Estrutura tridimensional das proteinas

Transcrição

1 Estrutura tridimensional das proteinas

2 Talvez as características mais notáveis (mioglobina) sejam a sua complexidade e ausência de simetria, Nature,1958 John Kendrew

3 Kendrew & Perutz PN 1962 pelos estudos de estruturas de proteínas globulares

4 1920 s várias proteínas cristalizadas urease (MM ) hemoglobina (MM )

5 Como é que uma sequência de aminoácidos se traduz numa estrutura tridimensional? A estrutura tridimensional de uma proteína é determinada pela sequência de aminoácidos. A função de uma proteína depende da sua estrutura. Uma proteína isolada existe em várias formas estáveis. As forças mais relevantes na estabilização das estruturas específicas são não covalentes. Apesar do grande nº de estruturas únicas, é possível reconhecer padrões estruturais.

6 Conformação arranjo espacial dos átomos numa proteína. Muitas conformações são teoricamente possíveis, mas só algumas predominam em condições biológicas as que são termodinamicamente mais estáveis. Quais os princípios que determinam a conformação mais estável de uma proteína?

7 Estabilidade de uma proteína tendência para manter uma conformação nativa (funcional). Interacções químicas que estabilizam a conformação nativa: Ligações dissulfureto Interacções fracas : Ligações de H, Ligações iónicas Interacções hidrofóbicas

8 A conformação mais estável é que tem um maior nº de interacções fracas As interacções hidrofóbicas predominam Aumento de entropia das moléculas da H 2 O Formação de ligações de hidrogénio Cada grupo polar ou carregado deve ter o seu contraponto. As ligações iónicas limitam a flexibilidade estrutural.

9 Os resíduos hidrofóbicos estão no interior da proteína. O número de pontes de hidrogénio e de interacções iónicas no interior da proteína é maximizado.

10 Níveis de estrutura de uma proteína

11 A ligação peptídica Nível primário de estrutura As ligações covalentes impõem constrangimentos à conformação de um polipéptido

12 Estrutura primária das proteínas Pauling PN 1954 (Q) PN 1962 (Paz) Stop the war! Pauling propôs em 1950 o primeiro modelo aceitável para a molécula de proteína!

13 A unidade peptídica é planar e rígida. Tem em parte carácter de ligação dupla Lig simples-1.47 Å Lig dupla-1,20 Å O oxigénio do grupo carbonilo tem uma carga parcial negativa e o azoto da amida uma carga parcial positiva criando um dipolo.

14 O grupo peptídico planar As ligações peptídicas limitam a gama de conformações possíveis para a cadeia polipeptídica.

15 ψ (graus) Gráfico de Ramachandran para L-Ala Φ (graus) Valores permitidos para Φ e ψ

16 Todas as proteínas têm uma estrutura que reflecte a sua função. A estrutura de uma proteína é estabilizada por múltiplas interacções fracas. A natureza das ligações covalentes no esqueleto da proteína impõe constrangimentos. A dupla ligação tem em parte carácter de ligação dupla colocando os átomos do grupo peptídico numa configuração planar rígida. As ligações N-Cα e Cα-C podem rodar definindo os ângulos diedro Ψ e Φ respectivamente.

17 Nível secundário de estrutura

18 Estrutura secundária de uma proteína (geometria local) Refere-se a um segmento de uma cadeia polipeptídica Descreve os arranjos espaciais locais dos átomos da cadeia principal, sem considerar a conformação das cadeias laterais ou relações com outros segmentos da cadeia. Hélice α e conformação β (previstas por Pauling e Corey, 1951). hélice α é a mais comum

19 Modelo da hélice α Extremo amina Extremo carboxilo

20 Modelo da hélice α

21 Hélice α É estabilizada por ligações de H entre o átomo de H ligado ao N electronegativo da ligação peptídica e o átomo de oxigénio electronegativo do grupo carbonilo do 4º aminoácido seguinte. Todas as ligações peptídicas participam nestas ligações de H

22 A sequência de aa afecta a estabilidade da hélice α Os resíduos Pro e Gly têm a menor tendência para formar hélices α por motivos diferentes. A alanina tem a maior tendência para formar hélices α em modelos experimentais. Um conjunto de resíduos Glu não forma uma hélice α. Muitos resíduos Lys e/ou Arg também não formam hélices α. O volume e a forma de Asn, Ser, Thr e Cys, desestabilizam a hélice se estiverem perto

