2009/2010. Instituto Superior Técnico. Relatório TP1. Análise de Proteínas por Electroforese PAGE) em Gel de SDS-Poliacrilamida (SDS-

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1 Relatório TP1 Análise de Proteínas por Electroforese em Gel de SDS-Poliacrilamida (SDS- PAGE) 2009/2010 Instituto Superior Técnico Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica 2º Ano Bioquímica e Biologia Molecular Turma D - Grupo 1: Ângelo Dias, n.º65087 Márcia Santos, n.º65111 Mariana Branco, n.º Outubro de 2009 Prof.: Jorge Leitão

2 Resumo Analisou-se uma mistura proteica complexa através da técnica de Electroforese em Gel de SDS- Poliacrilamida (SDS-PAGE), de modo a que as diferentes moléculas fossem diferenciadas através do seu peso molecular, sendo este estimado por comparação da mobilidade electroforética das proteínas desconhecidas com as de peso molecular conhecido (padrão). Obteve-se para a proteína A 64,358 kda e para a proteína B 15,146 kda. Introdução teórica As proteínas são macromoléculas constituídas por aminoácidos compostos quaternários de carbono, hidrogénio, oxigénio e azoto que possuem na sua estrutura um grupo amina (NH 2 ), um grupo carboxilo (COOH) e um grupo R, que distingue os 20 aminoácidos, todos ligados ao carbono. A ligação entre cada dois aminoácidos de uma cadeia polipeptídica ligação peptídica é feita entre o OH do carboxilo e o H do amina, com a libertação de uma molécula de água, sendo esta ligação responsável pelo estabelecimento da estrutura primária de uma proteína ou de um polipéptido. A distinção entre polipéptido e proteína não se resume apenas ao número de aminoácidos constituintes (cadeia peptídica: menos de 80 a 100 aminoácidos e cadeia proteica mais de 80 a 100 aminoácidos) mas também às diferentes funções biológicas que desempenham. De notar ainda, que uma cadeia peptídica corresponde a uma sequência de mais de dois resíduos de aminoácidos (é mais correcto falarmos em resíduos de aminoácidos, pois perderam o OH do grupo carboxilo e o H do grupo amina ao integrarem a referida cadeia). As proteínas podem ter quatro tipos de estrutura (Fig.2) dependendo da natureza dos aminoácidos que possuem, do tamanho da cadeia e da sua configuração espacial: Fig.1 Estrutura de um aminoácido Estrutura Primária Estrutura primária corresponde à sequência dos aminoácidos da cadeia polipeptídica sem que se considere um arranjo espacial; Estrutura secundária é o arranjo espacial local dos átomos da cadeia principal, sem considerar a conformação das suas cadeias laterais ou as suas relações com outras porções; Estrutura terciária arranjo de todos os seus átomos no espaço, sem considerar as suas relações com moléculas ou subunidades vizinhas; Estrutura quaternária é o arranjo das suas subunidades no espaço e o conjunto dos respectivos contactos e interacções inter-subunitárias, sem considerar a geometria das subunidades. Estrutura Secundária Estrutura Terciária Estrutura Quaternária Fig.2 Diferentes estruturas proteicas. 2

