO Soroprevalência da tristeza parasitária bovina em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil A tristeza parasitária bovina pode ser causada pelos agentes Anaplasma marginale, Babesia bovis e Babesia bigemina, ocasionando perdas econômicas significativas no rebanho. Devido à importância da enfermidade e a escassez de dados sobre a epidemiologia da tristeza parasitária bovina na região de Araguaína-Tocantins a pesquisa teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos anti-a. marginale, anti-b. bovis e anti-b. bigemina na referida região. Foram coletadas 506 amostras de sangue de bezerros com faixa etária compreendida entre oito e 24 meses, fêmeas e machos, obtendo-se 10 ml de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo centrifugado para separação do soro e armazenado a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico. A determinação dos anticorpos anti-b. bovis, anti-b. bigemina e anti-a. marginale foi realizada por meio do ensaio imunoenzimático de adsorção indireto e como análise estatística utilizou-se o Qui-Quadrado (χ 2 ) com correção de Yates, para distribuição da prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico Graphpad Prism. 5 Windows (2009), com intervalo de confiança de 95%. A infecção por B. bovis (OR=1,703) e por B. bigemina (OR=0,5689) não foi verificado influência do sexo, porém para a infecção por A. marginale (OR=2,040) o sexo funcionou como um fator de proteção para as fêmeas. As soroprevalências obtidas foram de 89,9%, 90,5% e 91,7%, para A. marginale, B. bigemina e B. bovis, respectivamente, caracterizando a região como de estabilidade enzoótica para as três espécies analisadas, oferecendo risco diante da introdução de animais suscetíveis procedentes de áreas livres ou de instabilidade. Palavras-chave: Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis, bezerros.

15 14 ABSTRACT Seroprevalence of calves tristeza parasitária in the region of Araguaina, State of Tocantins, Brazil The tick-borne disease (known as Tristeza Parasitária in Brazil) can be caused by the folowing agents: Anaplasma marginale, Babesia bovis and Babesia bigemina, causing significant economic losses in the cattle. Due the diseases importance and the lack of data on the epidemiology of tick-borne disease in the region of Araguaina, Tocantins this research aimed at determining the prevalence of anti-a. marginale and anti-b. bovis and anti-b. bigemina antibodies in calves from this region. We collected 506 blood samples from calves, from 8 to 24 months-old, females and males, the 10 ml blood samples were aseptically collected by puncture of the coccygeal vein, and centrifuged to separate the serum, then stored at -20 C until the serological test. The determination of anti-b. bovis, anti-b. bigemina and anti-a. marginale was made using indirect Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. Statistical analysis between the variables was obtained through the statistical test Chi-square (χ 2 ) with Yates correction, for distribution of the prevalence of disease by age group was not applied this correction. To check if the sex was considered a risk factor or protection, we calculated odds ratio (OR). All statistical analyzes were performed using the statistical program Graphpad Prism. 5 - Windows (2009), with 95% a confidence interval. Infection with B. bovis (OR = 1.703) and B. bigemina (OR = ) was not observed influence of sex, but to infection by A. marginale (OR = 2.040) sex work as a protective factor for females. The seroprevalence obtained was 89.9%, 90.5% and 91.7% for A. marginale, B. bigemina and B. bovis, respectively, characterizing the region as enzootic stability for the three species and offering risk during the introduction of susceptible animals from free or unstable areas. Keywords: Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis, calves.

16 15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS celisa ielisa IFI FC PCR TC TCR Ensaio imunoenzimático de adsorção por competição Ensaio imunoenzimático de adsorção indireto Reação de imunofluorescência indireta Fixação de complemento Reação em cadeia de polimerase Teste do cartão Teste de conglutinação rápida

17 16 1 INTRODUÇÃO O Brasil destaca-se como um dos maiores produtores mundiais de bovinos, tanto para corte como para leite. Essa posição deve-se ao empenho do produtor que além de visar o lucro, está buscando a melhoria das condições de manejo e alimentação dos animais, para que seu produto seja bem aceito no mercado interno e, principalmente, no exterior. Com isso, houve uma grande demanda na procura pela carne brasileira, com os produtores buscando novas fronteiras para criação desses animais, como a região norte do país que tem se destacado no desenvolvimento da bovinocultura de corte e leite. O Tocantins, mesmo sendo um Estado brasileiro de formação recente (20 anos), tem se destacado pela produção de bovinos de corte. Em 2006, o rebanho bovino brasileiro foi estimado em cabeças, sendo que cabeças se encontravam na região norte do país, apresentando cabeças no Estado do Tocantins (ANUALPEC, 2006), demonstrando seu potencial para a exploração pecuária. O município de Araguaína, localizado ao norte do Estado, possui uma economia baseada na pecuária extensiva, destacando-se como segundo maior produtor de rebanho bovino desse Estado, sendo considerada a capital do boi verde da região norte do Tocantins com a população de bovinos em 2008, segundo a Agência de Defesa Sanitária do Estado do Tocantins ADAPEC (2008), estimada em cabeças. Para economia do país e rendimento do produtor, é necessário reduzir as perdas na criação de bovinos logo, qualquer enfermidade que comprometa a produção animal tem importância, dentre estas enfermidades está à tristeza parasitária bovina, causada por hemoparasitos das espécies Babesia bigemina, Babesia bovis e Anaplasma marginale. Esses hemoparasitos causam grandes prejuízos ao produtor, geralmente, por diminuir a produção de leite e/ou carne, atraso no crescimento de bezerros, gasto com medicamentos, vacinações e medidas preventivas, principalmente, quando se introduz animais de áreas livres em áreas endêmicas. Essa enfermidade tem distribuição mundial, principalmente, em regiões de clima tropical e subtropical, fator esse que favorece o aparecimento de vetores. A tristeza parasitária bovina se distribui em praticamente três áreas, sendo elas: (1) áreas livres da doença onde não ocorre a presença de vetores; (2) áreas de

18 17 instabilidade enzoótica, onde pode ocorrer à multiplicação dos vetores em uma determinada época do ano, pois se o clima for desfavorável, os vetores não se multiplicam, porém quando passado esse extremo, o clima fica favorável ao desenvolvimento dos vetores, assim podendo ocorrer à manifestação da doença; (3) áreas de estabilidade enzoótica onde o clima é totalmente favorável a multiplicação dos vetores, nessas áreas os animais desde o nascimento estão exposto aos vetores e nesse caso, possuem imunidade recebida pelo colostro da mãe, ocorrendo assim poucos casos de manifestação da doença em relação às demais áreas (VIDOTTO; MARANA, 2001). Animais de todas as idades são suscetíveis, tendo maiores consequências em bezerros, porém animais adultos que ainda não tiveram contato com os vetores, vindo de áreas livres ou de instabilidade, são mais afetados pelos patógenos. É importante o desenvolvimento de pesquisas a respeito da prevalência de enfermidades que acometem esses animais no Estado do Tocantins, pois existem poucos estudos acerca da prevalência da babesiose e anaplasmose bovina nesta região, sendo necessário um estudo epidemiológico para o estabelecimento de medidas racionais de controle e prevenção que resultem em diminuição das perdas econômicas ao produtor.

19 18 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1Tristeza Parasitária Bovina A tristeza parasitária bovina é um complexo de doenças que compreende duas enfermidades bem conhecidas: a babesiose, causada pelos protozoários Babesia bigemina e Babesia bovis, e a anaplasmose causada pela Anaplasma marginale (ALMEIDA et al., 2006; GUEDES JÚNIOR et al., 2008), responsáveis por grandes prejuízos econômicos como mortalidade no rebanho, queda na produção de leite, diminuição do ganho de peso, além de gastos com controle e profilaxia (GONÇALVES, 2000; GRISI et al., 2002; BARROS et al., 2005). A babesiose e a anaplasmose bovinas são hemoparasitoses transmitidas biologicamente pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (DALGLIESH; STEWART, 1983; GUEDES JÚNIOR et al., 2008), sendo que a anaplasmose pode ainda ser transmitida mecanicamente por dípteros hematófagos (GUGLIELMONE, 1995) e por fômites (SOUZA et al., 2000b). Nos bovinos, a manifestação clínica da tristeza parasitária, causada por Babesia spp. e A. marginale, está na dependência da presença do vetor, caracterizando a região para condições de instabilidade e/ou estabilidade enzoótica, do clima, do manejo dos animais, das condições fisiológicas do hospedeiro e da raça (SOUZA et al., 2000ab). Segundo Grisi et al. (2002), essa doença é responsável por problemas econômicos, observados no aumento do coeficiente de mortalidade, principalmente, em bezerros, bem como os efeitos negativos na produção animal, tendo como resultado o decréscimo na produção de leite e no ganho de peso. Ainda pode ocorrer um aumento considerável nos custos de produção, pela necessidade de aplicação de inseticidas e acaricidas, bem como pela diminuição das taxas de conversão alimentar e os índices de fertilidade (DUTRA, 2002).