23 N O dipolo da hélice C

24 A estabilidade da hélice α é afectada por: 1.Propensão intrínseca de cada resíduo de aa para formar hélice α. 2.Interacções entre grupos R (sobretudos os separados por 3 ou 4 resíduos). 3.Tamanho dos grupos R adjacentes. 4.Ocorrência de resíduos Pro e Gly. 5. Interacções entre resíduos de aa nos extremos e o dipolo inerente à hélice.

25 Mioglobina (153 resíduos) 79% hélice α Insulina (51 resíduos) 52% hélice α Citocromo c (104 resíduos) 39% hélice α

26 A conformação β (folhas pregueadas β) Também previstas por Pauling e Corey Confirmadas por difracção de Raios X Antiparalelas Vista de topo Vista de lado

27 Paralelas Vista de topo Vista de lado

28 Na conformação β, as ligações de hidrogénio formamse entre segmentos adjacentes de uma cadeia polipeptídica. Os segmentos podem estar próximos na cadeia polipeptídica mas também podem estar distantes na sequência linear do polipéptido. Em algumas estruturas os aa empacotados nas conformações β têm que ter grupos R pequenos. A alanina e glicina são frequentes nestas estruturas.

29 Estrutura de β turns (elementos de ligação) A glicina e a prolina são comuns nestas estruturas

30 folhas pregueadas β antiparalelas ψ (graus) folhas pregueadas β paralelas tripla hélice de colagéneo folhas pregueadas β enroladas à direira α-hélice esquerda α-hélice direita Gráfico de Ramachandran Φ (graus)

31 ψ (graus) Φ (graus) Ramachandran para piruvatocinase de músculo coelho

32 Estrutura terciária conformação tridimensional biologicamente activa Aminoácidos que estão afastados na sequência linear e estão em diferentes tipos de estrutura secundária podem interactuar. Estrutura quaternária arranjo espacial das subunidades em complexos tridimensionais

33 A forma das proteínas Proteínas fibrosas : constituídas em geral por um único tipo de estrutura secundária e uma estrutura terciária relativamente simples. Alongadas, insolúveis Proteínas globulares : Em geral contêm vários tipos de estrutura secundárias. Compactas, esféricas solúveis

34 Estruturas secundárias e propriedades de algumas proteínas fibrosas Estrutura Características Exemplos Hélice α (entrecruzada por ligações S-S) Rija, estruturas protectoras com dureza e flexibilidade variadas) α- queratina do cabelo, penas e unhas Conformação β Filamentos flexíveis Fibroína da seda Hélice tripla Enrolamento ao acaso (ligações covalentes entre cadeias laterais) Elevada força de tensão sem flexibilidade Elevada flexibilidade e elasticidade Colagéneo dos tendões ossos, etc Elastina dos vasos sanguíneos

35 Estrutura da α queratina (cabelo) α-hélice 2 cadeias enroladas para a esquerda protofilamentos protofibrila As α queratinas pertencem à família dos filamentos intermediários

36 células filamento intermediário protofibrila protofilamento 2 cadeias α-hélice Secção de um cabelo Secção de um cabelo

37 As superfícies das duas cadeias são constituídas por resíduos de aa hidrofóbicos empacotamento forte. Ala, Val, leu, Ile, Met e Phe Estrutura terciária simples dominada por estrutura secundária em hélice α. Estrutura quaternária - interligação dos dois polipéptidos em hélice α Ligações S-S entre cadeias estabilizam a estrutura quaternária (18% das cisteínas estão envolvidas em ligações S-S no corno do rinoceronte)

38 As permanentes são Engenharia Bioquímica

39 Estrutura do colagéneo hélice tripla Gly X Pro Gly X 4-Hyp Gly 3 Hélice esquerda de prolinas(3res/volta)

40 Estrutura das fibrilas de colagéneo cabeças da molécula de colagéneo zonas cruzadas(64nm) Tendão-100% colag. Cartilagem-colag. embebido em matriz poliosídica Osso-matriz colag. cimentada por depósitos de Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 secção da molécula de colagéneo Nos vertebrados há muitos tipos de colagéneo