3 Assim sendo, as propriedades e funções das proteínas são determinadas pelo número e tipo de aminoácidos e pela sua estrutura tridimensional, mantida por interacções fracas como ligações por pontes de hidrogénio e por pontes de dissulfureto, as quais são facilmente quebradas por acção de agentes desnaturantes como o calor, ácidos, sais ou álcool. À perda desta estrutura globular das proteínas e consequente conversão numa estrutura linear dá-se o nome de desnaturação proteica. Outra característica importante destas biomoléculas é o facto de, quer a força iónica, quer o ph do meio influenciarem a solubilidade das proteínas na água, sendo esta solubilidade mínima na vizinhança do ponto isoeléctrico (valor de ph para o qual a carga absoluta da proteína é nula). Ou seja, próximo deste ponto é fácil precipitar a proteína e, caso a coloquemos num campo eléctrico, não sofre migração. A necessidade do estudo destas propriedades é muito relevante para a utilização correcta da técnica electroforética. A electroforese é uma técnica rápida e eficaz de separação de misturas proteicas complexas com base no seu peso molecular, da qual Arne Tiselius foi o pioneiro. Estudou e avaliou esta técnica desde 1937, ganhando um prémio Nobel em 1948 pelo trabalho desenvolvido sobre a separação de coloides. Nas décadas de 40 e 50 a técnica foi aplicada a largas proteínas e iões orgânicos e consequentemente desenvolvida até aos dias de hoje. A electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida é então uma optimização da técnica electroforética primordial, através do uso de géis e outros compostos que melhoram a qualidade e rapidez de obtenção dos resultados. O SDS é um detergente aniónico (alta carga negativa) e ph neutro que desnatura as proteínas, isto é, converte-as na sua estrutura linear e cobre-as de cargas negativas, mascarando desta forma as suas cargas inicias. Deste modo é conferida à proteína uma densidade de carga constante para que esta possa ser separada somente em função do seu tamanho. Assim, a velocidade de corrida no gel de poliacrilamida é proporcional ao tamanho das proteínas e não depende da sua carga nem da sua conformação. A interacção do SDS com as proteínas dá-se através da sua cauda hidrofóbica, ligando-se uma molécula de SDS por ligação peptídica. Por outro lado, PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) utiliza um gel em que os monómeros de acrilamida polimerizam através de uma reacção em cadeia de radicais livres envolvendo persulfato de amónio (PSA) e N,N,N,N - tetrametillinediamina (TEMED). O primeiro activa este último formando um radical que reage com a molécula de acrilamida. Esta, por sua vez, transforma-se também num radical que vai reagir sucessivamente com outros monómeros de acrilamida, até formarem cadeias longas que seguidamente se ligam entre si por crosslinking. Este número de ligações cruzadas vai permitir definir o tamanho dos poros do gel. São este poros que oferecem resistência à passagem das proteínas ao longo da sua corrida no gel, ou seja, proteínas com maior massa molecular têm mais dificuldades a passá-los e, consequentemente, percorrem menores distâncias no mesmo intervalo de tempo do que as de menores dimensões. A preparação do gel é feita em duas fases: primeiro um gel de malha larga, gel de separação (12,5% de acrilamida), que é colocado debaixo do segundo, um gel de concentração (6% de acrilamida), o qual permite que os resíduos proteicos entrem na malha criada de forma líquida. A separação SDS-PAGE é feita através de migração vertical das proteínas no gel, quando sujeitas a um campo eléctrico de 150V durante aproximadamente 1 hora. Depois de migrarem de acordo com a sua densidade carga, utiliza-se uma solução com azul de Comassie ou nitrato de prata (para situações de maior sensibilidade), que permite corar as proteínas e visualizar as suas posições no gel polimerizado. O azul de Comassie é um corante orgânico aniónico com uma estrutura em anel heterocíclico que se combina com as proteínas ligando-se a aminoácidos específicos num processo de fisissorção. Assim, o corante liga-se unicamente às cadeias polipeptídicas e não às moléculas do gel de poliacrilamida, permitido a visualização de bandas proteicas. Finalmente, a electroforese em gel de poliacrilamida tem diversas vantagens por ser rápido e sensível na análise de proteínas, no entanto torna-se uma técnica muito susceptível a erros experimentais e cuja interpretação dos resultados não é objectiva, dependendo obviamente do material de medição utilizado e da pessoa que analisa os dados. 3

4 Procedimento Material: Foi utilizado material comum de laboratório, tais como pipetas de precisão, tubos de Falcon com saia, tubos de Eppendorf, placas vidro e cerâmica, passadores e respectivos suportes. Procedimento experimental: Antes da preparação dos géis, montaram-se as placas de vidro e cerâmica, uma sobre a outra com dois passadores laterais, que definem a espessura do gel. Colocaram-se as placas (dois conjuntos no total) num suporte com prensas (com um creme vedante), com parafusos de pressão lateral que impediam que a mistura vertesse. Depois, iniciou-se a preparação dos géis: Primeiro, o gel de separação ou resolução, em que se juntou num tubo de Falcon com saia 2,5mL de solução Tampão de gel resolução (I), mais 4,15mL de solução de acrilamida, 3,30mL de água destilada, 16 L de TEMED e 66 L de sulfato de amónio (para radicalizar a mistura). Agitou-se para gerar os radicais livres e haver polimerização e despejou-se a mistura nas placas até ao risco vermelho (Fig.4). Colocou-se por cima 1mL de isopropanol, que nivela os líquidos, destrói as bolhas de ar e impede a difusão de O 2 para dentro do gel (O 2 é um inibidor da reacção de polimerização do gel). Enquanto o gel de separação polimerizava, visualizou-se a solução de resíduos proteicos nos tubos de Eppendorf, com azul de bromofenol (marca a posição das proteínas, migrando à sua frente) e SDS (detergente que desnatura e confere carga global negativa aos resíduos proteicos) que foram aquecidos para acelerar o processo de desnaturação (reacção exotérmica que explica o aquecimento dos tubos). Fig.3 Reagentes dos géis. Fig.4 - Marca vermelha até a qual se enche as placas de gel. Fig.5 Preparação do 2º gel. 4