20 Babesiose bovina Histórico Babes, em 1888, um pesquisador romeno, descobriu a presença de um microrganismo no interior de eritrócitos de bovinos doentes na Romênia, que se relacionava com a hemoglobinúria enzoótica bovina; acreditando se tratar de uma bactéria, ele denominou esse microrganismo de Haematococcus bovis. Em 1893, dois pesquisadores americanos, Smith e Kilborne, associaram uma enfermidade ocorrida nos Estados Unidos chamada de Febre do Texas a hemoglobinúria enzoótica bovina, classificando o agente causador como um protozoário o qual denominaram de Pyrosoma bigemina pelo seu formato em pêra, transmitido pelo carrapato Boophilus annulatus. Esta descoberta foi o primeiro relato da transmissão de um protozoário por um artrópode (BOCK et al., 2004). No mesmo ano, 1893, Starcovici comprovou a similaridade do microrganismo de Babes com os pesquisados por Smith e Kilborne, propondo a inclusão de ambos para um novo gênero denominado de Babesia, em homenagem ao pesquisador romeno. Assim, H. bovis passou a ser B. bovis e P. bigemina ficou sendo B. bigemina (UILENBERG, 2006) Agentes etiológicos A babesiose é uma enfermidade causada por um protozoário do filo Protozoa, subfilo Apicomplexa, da classe Sporozoasida, ordem Piroplasmida, gênero Babesia (GUGLIELMONE, 1995; SEQUEIRA; AMARANTE, 2001; BROWMAN, 2006). Existem oito espécies que podem infectar os bovinos em todo o mundo (UILENBERG, 2006), mas destas somente B. bigemina e B. bovis são encontradas no Brasil e demais países da América Latina (ARAÚJO et al., 1997; OKASI et al., 2002). No sangue circulante ocorre a fase de invasão eritrocítica com desenvolvimento por divisão binária simples desses protozoários. B. bigemina é um parasito polimórfico, possuindo formas pequenas, bordos irregulares e suas dimensões variam entre 3 a 5 µm, sendo as formas piriformes relacionadas com o ciclo sexuado, que se completa no organismo dos vetores, enquanto as amebóides

21 20 com o ciclo assexuado. As dimensões da B. bovis atingem no máximo 3 µm, apresentando-se na forma arredondada ou lanceolada aparecendo, frequentemente, aos pares (MASSARD; FREIRE,1985) Biologia parasitária A babesiose bovina é transmitida biologicamente por carrapato, principalmente, os que se encontram nas áreas entre os paralelos 32º Norte e 32º Sul (GONZALES, 2002; JULIANO et al., 2007), sendo o carrapato R. microplus o vetor mais encontrado nos países das Américas Central e Sul, África, Ásia, Austrália e Sul da Europa (GUGLIELMONE, 1995; LIMA et al., 1999; BOCK et al., 2004). Pode ocorrer também uma transmissão congênita na babesiose bovina (BRACARENSE; VIDOTTO; CRUZ, 2001). B. bovis é transmitida pelas larvas dos carrapatos, enquanto os estádios de ninfas e adultos transmitem B. bigemina. O ciclo sexual se desenvolve no intestino do carrapato, via hemolinfa, as formas sexuadas podem invadir outras células como ovários, tubos de malpighi, evoluindo para estágios uninucleados, sendo essas estruturas consideradas gametas. Após o ingurgitamento, 2-4 dias, os gametas, aos pares, se unem para formar um zigoto esférico; dando origem a um quineto móvel que irá se dividir assexuadamente nas células epiteliais do intestino, formando os esporoquinetos. Esses invadem as glândulas salivares, que passam por uma nova divisão assexuada, formando os esporozoítos (MARTINS, 2002). No momento do repasto sanguíneo o carrapato, através da saliva, injeta esporozoítos no hospedeiro vertebrado, via corrente sanguínea, atingindo as hemácias sem que haja o seu rompimento. Estes esporozoítos se transformam em trofozoítos (estádios após desenvolvimento inicial) que através de uma endocitose evoluem em merozoítos, apresentando aspecto piriforme no interior das hemácias. Os merozoítos se multiplicar através de uma divisão binária, resultando em dois (às vezes quatro) merozoítos, que rompem a célula parasitada e penetraram em outra hemácia íntegra para continuar sua multiplicação (MARTINS, 2002; BOCK et al., 2004; UILENBERG, 2006).

22 Epidemiologia A babesiose é uma doença de distribuição mundial, onde a presença do carrapato infectante é fundamental para sua disseminação, sendo mais importante nas regiões tropicais e subtropicais (CANTÚ-MARTÍNEZ et al., 2008) e responsabilizada por grandes perdas econômicas em vários países da África, Ásia, Austrália e Américas (BÖSE et al., 1995). Existem três situações epidemiológicas distintas: áreas consideradas livres da doença, onde a condição climática não é favorável ao aparecimento de carrapatos; área de instabilidade enzoótica, que em determinadas épocas do ano, devido às condições climáticas, impede o desenvolvimento da vida livre do carrapato; e as áreas de estabilidade enzoótica, sendo que nessas áreas as condições climáticas são favoráveis a presença dos carrapatos, bem como sua multiplicação (MAHONEY; ROSS, 1972; KESSLER et al., 1983; FOLLY et al., 2009). Em condições de clima tropical e subtropical, a babesiose assume características de estabilidade enzoótica, os bezerros são infectados durante os primeiros meses de vida, sendo protegidos por anticorpos maternos, através do colostro, desenvolvendo sua imunidade ativa sem sofrer a doença clínica (KESSLER et al., 1983; MADRUGA et al., 1984). Pode ocorrer uma situação de instabilidade enzoótica em determinado período do ano, tendo uma probabilidade de infecção baixa devido à presença do carrapato ser inconstante ou insuficiente para manter elevado o nível de imunidade dos animais (KESSLER et al., 1983; FOLLY et al., 2009). O Brasil é considerado como um país enzoótico devido a constante transmissão dos agentes, porém existem algumas regiões como sertão e sul brasileiro, em que as condições edafoclimáticas não favorecem o desenvolvimento do R. microplus (GONZALES, 1995; LIMA et al., 1999; SANTOS et al., 2001). No sul do País esta doença tem um significado maior, dado ao prejuízo econômico que ela causa por mortalidade e morbidade, em áreas de instabilidade enzoótica, devido a transmissão esporádica ou irregular (KESSLER et al.,1983). Mahoney e Ross (1972) relatam que uma área é considerada de instabilidade enzoótica quando a frequência de anticorpos se apresentam inferiores a 75%, quando superior a este valor a área é considerada de estabilidade enzoótica. Alguns estudos no Brasil revelaram áreas de instabilidade para região de Londrina

23 22 (PR) com uma prevalência de 69,30% para B. bigemina e 60,19% para B. bovis (VIDOTTO et al., 1997) e na mesorregião norte Fluminense (RJ) com prevalência de 69,74% para B. bigemina (SOUZA et al., 2000b). Soares et al. (2000) num estudo nessa mesma região, constataram uma prevalência de 90,98% para B. bovis, considerando essa área como de estabilidade enzoótica para este agente. Foram consideradas como áreas de estabilidade enzoótica: o município de Goiânia (GO) com prevalência de 98,90% de B. bovis e 94,40% de B. bigemina (SANTOS et al., 2001); Paudalho, zona da mata de Pernambuco com 76,59% para B. bovis e 97,61% para B. bigemina (BERTO et al., 2008); o nordeste do Estado do Pará, constatando uma prevalência de 99,20% para B. bovis e 98,80% para B. bigemina (GUEDES JÚNIOR et al., 2008); e o município de Campos dos Goyatacazes (RJ) com prevalência de 90,50% para B. bovis e 78,70% para B. bigemina (FOLLY et al., 2009) Imunologia Os protozoários são agentes infecciosos intracelulares que habitualmente infectam o hospedeiro por longo período de tempo, em virtude de possuir mecanismos que lhes permitem escapar das agressões mediadas pelo sistema imune (MACHADO et al., 2004). Vários componentes da resposta imune inata participam do mecanismo de defesa contra os protozoários (MACHADO et al., 2004), monócitos, macrófagos e neutrófilos ativados iniciam a imunidade do sistema celular. Durante a infecção inicial por protozoários, os monócitos do sangue periférico e neutrófilos são atraídos para o local da infecção antes do surgimento de anticorpos específicos com as funções de fagocitar os agentes e liberar radicais oxidativos (COURT; JACKSON; LEE, 2001). A resposta adaptativa contra os protozoários ocorre após a apresentação de antígenos por macrófagos e células dendríticas, via MHC classe II para as células T. Como outras células podem ser infectadas, e os macrófagos e células dendríticas também expressam moléculas de MHC classe I, nas infecções por protozoários há também ativação das células TCD8+ (MACHADO et al., 2004). B. bovis causa uma infecção aguda que resulta na persistência e imunidade contra a infecção, sendo essa dependente de macrófagos ativos, incluindo citocinas inflamatórias e óxido nítrico e seus derivados. O agente estimula

24 23 a síntese do óxido nítrico e a produção deste nos macrófagos ativos, manifestando um aumento nos níveis da citocinas inflamatórias nas interleucina-1 (IL-1), IL-12 e fator de necrose tumoral α (TNF-α), que são importantes para estimular a imunidade inata e adquirida contra estes patógenos. A IL-12 ativa a célula natural killer (NK) produzindo interferon-γ (IFN-γ), contribuindo assim no desenvolvimento da imunidade adquirida através da sua capacidade de promover a diferenciação de IFN-γ de células produtoras de linfócitos T-helper (Th) (SHODA et al., 2000) Patogenia A dinâmica da infecção varia com a integração entre o agente, o vetor e o hospedeiro (SILVA et al., 2007), a infecção por B. bovis tem um curso de três a sete dias para a doença aguda. A presença de citocinas e outros agentes farmacologicamente ativos têm uma função importante na resposta imune para Babesia spp. e o excesso de produção do agente infeccioso contribui para o progresso da doença causando vasodilatação, hipotensão, aumento da permeabilidade capilar, edema, colapso vascular, distúrbios de coagulação, lesão endotelial e estase circulatória (BOCK et al., 2004). A ação anemiante está relacionada à destruição hemolítica, com baixa nos valores eritrocitários bem como da hemoglobina, ou seja, causando uma hemoglobinemia que pode resultar em icterícia e hemoglobinúria. Essa lise de hemácias inicia quando os parasitos sofrem uma multiplicação assexuada, ocorrendo uma diminuição do número de hemácias circulantes (MASSARD; FREIRE, 1985). Nos casos agudos, as hemácias destruídas podem ser liberadas pela bile ou urina, essa hemoglobinúria é comum nos casos graves de babesiose, tendo uma duração média de 2-3 dias, com morte do animal antes do desaparecimento do sinal clínico. Nos casos crônicos, a fase hemolítica regenerativa é caracterizada por um aumento do número hemácias imatura na circulação sanguínea. A ação dos parasitos sobre os órgãos hematopoiéticos irá determinar uma hipocromia e uma leucopenia no período inicial, essa disfunção também é consequência da destruição eritrocítica, causando uma diminuição globular, trombose capilar e liberação de