41 Estrutura das fibrilas de colagéneo cabeças da molécula de colagéneo zonas cruzadas(64nm) Tendão-100% colag. Cartilagem-colag. embebido em matriz poliosídica Osso-matriz colag. cimentada por depósitos de Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 Colagéneo típico: 35% Gly secção da molécula de colagéneo 11% Ala 21% Pro(Hyp)

42 Estrutura das fibrilas de colagéneo cabeças da molécula de colagéneo zonas cruzadas(64nm) Tendão-100% colag. Cartilagem-colag. embebido em matriz poliosídica Osso-matriz colag. cimentada por depósitos de Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 secção da molécula de colagéneo Cross-links invulgares entre Lys, 5-HyL ou His (X)

43 Vitaminas grupo de pequenas moléculas nutrientes essenciais para muitos organismos multicelulares (humanos em particular). vitamin = vital amine

44 Vitaminas grupo de pequenas moléculas nutrientes essenciais para muitos organismos multicelulares (humanos em particular). vitamin = vital amine Walter Norman Haworth PN 1937(Q) for his work in determining the structure of ascorbic acid Paul Karrer PN 1937(Q) for his work on Vitamins Albert Szent-Györgyi PN 1937(M) for his studies of the biological functions of L-ascorbic acid

45 20% dos mamíferos não sintetizam Vit C A China fornece 80% da Vit C mundial Dose discutível: <2g/dia? Obrigatório fumadores, grávidas, stress Panaceia universal Apenas 20% dos marinheiros de Fernão de Magalhães sobreviveram (1820) Na viagem à India de Vasco da Gama morreu 2/3 da tripulação Entre milhão de mortos com escorbuto

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47 Vitamina C e Escorbuto Formação da hidroxiprolina A prolina é hidroxilada em C-4 por acção da prolil hidroxilase, um enzima que activa o oxigénio molecular

48 prolil 4-hidroxilase resíduo Pro α-oxoglutarato resíduo 4-Hyp succinato prolil 4-hidroxilase α-oxoglutarato ascorbato succinato ascorbato oxidado

49 A reacção é assistida por um ião Fe 2 + ligado ao enzima e que é necessário para activar o O 2. O enzima também converte α-cetoglutarato em succinato sem hidroxilar a prolina. Nesta reacção forma-se um complexo Fe 3+ - O, que inactiva o enzima. O enzima é regenerado por acção do ascorbato (vit C) que reduz o Fe 3+ a Fe 2 + sendo ele próprio oxidado a ácido desidroascórbico.

50 Consequências da não hidroxilação da prolina poli (Pro-Pro-Gly) Tm = 24ºC poli(pro-hypro-gly) Tm = 58ºC A hidroxiprolina estabiliza a hélice tripla promovendo ligações de H entre cadeias.

51 Estrutura da seda: as fibras da seda e da teia da aranha são constituídas pela proteína fibroína A fibroína consiste em camadas de folhas β antiparalelas ricas em resíduos Ala e Gly Cadeia lateral da alanina Cadeia lateral da glicina

52 Cadeias de fibroína (azul) em microscopia electrónica

53 folhas β antiparalelas Ala Gly Não extensível Flexível

54 As proteínas globulares são compactas. Incluem enzimas, proteínas de transporte, proteínas motoras, proteínas reguladoras, imunoglobulinas, etc. Conformação β Hélice α Forma globular nativa

55 Representações da estrutura terciária da mioglobina de cachalote

56 Mioglobina MM (cachalote) Cadeia única com 156 resíduos+heme Músculo Funções: Transporte e armazenamento de O2 Difusão facilitada de O 2 (contracção muscular)

57 resíduos hidrófobos Leu, Ile, Val, Phe A maior parte dos resíduos hidrófobos no interior Compacta Interior hidrófobo 4 H 2 O no interior 70% hélice α

58 4 S-S 40% hélice α algumas folhas β Lisozima PDB ID 3LYM

59 4 S-S 40% hélice α algumas folhas β MM ;129 res.; clara de ovo; lágrima humana; catalisa a hidrólise de poliósidos de algumas paredes bacterianas(agente bactericida) Lisozima PDB ID 3LYM