25 24 hemoglobina, passando o animal de estado normal para um estado patológico grave (MASSARD; FREIRE, 1985). Enquanto B. bigemina parasita com mais frequência as hemácias da circulação periférica, B. bovis é encontrada em capilares de órgãos centrais como cérebro, cerebelo, meninges, e nas vísceras como rins, baço, fígado, coração e pulmão (MASSARD; FREIRE, 1985). B. bigemina é capaz de desencadear um mecanismo que provoca danos celulares e tissulares, envolvendo inicialmente uma hemólise intravascular, determinando anoxia e secundariamente lesões em vários órgãos, principalmente, rins e fígado (MENDONÇA et al., 2002). Ainda, animais infectados por este agente tendem a apresentar hemoglobinúria mais cedo e de forma mais consistente do que as infecções por B. bovis (BOCK et al., 2004) Sinais clínicos e achados de necropsia Durante a infecção aguda, esses patógenos podem causar febre (41 a 41,5ºC), anorexia, apatia, ataxia, palidez de mucosas, taquipneia, hemoglobinúria, icterícia, anemia, tremores musculares e ranger de dentes (SANTOS et al., 1998; SOARES et al., 2000; SINGH; MISHRA; RAO, 2009). Segundo Bock et al. (2004), a febre apresentada durante a alta parasitemia pode gerar abortamentos em vacas, bem como, uma redução na fertilidade dos touros, e em estágios mais avançados alguns animais podem apresentar problemas no sistema nervoso central, sendo fatal. Os sinais clínicos de infecções subagudas são mais difíceis de detectar. Um estudo retrospectivo no Rio Grande do Sul revela que B. bovis foi o agente mais importante envolvido em casos de babesiose, sendo responsável por 41% dos casos clínicos diagnosticados nessa região com os animais apresentando sinais clínicos característicos da doença (ALMEIDA et al., 2006). Na necropsia em animais infectados com B. bovis pode ser observado hepatomegalia, esplenomegalia, rins congestos e escuros, vesícula biliar distendida com conteúdo denso, escuro e grumoso; tecido conjuntivo e adiposo ictérico. Em alguns órgãos pode ser visualizada congestão ou petéquias, com possibilidade de edema pulmonar; a superfície da massa cinzenta do cérebro pode aparecer na coloração rosa Nos casos agudos se observa hemoglobinúria, podendo estar

26 25 ausente em casos subagudo ou crônico (KESSLER et al., 1983; BRACARENSE; VIDOTTO; CRUZ, 2001; BOCK et al., 2004; ALMEIDA et al., 2006) Anaplasmose bovina Histórico Sir Arnold Theiler, em 1910 na África do Sul, em uma pesquisa em lâminas sanguíneas provenientes de bovinos doentes descobriu alguns pontos marginais que seriam os responsáveis pela doença sendo similar a febre do Texas e denominou o agente como gênero Anaplasma, espécie Anaplasma marginale, classificando-o como um protozoário. Em 1893, quando Smith e Kilborne, descobriram sobre B. bigemina concluíram que os pontos marginais também faziam parte deste protozoário, porém Theiler determinou que a babesiose e a anaplasmose fossem doenças distintas que poderiam existir no mesmo animal, conseguindo separar os dois agentes através de infecções puras com A. marginale. Com as descobertas de Theiler sobre a anaplasmose em , ficou claro que alguns dos bovinos que Smith e Kilborne haviam trabalhado estavam infectados com Babesia e Anaplasma (KOCAN et al., 2010) Agente etiológico A anaplasmose bovina é uma doença causada pela rickettsia intraeritrocítica Anaplasma marginale Theiler, 1910 e A. centrale Theiler, 1911, que pertence a ordem Rickettsiales (SOUZA et al., 2001; VIDOTTO; MARANA, 2001; ARAÚJO et al., 2003); baseada em análises genéticas dos genes 16S rrna, groesl e genes que codificam proteínas de superfície, houve uma reclassificação em relação a família, que atualmente está incluída em duas: Anaplasmataceae e Rickettsiaceae (KOCAN et al., 2010). Entre as espécies, A. marginale (Família Anaplasmataceae) (MARANA et al., 2009) é a mais patogênica e de maior importância para os bovinos (VIDOTTO; MARANA, 2001). Todas as bactérias intracelulares obrigatórias são designadas à família Rickettsiaceae, que crescem livremente no citoplasma de células eucarióticas, já os

27 26 organismos da família Anaplasmataceae, são parasitos intracelulares obrigatórios, sendo encontrados exclusivamente na membrana, vinculado a vacúolos do citoplasma da célula hospedeira. Além disso, quase todos os organismos designados à família Anaplasmataceae se multiplicam em vertebrados e invertebrados (principalmente carrapatos) (KOCAN et al., 2010), são cocos pleomórficos, gram-negativos e transmitidas por vetores como carrapato; no citoplasma da célula do hospedeiro são observados pequenos cocos erliquiais, na coloração azul escuro ao roxo, com aspecto de amora, sendo denominado de mórula, com tamanho de 0,2-0,4µm (RIKIHISA, 2006) Biologia parasitária A transmissão de A. marginale pode ser mecanicamente por dípteros hematófagos e fômites contaminados ou, biologicamente, através do carrapato (ARAÚJO et al., 1998; CARELLI et al., 2007), sendo que no Brasil o principal transmissor é R. microplus (ARAÚJO et al., 1998), ocorrendo no carrapato a transmissão transestadial e transovariana (KESSLER, 2001; BROWMAN, 2006). Nos animais pode acontecer ainda transmissão congênita ou transplacentária (RIBEIRO et al., 1995; KESSLER, 2001). A transmissão mecânica pode ser através da picada do inseto, que realiza a transferência direta de sangue de bovinos portadores para susceptíveis, ocorrendo poucos minutos após a alimentação no bovino infectado (MARTINS, 2002), porém a transmissão por insetos hematófagos deve ser objeto de mais estudos, devido à escassez de infecções experimentais (KESSLER, 2001). Pode ainda ocorrer inoculação do agente por agulhas contaminadas com sangue infectado durante a vacinação ou pequenos procedimentos cirúrgicos, como castração, marcação por tatuagem, entre outros (MARTINS, 2002; KOCAN et al., 2010). Nos carrapatos, a transmissão pode ocorrer entre diferentes ínstares (larva ou ninfa se infecta e transmite ao estádio subsequente ninfa ou adulta) sendo denominada transestadial ou pode ocorrer via transovariana (infecção na forma adulta que após replicação no intestino da fêmea, transmitir para a próxima geração) (MARTINS, 2002; BROWMAN, 2006). Pode ainda ocorrer uma transmissão pelo carrapato macho, este se infecta em bovino portador e transmite, posteriormente, para outro bovino sensível (KESSLER, 2001).

28 27 Durante o repasto sanguíneo, o carrapato, através da saliva, injeta o agente patogênico no sangue circulante do animal. Nos bovinos A. marginale penetra na hemácia sob forma de corpúsculo inicial devido a uma invaginação da membrana dando origem a um vacúolo, depois dessa invasão, ocorre multiplicação por divisão binária, formando um corpúsculo de inclusão, que deixará a hemácia, sem rompimento da mesma, e invadirá outras células, propagando o ciclo (KOCAN et al., 2010) Epidemiologia A anaplasmose ocorre mundialmente em regiões de clima tropical, subtropical e temperado, é uma doença de grande importância econômica afetando principalmente a produção bovina de muitos países (SOUZA et al., 2001; MOURA et al., 2003; FELSHEIM et al., 2010; KOCAN et al., 2010). Sua distribuição nas Américas Central e Sul é semelhante às babesioses, porém no sul da Argentina ocorrem surtos esporádicos, mesmo em áreas livres de carrapatos (GUGLIELMONE, 1995). Algumas espécies de ruminantes selvagens infectadas, como veado e alces, são importantes na epidemiologia e propagação da anaplasmose, como hospedeiros de A. marginale, eles são considerados fonte de infecção, ocorrendo uma maior disseminação pela via mecânica através de insetos, e biológica pelo carrapato (KOCAN et al., 2010). No Brasil, mesmo os cervídeos sendo considerados reservatórios naturais de A. marginale, é considerado com pouca importância epidemiológica, pois os próprios bovinos servem de fonte de infecção de A. marginale entre eles (GONÇALVES, 2000). A distribuição da anaplasmose acontece em: (1) áreas livres, possuem condições climáticas não favoráveis à multiplicação dos vetores; (2) áreas de instabilidade enzoótica onde as condições edafoclimáticas não são totalmente favoráveis ao desenvolvimento dos vetores, porém pode acontecer que em uma determinada época do ano, ocorram episódios de infestação temporária em população de risco; (3) áreas de estabilidade enzoótica onde têm clima favorável ao desenvolvimento de vetores durante todo o ano (VIDOTTO; MARANA, 2001). As taxas de soroprevalência de A. marginale têm uma variação significativa entre os países das Américas, sendo que essa variabilidade contribui

29 28 para o desenvolvimento de regiões de instabilidade enzoótica (KOCAN et al., 2010). A anaplasmose bovina tem maior destaque em regiões de instabilidade enzoótica, devido à presença de um grande percentual de animais susceptíveis a infecção por A. marginale, pois a maioria dos bovinos não se infectam nos primeiros meses de vida, quando são mais susceptíveis a essa infecção (MADRUGA et al., 1985). Nas áreas de estabilidade enzoótica, os animais se infectam com A. marginale nos primeiros dias de vida, onde a presença dos vetores é persistente durante todo o ano, entretanto, apresentam uma maior resistência devido à absorção de anticorpos maternos, através do colostro (VIDOTTO; MARANA, 2001). Porém o percentual de animais doentes, bem como a taxa de mortalidade, pode depender de algumas condições epidemiológicas, tais como: número de vetores no ambiente, estado nutricional e doenças concomitantes (GONÇALVES, 2000). Num estudo feito no nordeste do Estado do Pará, foi constatada uma prevalência de 68,30% para A. marginale, considerando essa região como de instabilidade enzoótica (GUEDES JÚNIOR et al., 2008). Outra região que também foi considerada como de instabilidade, foi a região centro-sul do Estado do Paraná, que num estudo para detectar A. marginale apresentou uma prevalência de 58,74% (MARANA et al., 2009). No Brasil, pode ser considerada área de estabilidade o Sul com prevalência de 92,9% em rebanho de bovinos leiteiros (ANDRADE et al., 2001); a mesorregião do médio Paraíba sendo constatada uma prevalência de 98,21% (SOUZA et al., 2001) e a mesorregião Norte Fluminense (RJ) com prevalência de 91,16% (SOUZA et al., 2000a) Patogenia A. marginale é uma rickettsia intraeritrocítica que infecta de 10 a 90% das hemácias dos bovinos (KIESER; ERIKS; PALMER, 1990). A incubação ou período pré-patente pode variar de 7 a 60 dias, com uma média de 28 dias. Após a infecção eritrocítica é detectado um aumento no número de hemácias parasitadas (KOCAN et al., 2010), podendo chegar a 109 hemácias infectados por mililitro de sangue (SCOLES et al., 2005), essas hemácias são posteriormente fagocitadas por células do sistema reticuloendotelial, resultando em desenvolvimento de anemia e icterícia, sem que apresente hemoglobinemia ou hemoglobinúria (KOCAN et al., 2010).

30 Sinais clínicos e achados de necropsia A anaplasmose bovina, muitas vezes, resulta em desenvolvimento de anemia leve a grave e icterícia. Os bovinos que sobrevivem à infecção aguda tendem a desenvolver infecções persistentes caracterizadas por baixo nível de parasitemia (KOCAN et al., 2010). Os sinais clínicos observados nos animais doentes são anemia hemolítica, icterícia, dispnéia, taquicardia, febre, fadiga, lacrimejamento, sialorreia, diarreia, micção frequente e anorexia, levando a morte do animal (VIDOTTO; MARANA, 2001; ARAÚJO et al., 2003). Durante a realização da necropsia as lesões macroscópicas mais observadas são: sangue deficientemente coagulado, mucosas e serosas anêmicas ou ictéricas, hepatoesplenomegalia, rins aumentados e escuros, vesícula biliar com conteúdo denso e grumoso, e congestão cerebral (VIDOTTO; MARANA, 2001) Diagnóstico O diagnóstico das babesioses e anaplasmose bovina pode ser realizado com base nos sinais clínicos e na visualização dos parasitos no interior das hemácias em esfregaços sanguíneos delgados corados pelo Giemsa (LIMA et al., 1999; VIDOTTO; MARANA, 2001; OKASI et al., 2002; CARELLI et al., 2007). Para uma melhor realização do exame, deve-se preparar a lâmina a partir de sangue coletado dos capilares periféricos, como da região marginal da orelha ou ponta da cauda no caso de B. bovis, pois a circulação sanguínea geral possui 20 vezes menos desse parasito do que no sangue periférico (BOCK et al., 2004); para B. bigemina pode-se utilizar até mesmo, sangue coagulado por haver uma quantidade maior desse protozoário no sangue circulante (VIDOTTO; MARANA, 2001; BOCK et al., 2004). Entretanto quando a parasitemia se apresenta muito baixa, como é o caso das infecções subagudas, é difícil a demonstração do agente (MARTINS; CORRÊA; CERESÉR, 1996; VIDOTTO; MARANA, 2001). Assim, várias técnicas sorológicas, com variação de graus de sensibilidade e especificidade, foram desenvolvidas para detecção de anticorpos para B. bovis, B. bigemina e A. marginale (MARANA et al.,

31 ; JULIANO et al., 2007). As provas sorológicas são importantes nos estudos epidemiológicos de uma determinada região (SOUZA et al., 2000ab; BOCK et al., 2004) e são utilizados na avaliação de medidas profiláticas como premunição, vacinação e controle de carrapatos (OSAKI et al., 2002; BOCK et al., 2004). Vários são os testes sorológicos utilizados para a detecção da babesiose e anaplasmose bovina, dentre elas pode-se destacar o teste da conglutinação rápida (TCR), a aglutinação pelo látex, a hemaglutinação, fixação de complemento (FC) (MARANA et al., 2006), o teste do cartão (TC), a prova de imunofluorescência indireta (IFI) (SOUZA et al., 2001; MARANA et al., 2009), o ensaio imunoenzimático de adsorção indireto (ielisa); ELISA por competição (celisa) (MARANA et al., 2009), além de técnicas moleculares como a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) (OKASI et al., 2002; BOCK et al., 2004; CARELLI et al., 2007) O teste de FC é baseada em reações de anticorpos IgM, que são produzidos principalmente no início da infecção primária, porém devido a sua baixa sensibilidade, o teste foi abandonado para o diagnóstico da babesiose bovina. A IFI é amplamente utilizada para diagnosticar Babesia spp., porém a desvantagem do teste é sua limitação pelo número de amostras realizadas por dia (BÖSE et al., 1995). O teste de ELISA é considerado um avanço em termos de sensibilidade, especificidade, padronização e reprodutibilidade para a detecção de anticorpos específicos na babesiose bovina (MACHADO et al., 1997), além de ser o método mais apropriado para se trabalhar com grande número de amostras devido a utilização de um leitor específico (ARAÚJO et al., 1998). Marana et al. (2006) num estudo comparativo entre ielisa e celisa para anaplasmose bovina, relatam que estes testes são mais adequados aos estudos epidemiológicos em áreas de instabilidade enzoótica, onde se encontra uma prevalência variável, devido a sensibilidade e especificidade dessas provas. Esse mesmo estudo comparou a IFI e o TCR que, por serem testes mais simples e rápidos, são mais utilizados em levantamentos epidemiológicos, porém não apresentaram tanta especificidade quanto os anteriores. Avanços recentes no campo da biologia molecular tornaram possível o uso de técnicas de amplificação do ácido dexoribonucléico (DNA) dos agentes causais das patologias parasitárias e infecciosas que acometem os animais. Esses testes baseados na PCR são feitos de maneira relativamente rápida e apresentam alta sensibilidade e especificidade tornando possível a verificação da presença de

32 31 agentes patogênicos, mesmo em animais assintomáticos. A PCR tem sido muito utilizada em estudos epidemiológicos das hemoparasitoses bovinas, pois há uma identificação direta desses parasitos por essa técnica (BRITO et al., 2006) Tratamento O tratamento da babesiose consiste em destruir os protozoários no paciente com aplicação de medicamentos a base de aceturato de diminazeno, dipropionato de imidocarb, diisetionato de amicarbalina, fenamidina, sendo que o mais utilizado é o dipropionato de imidocarb por apresentar efeito prolongado devido a sua lenta metabolização, porém suas ações colaterais como diarreia, cólica e salivação são mais severas também (MELO; CARVALHO NETA, 2009). Segundo Bock et al. (2004), o aceturato de diminazeno pode ser usado contra B. bovis e B. bigemina na dose de 3,5 mg/kg intramuscular, protegendo o animal por duas a quatro semanas; o dipropionato de imidocarb é usado por via subcutânea na dose de 1-2 mg/kg para o tratamento, se utilizado na dose de 3mg/kg promoverá uma proteção contra B. bovis por quatro semanas e para B. bigemina pelo menos uns dois meses. Para a anaplasmose, o tratamento é baseado na utilização de antibióticos como a tetraciclina ou oxitetraciclina, na dose de 2-4 mg/kg pela via intramuscular com 2-4 aplicações em intervalos de 21 em 21 dias (GONÇALVES, 2000). Mesmo os animais sendo tratados, podem se tornarem portadores crônicos da doença e, se curados, continuam suscetíveis à reinfecção (FELSHEIM et al., 2010). Às vezes a babesiose pode estar associada com a anaplasmose, assim é comum no tratamento a utilização de aceturato de diminazeno e oxitetraciclina nos animais que apresentam os sinais clínicos e quando não se podem aplicar testes sorológicos na região (ASSIS et al., 2005) Controle Os métodos de profilaxia empregados para as hemoparasitoses são: controle de vetores, quimioprofilaxia, premunição e uso de vacinas. O controle de carrapato pode ser implementado através de um controle estratégico bem como sua erradicação (GONÇALVES, 2000). As estratégias para o combate aos carrapatos

33 32 visam o uso de carrapaticidas, através dos banhos de imersão levando-se sempre em consideração a dose e concentração correta; fazendo-se o rodízio do princípio ativo quando necessário a fim de que seja evitada a resistência por parte dos carrapatos (MELO; CARVALHO NETA, 2009). No caso da anaplasmose além do carrapato, também deve ser feito um controle de moscas na propriedade principalmente nas estações chuvosas, quando a população de dípteros hematófagos é maior (GONÇALVES, 2000). A premunição é outro método para controle da babesiose e anaplasmose, consiste na exposição do animal ao agente, seguidos de correto tratamento para que sejam ativadas as células de defesa (MELO; CARVALHO NETA, 2009). Segundo Gonçalves (2000) premunição é um processo baseado na inoculação do sangue do animal portador em animais susceptíveis, utilizando tratamento à base de drogas específicas. É uma medida que determina proteção à infecção, mesmo ocorrendo variações entre as amostras das espécies dos agentes. Porém esse método apresenta alto custo, como riscos na disseminação da doença, principalmente em bezerros. Outras limitações são apontadas por Kessler et al. (2002), sendo a principal o risco de disseminação de outras doenças transmissíveis pelo sangue, como a leucose bovina, a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), a diarreia viral bovina (BVD), a tuberculose e a leptospirose que se tornaram endêmicas, principalmente, nos rebanhos leiteiros. A vacinação pode ser feita através da vacina atenuada na sua forma tríplice (A. marginale, B. bovis e B. bigemina), entretanto, pode provocar uma manifestação clínica da enfermidade, sendo necessário em alguns casos, o tratamento para evitar as perdas (DIAS, 2001). A vacinação com cepas atenuadas deve ser utilizada de maneira controlada em bovinos susceptíveis, principalmente, os adultos quando estes terão um primeiro contato com os vetores (GONÇALVES, 2000). A desvantagem dessa vacina está no fato da infecção com esses agentes patogênicos nos bovinos, porém mesmo com o risco de infecção as vacinas vivas mostraram eficiência de proteção em 95% dos animais vacinados (BOCK et al., 2004). Para a produção da vacina viva para anaplasmose, bezerros esplenectomizados são mantidos em condições de quarentena, são experimentalmente inoculados com agentes selecionadas e servem como doadores de sangue infectado, porém, a transmissão de outros hemoparasitos realizados