60 hélice α muitas folhas β 4 S-S MM ; 124 res.; produzido no pâncreas e activo no intestino delgado Ribonuclease PDB ID 3RN3

61 % aproximada de hélices α e estruturas β nalgumas proteínas globulares de cadeia única resíduos Proteína (nº resíduos) hélice α conformação β quimotripsina ribonuclease carboxipeptidase citocromo c lisozima mioglobina Comum Interacções hidrófobas no interior grupos hidrófilos no exterior muitas ligações de H algumas interacções Iónicas

62 Proteínas globulares grandes Estruturas supersecundárias (motivos)- arranjos estáveis de elementos de estruturas secundárias

63 Motivos β com ligações típicas Motivos β com ligações crossover (não observado)

64 Domínio- parte da cadeia polipeptídica que é estável independentemente da proteína total(clivagem hidrolítica). Às vezes é um segmento contínuo da sequência. Pode sofrer movimentos relativamente à totalidade da proteína. As proteínas pequenas têm um só domínio. O domínio é a proteína!

65 Troponina C (PDB ID 4TCN) Alguns domínios são suficiente/ estáveis para existirem autónomos em meio aquoso (experiências de clonagem e expressão do domínio)

66 Repressor Lac de E. coli (tetrâmero com dois domínios)

67 Domínio de α hemolisina de Staphilococcus aureus (toxina que mata células criando poros na membrana)

68 Nível quaternário

69 Hemoglobina (MM ; 2 cadeias α - 2x141 res.+ 2 cadeias β - 2x146 res.) Tetrâmero α 2 β 2 ou dímero (αβ) 2

70 Homodímero a 2 Heterodímero ab Multímeros(subunidades= protómeros) Regulação Funções mas relacionadas (catálise e regulação) Heterotetrâmero a 2 b 2 Heteropentâmero a 2 bcd

71 As proteínas multiméricas com subunidades idênticas podem ter uma simetria rotacional ou helicoidal Simetria icosaédrica (rotacional) Poliovirus:diâmetro 300 Å

72 Simetria helicoidal Subunidade proteica Virus do mosaico do tabaco: diam. 180 Å; comp Å

73 Há limite à dimensão da proteína? Maior dimensão Maior complexidade funcional Factores limitantes: 1. Capacidade codificadora do DNA É mais fácil fazer muitas cópias de um pequeno polipéptido do que uma cópia de uma grande estrutura! Ex: capside do vírus, citoesqueleto, enzimas (MM múltiplas subunidades)

74 Há limite à dimensão da proteína? Maior dimensão Maior complexidade funcional Factores limitantes: 2. Precisão do processo de tradução Frequência do erro: 1 / resíduos

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76 Desnaturação e folding de proteínas A desnaturação de uma proteína resulta da perda da estrutura tridimensional que dá origem à perda da sua função. Agentes desnaturantes: calor, phs extremos, solventes orgânicos, detergentes.

77 A sequência de aminoácidos determina a estrutura terciária A desnaturação de algumas proteínas é reversível. (a maioria necessita de ajuda). Adição de ureia e mercaptoetanol Estado nativo, cataliticamente activo Estado desenrolado. Inactivo. Ligações S-S- reduzidas Remoção da ureia e mercaptoetanol Desnaturação e renaturação da ribonuclease Nativa, cataliticamente activa. Ligações S-Sreformuladas

78 O folding das proteínas - os polipéptidos dobram-se num processo sequencial. Via simulada de folding

79 O folding correcto das proteínas é facilitado por proteínas - chaperones moleculares Proteínas Hsp70 Chaperoninas

80 As vias de folding de algumas proteínas requerem 2 enzimas que catalisam reacções de isomerização: Isomerase dissulfito de proteínas (PDI) catalisa a troca de ligações dissulfureto até que as ligações da conformação nativa estejam formadas. Elimina intermediários com ligações S S incorrectas. Isomerase prolil cis-trans peptídico catalisa a interconversão dos isómeros cis e trans do resíduo prolina que é um passo limitante no folding de proteinas que contêm Pro. Defeitos no folding podem ser a base molecular de doenças humanas Doenças associadas a folding incorrecto de proteínas: doença de Alzheimer, Parkinson, BSE, etc