34 33 silenciosamente pelo bovino doador é sempre um risco com esta abordagem (KOCAN et al., 2010). No Brasil utilizam-se dois tipos de vacinas atenuadas contra a babesiose e anaplasmose bovina. Uma refrigerada, à semelhança do que se faz na Austrália e no Uruguai, e outra congelada em nitrogênio líquido, ambas as vacinas são tríplices (B. bovis, B. bigemina e A. centrale). A primeira, apesar de aparentemente mais prática e econômica, pode ser distribuída pronta para o uso, apresentando como inconveniente ser aplicada até cinco dias após sua produção, o que impossibilita o teste prévio da partida, com isto, apesar de ser produzida em condições controladas, existe o risco de, acidentalmente, o produto conter os agentes virulentos ou outros contaminantes. Os resultados só serão verificados após a aplicação nos animais a serem imunizados (KESSLER et al., 2002). A vacina congelada possui a vantagem de permanecer inalterada por tempo indeterminado, permitindo o teste prévio de cada partida, cumprindo com as exigências da Divisão de Produtos Veterinários (DIPROD) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) evitando, assim, surpresas desagradáveis após sua aplicação. Além disso, por ser mantida em botijões de nitrogênio líquido, pode ser transportada para qualquer lugar, mesmo desprovido de energia elétrica, e ser utilizada no momento mais apropriado. Pode ser aplicada, simultaneamente, em grande número de animais, sem a necessidade de acompanhamento intensivo, o que torna o processo mais econômico e seguro que os demais métodos de imunização disponíveis (KESSLER et al., 2002). No mercado brasileiro, existem registradas e comercialmente disponíveis, as vacinas congeladas EMBRAVAC, contra a tristeza parasitária bovina, desenvolvidas pela Embrapa Gado de Corte. Os animais vacinados devem ser mantidos livres de carrapatos, sob observação durante 60 dias, no estábulo ou no campo. Exames laboratoriais só serão necessários, eventualmente, no caso de algum animal apresentar sinais clínicos (KESSLER et al., 2002).

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43 42 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Soroprevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil Hébelys Ibiapina da Trindade ARAGUAÍNA 2010

44 43 RESUMO Soroprevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina em bezerros na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil A babesiose bovina é causada pelos agentes Babesia bovis e Babesia bigemina, sendo transmitida pelo vetor biológico Rhipicephalus (Boophilus) microplus, causando principalmente hemoglobinúria nos animais. Devido à importância da enfermidade, a pesquisa objetivou determinar a soroprevalência de anticorpos anti- B. bovis e anti-b. bigemina em bezerros da região de Araguaína-Tocantins. Foram coletadas 506 amostras de soros de bezerros com faixa etária compreendida de oito e 24 meses, fêmeas e machos, obtendo-se 10 ml de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo centrifugado para separação do soro e armazenado a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico. A determinação dos anticorpos anti-b. bovis e anti-b. bigemina foi realizada por meio do ensaio imunoenzimático de adsorção indireto e como análise estatística utilizouse o Qui-Quadrado (χ 2 ) com correção de Yates, para distribuição da prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico Graphpad Prism. 5 Windows (2009), com intervalo de confiança (IC) de 95%. A infecção para B. bovis (OR=1,703) e para B. bigemina (OR=0,5689) não foi verificada a influência do sexo. As prevalências obtidas em bezerros foram de 90,5% e 91,7% para B. bigemina e B. bovis, respectivamente. A soroprevalência encontrada caracteriza esta região como de estabilidade enzoótica para as espécies analisadas, oferecendo risco quando introduzidos animais suscetíveis, procedentes de áreas livres ou de instabilidade, para região de Araguaína, sendo necessário o uso de medidas preventivas adequadas a essas ocasiões. Palavras-chave: Babesiose bovina, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, estabilidade enzoótica, B. bovis, B. bigemina

45 44 ABSTRACT Seroprevalence of Babesia bovis and Babesia bigemina in calves from the region of Araguaina, State of Tocantins, Brazil Bovine babesiosis is caused by the following agents: Babesia bovis and Babesia bigemina, and it is transmitted by the biological vector Rhipicephalus (Boophilus) microplus, causing hemoglobinuria in the animals. Because of the importance of the disease, this study aimed to determine the prevalence of anti-b. bovis and anti-b. bigemina antibodies in calves from the region of Araguaina-Tocantins. We collected 506 blood samples from calves, from 8 to 24 months-old, females and males, the 10 ml blood samples were aseptically collected by puncture of the coccygeal vein, and centrifuged to separate the serum, then stored at -20 C until the serological test. The determination of anti-b. bovis and anti-b. bigemina antibodies Statistical analysis between the variables was obtained through the statistical test Chi-square (χ 2 ) with Yates correction, for distribution of the prevalence of disease by age group was not applied this correction. To check if the sex was considered a risk factor or protection, we calculated odds ratio (OR). All statistical analyzes were performed using the statistical program Graphpad Prism. 5 - Windows (2009), with 95% a confidence interval (CI). We verified by odds ratio that there were no influence of sex for the infection to B. bovis (OR=1.703) and B. bigemina (OR=0.5689). The seroprevalence obtained was 90.5% and 91.7% for B. bigemina and B. bovis, respectively, characterizing the region as enzootic stability for the three species and offering risk during the introduction of susceptible animals from free or unstable areas in the region of Araguaina, needing the use of appropriate preventive measures for such animals. Keywords: Bovine babesiosis, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, enzootic stability, B. bovis, B. bigemina.

46 45 1 INTRODUÇÃO A babesiose bovina é uma hemoparasitose causada pelos protozoários Babesia bovis e Babesia bigemina, apresentando o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus como vetor biológico, sendo caracterizada por febre, anemia, anorexia, apatia, ataxia, taquipneia, hemoglobinúria e tremores musculares (GUGLIELMONE, 1995; SOARES et al., 2000; SILVA et al., 2007; SINGH; MISHRA; RAO, 2009). A importância econômica desta enfermidade está relacionada com elevada morbidade e mortalidade dos animais, principalmente em bezerros, bem como por diminuição do ganho de peso e queda na produção de leite, além de gastos com controle e profilaxia (MARTINS; CORRÊA; CERESÉR, 1996; GRISI et al., 2002; BARROS et al., 2005). A enfermidade tem distribuição mundial, com destaque nas regiões de clima tropical e subtropical (CANTÚ-MARTÍNEZ et al., 2008), podendo observar áreas com situações epidemiológicas diferentes: áreas livres, áreas de instabilidade e áreas de estabilidade. As áreas livres são aquelas em que as condições climáticas não favorecem a multiplicação de carrapatos (BERTO et al., 2008) e no Brasil, são consideradas restritas (KESSLER et al., 1987). As áreas de instabilidade enzoótica ocorrem em condições climáticas que limitam a multiplicação de vetores (KESSLER et al., 1983; BARROS et al., 2005; FOLLY et al., 2009), assim os animais não tendo contato com o patógeno são mais susceptíveis a doença clínica, quando transportados para a área de estabilidade (SANTOS et al., 2001). As áreas de estabilidade enzoótica têm os efeitos minimizados em decorrência dos bezerros serem protegidos por anticorpos maternos através do colostro e infectados durante os primeiros meses de vida, desenvolvendo sua imunidade ativa, resultando em menos casos clínicos da doença (MADRUGA et al., 1984; GONÇALVES, 2000; OKASI et al., 2002). Os estudos de prevalência destes hemoparasitos são de grande importância para a determinação da condição epidemiológica de uma região, indicando se há uma situação de instabilidade ou de estabilidade enzoótica, para adoção ou não de medidas profiláticas, minimizando os efeitos dessa enfermidade (MADRUGA et al., 2000). Considerando a escassez de dados sobre a epidemiologia da babesiose na região de Araguaína-TO, este trabalho teve como objetivo investigar a

47 46 soroprevalência de anticorpos anti-b. bovis e anti-b. bigemina região. em bezerros desta 2 MATERIAL E MÉTODOO 2.1 Área de estudo O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa uma área de 4.000,40 km 2, situada na região norte do Estado do Tocantins, localizando-se entre a latitude 07º11 28 e longitude 48º12 26, com uma altitude média de 227 metros (Figura 1), clima tropical úmido (SEPLAN, 2009), sendo considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO, 2001). Figura 1. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína. 2.2 Amostragem dos soros ( Tocantins_Municip_Araguaina.svg.png) O cálculo da amostra foi realizado através do programa Epi Info 6.04 considerando-se a população de bovinos na faixa etária de 0-24 meses de animais (ADAPEC, 2008), possibilidade de detecção da doença de 50%

48 47 (correspondente a doenças de ocorrência desconhecida em determinada população), intervalo de confiança de 95% e o pior resultado esperado de 10%, resultando no N amostral de 384 animais. Esse valor foi acrescido de 10% para reduzir potenciais perdas, resultando assim, num total de 423 amostras. Ao final foram coletados, aleatoriamente, 506 soros de bovinos com 8-24 meses de idade entre machos e fêmeas. A coleta foi realizada nos meses de março a junho de 2009, onde foram coletados 10 ml de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo estes centrifugados a 2000g por 10 minutos para separação dos soros e aliquotados em tubos tipo Eppendorf de 2 ml, os quais foram armazenados a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico; durante as coletas foi verificado se havia presença de carrapatos e se era realizado o controle dos mesmos. 2.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto A metodologia para análise dos soros foi a técnica do ELISA indireto descrita por Machado et al. (1997) com algumas modificações. O material coletado foi analisado no Laboratório de Imunoparasitologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária da UNESP (Jaboticabal-SP). Na microplaca de ELISA (Nunclon TM Surface, Nunc, Denmark) em cada poço foram adicionados 100 µl do antígeno solúvel diluído em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,05M ph 9,6, estando a concentração protéica padronizada em 10 µg/ml -1 (anti B. bovis e anti B. bigemina). As placas foram incubadas overnight a uma temperatura de 4ºC, o excesso de antígeno foi removido por três lavagens com tampão fosfato 0,05% (PBS) de Tween 20. As placas foram bloqueadas com 200 µl de Tween 20 contendo 5% de leite em pó desnatado por 90 minutos a 37ºC, para reduzir a ligação não-específica, sendo removido após a incubação com três lavagens consecutivas de PBS Tween 20. Cada amostra de soro (controle negativo, controle positivo, soro teste) foi diluída (1:100) em PBS Tween 20 com 5% de soro de coelho normal, adicionado em cada poço e incubadas por 90 minutos a 37ºC e lavadas como descrito acima. Foram adicionados em cada poço 100 µl de conjugado fosfatase alcalina anti-igg bovina (Sigma Chemical Co.) diluído em 1: e, em seguida, incubadas por 90 minutos a 37 C, sendo lavadas posteriormente. Finalizando o processo foi adicionado 100 µl, em cada poço, de um substrato p-nitrofenilfosfato

49 48 diluído em um tampão de dietanolamina ph 9,8. Esta placa foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. A leitura da reação foi realizada em um leitor de microplacas (Dynex Technology) a um comprimento de onda de 405 ηm. Os valores de absorbância (ponto de corte) nos soros foram agrupados em níveis de ELISA (NE), os quais variam de zero a nove preconizado por Machado et al. (1997) e a discriminação da absorbância (valor de corte) foi determinada como sendo duas vezes e meia a média do valor de absorção do grupo negativo, considerando as leituras acima do valor de corte positivas. 2.4 Análise estatística Para análise estatística das variáveis estudadas foi utilizado o teste estatístico do Qui-Quadrado (χ 2 ) com correção de Yates, para distribuição da prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico Graphpad Prism. 5 Windows (2009), com intervalo de confiança (IC) de 95%. 3 RESULTADO Durante as coletas de sangue foi verificada alta infestação por carrapatos em todas as propriedades, apesar do uso de medicamentos a base de avermectinas para controle de ectoparasitos. A pesquisa de anticorpos anti-b. bovis, em bezerros procedentes da região de Araguaína revelou uma positividade de 91,7% e para B. bigemina foi de 90,5%, não havendo diferença significativa entre a prevalência das espécies na região (p>0,05) (Tabela 1).

50 49 Tabela 1 - Prevalência dos bezerros positivos e negativos pelo Ensaio Imunoenzimático de Adsorção Indireto (ELISAi) para anticorpos anti- Babesia bovis e anti-babesia bigemina, na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Parasito Positivo Negativo Total N % N % N % B. bovis ns ,7 42 8, B. bigemina ,5 48 9, χ² Valor de p 0,3049 0,5808 OR (IC 95%) 1,158 (0,7503 a 1,787) ns não significativo pelo teste de Qui-quadrado (χ²) com correção de Yates ao nível de 5% de probabilidade OR= odds ratio; IC= intervalo de confiança (p>0,05) (Tabela 2). No presente trabalho, não houve influência do sexo no parasitismo Tabela 2 - Prevalência sorológica de anticorpos anti-babesia bovis e anti-babesia bigemina em bezerros segundo o sexo na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Sexo Positivo Negativo Total N % N % N % χ 2 Valor de p OR (IC 95%) Babesia bovis Macho ns ,0 12 6, Fêmea ns ,2 30 9, ,827 0,1765 1,703 (0,8500 a 3,911) Babesia bigemina Macho ns , , Fêmea ns ,5 23 4, ,942 0,0863 0,5689 (0,3132 a 1,033) ns não significativo pelo teste de Qui-quadrado (χ²) com correção de Yates ao nível de 5% de probabilidade OR= odds ratio; IC= intervalo de confiança A análise segundo a faixa etária revelou uma prevalência de 90,8%, 83,5% e 98,9% soropositivos para B. bovis, para as faixas etárias de 8-12 meses, meses e meses, respectivamente; havendo diferença significativa entre as faixas etárias de meses com as demais (p<0,05) (Tabela 4). Para B. bigemina a soroprevalência segundo a faixa etária foi de 90,2%, 90,7% e 90,5% soropositivos, para as mesmas faixas etárias descritas para B. bovis, entretanto, não houve diferença significativa entre elas (p>0,05) (Tabela 3).

51 50 Tabela 3 - Frequência sorológica de anticorpos anti-babesia bovis e anti-babesia bigemina em bezerros segundo a faixa etária na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Faixa etária (meses) Positivo Negativo Total N % N % N % χ 2 Valor de p Babesia bovis 8-12 b ,9 15 9, b , , a ,9 02 1, ,52 0, ns ,2 16 9, Babesia bigemina ns ,8 14 9, ns ,5 18 9, ,0274 0,9864 Variáveis seguidas por mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste do Qui-quadrado a 5% de probabilidade. ns não significativo pelo teste de Qui-quadrado (χ²) ao nível de 5% de probabilidade. 4 DISCUSSÃO Os valores encontrados para B. bovis (91,7%) e para B. bigemina (90,5%) em bezerros procedentes de Araguaína, Tocantins, demonstram uma alta prevalência de animais soropositivos para os agentes. Esses dados são aproximados aos resultados encontrados em bovinos no Estado do Pará (GUEDES JÙNIOR et al., 2008) e consideravelmente superiores aos valores encontrados nos Estados de Rondônia e Acre (BRITO et al., 2007), demonstrando que a enfermidade assume distribuição diferente dentro de uma mesma região. As diferenças encontradas em uma mesma região podem ser decorrentes da variação na taxa de infecção por carrapatos e, subsequentemente, de uma variação na taxa de inoculação nos bovinos (SALCEDO et al., 1987). Okasi et al. (2002) num estudo com infecção natural em bovinos Nelore, na região de Umuarama (PR), detectaram que entre as propriedades estudadas ocorreu uma variação de 36,7% a 92% de animais soropositivos para B. bovis, mostrando que dentro de uma mesma localidade, existem diferenças relevantes entre os rebanhos; fator esse que pode estar ligado a aumentos sazonais da população de carrapatos,

52 51 falhas em seu controle ou a introdução de animais susceptíveis oriundos de áreas livres de carrapato. É classificada como área de estabilidade enzoótica, aquelas nas quais os rebanhos apresentam uma frequência de anticorpos acima de 75% e áreas de instabilidade cujos rebanhos apresentam frequência inferior a 75% (MAHONEY; RONEY, 1972; D ANDREA et al., 2006). A soroprevalência encontrada no presente estudo foi superior 75%, caracterizando a região de Araguaína como área de estabilidade enzoótica para babesiose bovina. Segundo Kessler et al. (1983) numa situação de estabilidade enzoótica, os bezerros são infectados nos primeiros meses de vida, sendo protegidos por anticorpos colostrais (imunidade passiva), possibilitando o desenvolvimento de imunidade ativa sem sofrer a doença clínica. Entretanto, Silva et al. (2007) num estudo em bezerros de 1-50 dias de idade, concluíram que em condições de elevada infestação por carrapatos pode ocorrer alta morbidade e mortalidade, mesmo no período de proteção por anticorpos colostrais. Outras regiões do país foram consideradas como áreas de estabilidade e instabilidades como demonstra a Tabela 4. Tabela 4 - Prevalência de Babesia bovis e Babesia bigemina em diversas regiões brasileiras. Áreas Prevalência (%) B. bovis B. bigemina ESTABILIDADE Araguaína-TO (Presente estudo) 91,7 90,5 Nordeste do Pará (GUEDES JÚNIOR et al., 2008) 98,8 99,2 Goiânia-GO (SANTOS et al., 2001) 98,9 93,3 Mesorregião Fluminense-RJ (SOARES et al., 2000) 90,9 - Campos dos Goyatacazes-RJ (FOLLY et al., 2009) 90,5 78,7 Zona da Mata-MG (SALCEDO et al., 1987) 79,0 82,5 Paudalho-PE (BERTO et al., 2008) 76,5 97,6 Semiárido da Bahia (BARROS et al., 2005) 77,7 75,5 INSTABILIDADE Rondônia (BRITO et al., 2007) 9,0 3,0 Acre (BRITO et al., 2007) 7,1 0,8 Londrina-PR (VIDOTTO et al., 1997) 60,1 69,3 Mesorregião Fluminense-RJ (SOUZA et al., 2000) - 69,7

53 52 O hospedeiro e o meio ambiente são fatores que influenciam na prevalência da babesiose em uma determinada região (MAHONEY; ROSS, 1972). Considera a região Amazônica como área endêmica para babesiose devido a existência do carrapato durante todo o ano (LIMA et al., 1999). A alta prevalência observada nesse estudo corrobora os achados do levantamento formal, realizado no momento da coleta das amostras, onde foi observado alto grau de infestação por carrapatos mesmo nas propriedades que faziam uso de medicamentos do grupo farmacológico das avermectinas. Essas observações associadas ao clima úmido da região, que favorece a multiplicação de carrapatos principalmente na época chuvosa, podem ter contribuído para alta prevalência. Em relação ao sexo, não houve diferença significativa para B. bovis e para B. bigemina, resultados estes semelhantes aos encontrados por Soares et al (2000) e Souza et al. (2000) em pesquisa de Babesia spp em bovinos desenvolvida na mesorregião Norte Fluminense do Estado do Rio de Janeiro, verificando que o sexo não demonstrou ser fator de risco ou de proteção. Também não houve diferença significativa para faixa etária em animais infectados por B. bigemina, dados esses similares ao encontrado por Souza et al. (2000). Porém houve significância para B. bovis, destacando a faixa etária de meses com maior prevalência, resultado semelhante ao encontrado por Soares et al. (2000), que constataram uma diferença significativa quanto ao grupo etário estudado para B. bovis, sendo o grupo de um a três anos com maior prevalência do agente. Essa diferença pode está relacionada ao fato da região de Araguaína ser considerada como área de estabilidade e as fêmeas por possuírem anticorpos anti- Babesia bovis passam aos bezerros através do colostro (imunidade passiva). A imunidade perdura por aproximadamente dois meses quando então, o animal fica suscetível às infecções, produzindo seus próprios anticorpos (imunidade ativa) logo, quanto maior a idade maior a possibilidade do contato com o agente. Além da classificação de Araguaína, pela prevalência global, em área de estabilidade, outro fator levado em consideração é a distribuição da infecção pela faixa etária. De acordo com Gonçalves (2000), considera áreas de estabilidade enzoótica aquelas em que existe um equilíbrio entre imunidade e doença, tendo um percentual de 75% dos animais com idade acima de nove meses portadores da hemoparasitose, porém a infecção se mantém assintomática nos animais mais velhos devido as reinfecções pela manutenção da população de R. microplus, que

54 53 infestam os animais durante todo o ano, resultando em baixa mortalidade em animais adultos. 5 CONCLUSÃO A região de Araguaína foi considerada como uma área de estabilidade enzoótica para B. bovis e B. bigemina. Desta forma, a região estudada oferece risco aos animais suscetíveis, procedentes de áreas de instabilidade, que são introduzidos nessa região, sendo necessário o uso de medidas preventivas adequadas nessas ocasiões, principalmente, estratégias eficazes para o controle de carrapatos. AGRADECIMENTO A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, pela bolsa de estudo concedida. A Profª. Dra. Rosângela Zacarias Machado (Laboratório de Imunoparasitologia UNESP/Jaboticabal-SP), pela realização dos exames laboratoriais. REFERÊNCIAS ADAPEC- Agência de Defesa Animal do Estado do Tocantins. Rebanho bovino vacinado contra febre aftosa, Novembro BARROS, S. L.; MADRUGA, C. R.; ARAÚJO, F. R.; MENK, C. F.; ALMEIDA, M. A. O.; MELO, E. P. S.; KESSLER, R. H. Serological survey of Babesia bovis, Babesia bigemina, and Anaplasma marginale antibodies in cattle from the semi-arid region of the state of Bahia, Brazil, by enzyme-linked immunosorbent assays. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, n. 6, p , BERTO, R. S.; FAUSTINO, M. A. G.; MELO, L. E. H.; ALVES, L. C.; MADRUGA, C. R.; ALMEIDA, M. A. O.; RAMOS, C. A. N.; TENÓRIO, T. G. S.; SILVA, F. F. Frequência de anticorpos IgG anti-babesia bovis e anti-babesia bigemina em bovinos no Município do Paudalho, Zona da Mata do Estado de Pernambuco. Revista Medicina Veterinária, v. 2, n. 3, p. 9-12, 2008.

55 54 BRITO, L. G.; OLIVEIRA, M. C. S.; NETTO, F. G. S.; CAVALCANTE, F. A. Estratégias de prevenção e controle da tristeza parasitária bovina (TPB) a partir da avaliação molecular da infecção em rebanhos criados em diferentes regiões fisiográficas dos estados de Rondônia e Acre. EMBRAPA-Porto Velho, RO, Comunicado Técnico 329. Disponível em: < >. Acesso em: 01 dez CANTÚ-MARTÍNEZ, M. A.; SALINAS-MELÉNDEZ, J. A.; ZARATE-RAMOS, J. J.; ÁVALOS-RAMÍREZ, R.; MARTÍNEZ-MUNOZ, A.; SEGURA-CORREA, J. C. Prevalence of antibodies against Babesia bigemina and B. bovis in white-tailed deer (Odocoileus virginianus texanus) in farms of northeastern Mexico. Journal of Animal and Veterinary Advances, v. 7, n. 2, p , D'ANDREA, L. A. Z.; SARTOR, I. F.; MADRUGA, C. R.; FREITAS, S. B. Z.; KROLL, L. B.; KRONKA, S. N. Condição imunológica de bovinos das raças Holandesa e Nelore frente a Babesia bovis e B. bigemina em duas regiões do Estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, n. 2, p , FOLLY, M. M.; PEREIRA, M. A. V. C.; EMMOTT, V. P.; VITA, G. F.; MADRUGA, R. Ocorrência de Babesia sp. em bezerros mestiços, por meio de testes sorológicos, em Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 10, n. 1, p , GRISI, L.; MASSARD, C. L.; BORJA, G. E. M.; PEREIRA, J. B. Impacto econômico das principais ectoparasitoses em bovinos no Brasil. A Hora Veterinária, v. 21, n. 125, p. 8-10, GONÇALVES, P. M. Epidemiologia e controle da tristeza parasitária bovina na região sudeste do Brasil. Ciência Rural, v. 30, n. 1, p , GUEDES JUNIOR, D. S.; ARAÚJO, F. R.; SILVA, F. J. M.; RANGEL, C. P.; BARBOSA NETO, J. D.; FONSECA, A. H. Frequency of antibodies to Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale, Trypanosoma vivax and Borrelia burgdorferi in cattle from the Northeastern region of the State of Pará, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 17, n. 2, p , GUGLIELMONE, A. A. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South and Central America. Veterinary Parasitology, v. 57, n. 1-3, p , 1995.

56 55 KAMPEL, S. A.; CÂMARA, G.; MONTEIRO, A. M. V. Análise espacial do processo de urbanização da Amazônia Disponível em: < >. Acesso em: 19 dez KESSLER, R. H.; MADRUGA, C. R.; SCHENK, M. A. M.; RIBEIRO, O. C. Babesiose cerebral por Babesia bovis (Babés 1888 Starcovici 1893) em bezerros, no Estado de Mato Grosso do Sul. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 18, n. 8, p , KESSLER, R. H.; MADRUGA, C. R.; JESUS, E. F., SEMPREBOM, D. V. Isolamento de cepas puras de Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma marginale em área enzoótica. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 22, n. 7, p , LIMA, F. V. A.; MOLNÁR, E.; MOLNÁR, L.; SILVA, C. M. S. Exames soroepidemiológicos da babesiose bovina (Babesia bovis) através de um teste ELISA indireto no Estado do Pará. Revista de Ciências Agrárias (Belém), n. 32, p , MACHADO, R. Z.; MONTASSIER, H. J.; PINTO, A. A., LEMOS, E. G.; MACHADO, M. R. F.; VALADÃO, I. F. F.; BARCI, L. G.; MALHEIROS, E. B. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection on antibodies against Babesia bovis in cattle. Veterinary Parasitology, v. 71, n. 1, p , MADRUGA, C. R.; AYCARD, E.; KESSLER, R. H.; SCHENK, M. A. M.; FIGUEIREDO, G. R.; CURVO, J. B. E. Níveis de anticorpos anti-babesia bigemina e Babesia bovis, em bezerros da raça nelore, Ibagé e cruzamentos de nelore. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 19, n. 9, p , MADRUGA, C. R.; ARAÚJO, F. R.; MARQUES, A. P. C.; CARVALHO, C. M. E.; CUSINATO, F. Q.; CROCCI, A. J.; KESSLER, R. H.; MIGUITA, M. Desenvolvimento de uma prova de imunoadsorção enzimática para detecção de anticorpos contra Babesia bovis. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 20, n. 4, p , MAHONEY, D. F.; ROSS, D. R. Epizootiological factors in the control of bovine babesioses. Australian Veterinary Journal, v. 48, n. 5, p , MARTINS, J. R.; CORRÊA, B. L.; CERESÉR, V. H. Estudo comparativo entre as provas de Elisa e Imunofluorescência Indireta (IFI) para detectar anticorpos contra Babesia bovis. Ciência Rural, v. 26, n. 1, p , 1996.

57 56 OSAKI, S. C.; VIDOTTO, O.; MARANA, E. R. M.; VIDOTTO, M. C.; YOSHIHARA, E.; PACHECO, R. C.; IGARASHI, M.; MINHO, A. P. Ocorrência de anticorpos anti Babesia bovis e estudo sobre a infecção natural em bovinos da raça nelore, na região de Umuarama, Paraná, Brasil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 11, n. 2, p , SALCEDO, J. H. P.; RIBEIRO, M. F. B.; SANTOS, J. L.; FARIA, J. E. Epidemiologia das babesioses bovinas no Estado de Minas Gerais. I. Prevalência de anticorpos fluorescentes na zona da mata MG. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 39, n. 3, p , SANTOS, H. Q.; LINHARES, G. F. C.; MADRUGA, C. R. Estudo da prevalência de anticorpos anti- Babesia bovis e anti-babesia bigemina em bovinos de leite da microrregião de Goiânia determinada pelos testes de imunofluorescência indireta e elisa. Ciência Animal Brasileira, v. 2, n. 2, p , SEPLAN / TO Secretaria de Planejamento e Meio Ambiente do Estado do Tocantins. Disponivel em:< >. Acesso 05 nov SILVA, R. A.; CORRÊA, F. N.; BOTTEON, R. C. C. M.; BOTTEON, P. T. L. Infecção natural por hemoparasitos em bezerros submetidos à quimio-profilaxia aos 30 dias de idade. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 16, n.3, p , SINGH, H.; MISHRA, A. K.; RAO, J. R. Comparison of indirect fluorescent antibody test (IFAT) and slide enzyme linked immunosorbent assay (SELISA) for diagnosis of Babesia bigemina infection in bovines. Tropical Animal Health and Production, v. 41, n. 2, p , SOARES, C. O.; SOUZA, J. C. P.; MADRUGA, C. R.; MADUREIRA, R. C.; MASSARD, C. L.; FONSECA, A. H. Soroprevalência de Babesia bovis em bovinos na mesorregião Norte Fluminense. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 20, n. 2, p , SOUZA, J. C. P.; SOARES, C. O.; SCOFIELD, A.; MADRUGA, C. R.; CUNHA, N. C.; MASSARD, C. L.; FONSECA, A. H. Soroprevalência de Babesia bigemina em bovinos na mesorregião Norte Fluminense. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 20, n. 1, p , 2000.

58 VIDOTTO, O.; ANDRADE, G. M.; AMARAL, C. H. S.; BARBOSA, C. S.; FREIRE, R. L.; ROCHA, M. A.; VIDOTTO, M. C. Frequência de anticorpos contra Babesia bigemina, B. bovis e A. marginale em rebanho leiteiros da região de Londrina, Paraná. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 49, n. 5, p ,

59 58 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS Soroprevalência de anaplasmose bovina na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil Hébelys Ibiapina da Trindade ARAGUAÍNA 2010

60 59 RESUMO Soroprevalência de anaplasmose bovina na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil A anaplasmose bovina é uma hemoparasitose causada pela Anaplasma marginale. Pode ser transmitida biologicamente pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus, bem como mecanicamente por insetos hematófagos ou fômites contaminados. Devido à importância da enfermidade, a pesquisa objetivou determinar a soroprevalência de anticorpos anti-a. marginale da região de Araguaína, Tocantins. Foram coletadas 506 amostras de soros de bezerros com faixa etária compreendida de oito e 24 meses, fêmeas e machos, obtendo-se 10 ml de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo centrifugado para separação do soro e armazenado a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico. A determinação dos anticorpos anti-a. marginale foi realizada por meio do ensaio imunoenzimático de adsorção indireto e como análise estatística utilizouse o Qui-Quadrado (χ 2 ) com correção de Yates, para distribuição da prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico Graphpad Prism. 5 Windows (2009), com intervalo de confiança (IC) de 95%. A influência do sexo na infecção por A. marginale (OR=2,040) funcionou como um fator de proteção para as fêmeas. A prevalência obtida para bezerros foi de 89,9% para A. marginale, caracterizando a região como área de estabilidade enzoótica, com os animais infectados servindo como fonte de infecção para os demais, principalmente, aqueles procedentes de regiões de instabilidade ou de áreas livres, onde o contato com o agente resultaria em doença potencialmente fatal. Palavras-chave: Anaplasma marginale, bezerros, ELISA indireto, estabilidade enzoótica.

61 60 ABSTRACT Seroprevalence of bovine anaplasmosis in the region of Araguaina, State of Tocantins, Brazil The bovine anaplasmosis is a hemoparasitosis caused by Anaplasma marginale. Can be transmitted biologically by Rhipicephalus (Boophilus) microplus ticks, and mechanically by insect bites or contaminated fomites. Due the diseases importance, this research aims to determinate the sereprevalence of anti-a. marginale in the region of Araguaína, Tocantins. 506 blood samples were collected from calves, from 8 to 24 months-old, females and males, the 10 ml blood samples were aseptically collected by puncture of the coccygeal vein, and centrifuged to separate the serum, then stored at -20 C until the serological test. The determination of anti-a. marginale antibodies was made using indirect Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). Statistical analysis between the variables was obtained through the statistical test Chi-square (χ 2 ) with Yates correction, for distribution of the prevalence of disease by age group was not applied this correction. To check if the sex was considered a risk factor or protection, we calculated odds ratio (OR). All statistical analyzes were performed using the statistical program Graphpad Prism. 5 - Windows (2009), with 95% a confidence interval (CI). The influence of sex on infection by A. marginale (OR = 2.040) functioned as a protective factor for females. The obtained prevalence in the calves was 89.9% for A. marginale, characterizing the region as enzootic stability region, in which the infected animals serve as source of infection to others, especially those coming from regions of enzootic instability or free areas, where contact with the agent would result in potentially fatal disease. Keywords: Anaplasma marginale, calves, indirect ELISA, enzootic stability.

62 61 1 INTRODUÇÃO A anaplasmose bovina é responsável por causar perdas econômicas, principalmente, em países de clima tropical e subtropical, com alta morbidade e mortalidade em bovinos (BARROS et al., 2005; GUEDES JÚNIOR et al., 2008), em especial os bezerros (RIBEIRO; REIS, 1981), caracterizada por febre, anemia, perda de peso, diminuição na produção de leite, abortamento e icterícia (OLIVEIRA et al., 2003; RAMOS et al., 2007; MARANA et al., 2009). É causada pela rickettsia intraeritrocítica Anaplasma marginale, transmitida biologicamente por carrapatos e, mecanicamente por dípteros hematófagos e fômites contaminados por sangue (SOUZA et al., 2001; ARAÚJO et al., 2003; CARELLI et al., 2007). No Brasil, Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o responsável pela transmissão biológica da anaplasmose; entre os carrapatos a transmissão pode ocorrer tanto transestadial como intraestadialmente (KESSLER, 2001; PACHECO et al., 2004). É importante conhecer a interação entre agente, hospedeiro e ambiente, para caracterização das hemoparasitoses nas regiões fisiográficas, determinando as áreas endêmicas do país (GONÇALVES, 2000). Existem vários métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-a. marginale, sendo o ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) indireto o mais utilizado, devido à simplicidade do teste, alta sensibilidade e especificidade, além de permitir a análise de um número maior de amostras (BRAZ JÚNIOR et al., 1997; ARAÚJO et al., 1998; MADRUGA et al., 2000). A anaplasmose pode ser distribuída em áreas livres, as quais possuem condições climáticas não favoráveis à multiplicação dos vetores; em áreas de instabilidade enzoótica, onde as condições climáticas não são totalmente favoráveis ao desenvolvimento dos vetores, porém podem ocorrer em uma determinada época do ano, episódios de infestação temporária em população de risco; e áreas de estabilidade enzoótica onde têm clima favorável ao desenvolvimento de vetores durante todo o ano (VIDOTTO; MARANA, 2001). A região de Araguaína possui o segundo maior rebanho de bovinos no Estado do Tocantins (ADAPEC, 2008), sendo importante o desenvolvimento de pesquisas a respeito da prevalência de enfermidades que interferem na produtividade dos animais. Devido aos poucos estudos relacionados à epidemiologia

63 62 da anaplasmose em Araguaína foi desenvolvido o presente trabalho com o objetivo de determinar a soroprevalência de anticorpos anti-a. marginale em bezerros desta região. 2 MATERIAL E MÉTODOO 2.1 Área de estudo O referente trabalho foi desenvolvido na região de Araguaína que ocupa uma área de 4.000,40 km 2, situada na região norte do Estado do Tocantins, localizando-se entre a latitude 07º11 28 e longitude 48º12 26, com uma altitude média de 227 metros (Figura 1), clima tropical úmido (SEPLAN, 2009), sendo considerada como parte da Amazônia Oriental (KAMPEL; CÂMARA; MONTEIRO, 2001). Figura 1. Mapa do Estado do Tocantins, demonstrando a região de Araguaína. 2.2 Amostragem dos soros ( Tocantins_Municip_Araguaina.svg.png) O cálculo da amostra foi realizado através do programa Epi Info 6.04 considerando-se a população de bovinos na faixa etária de 0-24 meses de

64 63 animais (ADAPEC, 2008), possibilidade de detecção da doença de 50% (correspondente a doenças de ocorrência desconhecida em determinada população), intervalo de confiança de 95% e o pior resultado esperado de 10%, resultando no N amostral de 384 animais. Esse valor foi acrescido de 10% para reduzir potenciais perdas, resultando assim, num total de 423 amostras. Ao final foram coletados, aleatoriamente, 506 soros de bovinos com 8-24 meses de idade entre machos e fêmeas. A coleta foi realizada nos meses de março a junho de 2009, onde foram coletados 10 ml de sangue, assepticamente, por punção da veia coccígena, sendo estes centrifugados a 2000g por 10 minutos para separação dos soros e aliquotados em tubos tipo Eppendorf de 2 ml, os quais foram armazenados a -20ºC até o momento da realização do teste sorológico; durante as coletas foi verificado se havia presença de vetores e se era realizado o controle dos mesmos. 2.3 Ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto A metodologia para análise dos soros foi a técnica do ELISA indireto descrita por Machado et al. (1997) com algumas modificações. O soro obtido foi analisado no Laboratório de Imunoparasitologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária da UNESP (Jaboticabal-SP). Na microplaca de ELISA (Nunclon TM Surface, Nunc, Denmark) em cada poço foram adicionados 100 µl do antígeno solúvel diluído em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,05M ph 9,6, estando a concentração protéica padronizada em 10 µg/ml -1 (anti A. marginale). As placas foram incubadas overnight a uma temperatura de 4ºC, o excesso de antígeno foi removido por três lavagens com tampão fosfato 0,05% (PBS) de Tween 20. As placas foram bloqueadas com 200 µl de Tween 20 contendo 5% de leite em pó desnatado por 90 minutos a 37ºC, para reduzir a ligação não-específica, sendo removido após a incubação com três lavagens consecutivas de PBS Tween 20. Cada amostra de soro (controle negativo, controle positivo, soro teste) foi diluída (1:100) em PBS Tween 20 com 5% de soro de coelho normal, adicionado em cada poço e incubadas por 90 minutos a 37ºC e lavadas como descrito acima. Foram adicionados em cada poço 100 µl de conjugado fosfatase alcalina anti-bovino IgG (Sigma Chemical Co.) diluído em 1: e, em seguida, incubadas por 90 minutos a 37 C, sendo lavadas posteriormente. Finalizando o processo foi adicionado 100 µl

65 64 em cada poço, um substrato p-nitrofenilfosfato diluído em um tampão de dietanolamina ph 9,8. Esta placa foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. A leitura da reação foi realizada em um leitor de microplacas (Dynex Technology) a um comprimento de ondas de 405 ηm. Os valores de absorbância (ponto de corte) nos soros foram agrupados em níveis de ELISA (NE), os quais variam de zero a nove preconizado por Machado et al. (1997). A discriminação da absorbância (valor de corte) foi determinada como sendo duas vezes e meia a média do valor de absorção do grupo negativo, considerando as leituras acima do valor de corte positivas. 2.4 Análise estatística Para análise estatística das variáveis estudadas foi utilizado o teste estatístico do Qui-Quadrado (χ 2 ) com correção de Yates, para distribuição da prevalência das enfermidades pela faixa etária não foi aplicada essa correção. Para verificação se o sexo era considerado fator de risco ou de proteção foi calculado a Odds ratio (OR). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa estatístico Graphpad Prism. 5 Windows (2009), com intervalo de confiança (IC) de 95%. 3 RESULTADO Durante as coletas de sangue foi verificada alta infestação por carrapatos e presença massiva de insetos hematófagos nas propriedades (Figura 2), apesar do uso de medicamentos a base de avermectinas para carrapatos e de piretróides como a cipermetrina usada como inseticida e acaricida.

66 65 Figura 2. Presença de insetos hematófagos durante a realização das coletas, na região de Araguaína-TO. A pesquisa de anticorpos anti-a. marginale em bezerros procedentes da região de Araguaína revelou uma prevalência de 89,9%, com diferença significativa para o sexo que funcionou como um fator de proteção para infecção por A. marginale (OR=2,040) (Tabela 1), estando as fêmeas mais protegidas para infecção que os machos. Tabela 1 - Prevalência sorológica de anticorpos anti-anaplasma marginale em bezerros segundo o sexo na região de Araguaína, Estado do Tocantins, Brasil. Anaplasma marginale OR Sexo Positivo Negativo Total χ² Valor de p (IC 95%) N % N % N % Macho a ,5 13 6, ,040 4,044 0,0443 Fêmea b , , (1,057 a 3,934) Variáveis seguidas por mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste do Qui-quadrado com correção de Yates a 5% de probabilidade. OR= odds ratio; IC= intervalo de confiança (p>0,05) (Tabela 2). Não houve diferença significativa entre as faixas etárias analisadas