5 De novo no gel de separação, verificou-se se este já estava solidificado e com papel absorvente limpouse o excesso não polimerizado. Por fim, colocou-se o Electroforese: pente entre as placas para definir a posição dos poços de migração. A seguir, preparou-se o gel de concentração, onde novamente num tubo de Falcon com saia se juntou 0,8mL de solução Tampão de gel de concentração (II), 8,8mL de solução de acrilamida, 2,4mL de água destilada, 8 L de TEMED e 24 L de persulfato de amónio (Fig.5). Por último, misturou-se e colocou-se o preparado nos poços criados no gel já polimerizado (Fig.6). Fig.6 Aplicação do 2º gel nas placas pelos pentes até ao topo. Preparou-se a solução tampão da electroforese com 25mL de solução tampão e 225mL de água destilada (Fig.7). Desmontaram-se as placas do suporte após a solidificação dos géis e colocaram-se na tina de electroforese (Fig.8). Colocou-se a solução tampão nas câmaras atrás de cada placa e na câmara electroforética comum. Por último, marcaram-se as bases dos poços que iriam ser utilizados. Depois de fervidas centrifugaram-se as amostras de resíduos proteicos e colocaram-se em gelo para não se degradarem. Com uma pipeta de 10 L colocaram-se as amostras em ambas as placas pela seguinte ordem: 1. Padrão de pesos moleculares (seis proteínas); 2. Proteínas totais de E.Coli; 3. Proteína A; 4. Proteína B; 5. Proteína B (Fig.6). Por fim, colocaram-se os eléctrodos e ligou-se a 150V durante aproximadamente 1 hora. Fig.7 Preparação da solução tampão da electroforese. Fig.8 - Colocação das amostras no gel com uma pipeta. 5

6 Findo o tempo necessário à migração das proteínas, verificou-se que esta não correra tal como planeada pois algo anómalo levou a uma migração irregular das moléculas (Fig.9). Retiraram-se os géis das placas, cortaram-se as partes superiores em excesso e colocaram-se numa solução de ácido acético e etanol com azul de Comassie. Levaram-se ao microondas durante 2 a 3 minutos a ferver para acelerar a coloração. Agitaram-se e enxaguaram-se em água destilada. De seguida colocouse numa solução descorante (Fig.10), a qual foi durante 1 minuto a ferver ao microondas para acelerar a reacção. Como o aparecimento das proteínas coloradas demora algum tempo, esperou-se até 2ª feira seguinte para verificar os resultados obtidos e proceder aos cálculos. Assim sendo, segunda-feira e sexta-feira seguintes verificaram-se novamente os géis, e viu-se que ainda apresentavam uma zona bastante corada que não possibilitava a distinção das proteínas migradas (Fig.12 e 13, página 10). Uma vez que os géis não possibilitavam a sua análise utilizámos um obtido num laboratório anterior para a realização da análise e cálculos. Fig.9 Placas de gel após a migração das proteínas (marcado com azul de bromofenol). Fig.10 Transferência dos géis da solução corante com azul de Comassie para as soluções descorantes sob a placa agitadora. 6

7 Resultados Experimentais Na preparação efectuada não foi possível identificar a migração das proteínas nem qualquer diferença entre estas, dadas as anomalias visíveis nas imagens (Fig.11 e 12). Por conseguinte, ambos os géis revelaram-se inutilizáveis. Fig.12 e 13 Resultados experimentais do laboratório 9 de Outubro 2009 (fotografias tiradas 6ª feira dia 16 de Outubro 2009). Contudo, a imagem abaixo (Fig.13) representa um dos géis preparados (por um turno de laboratório anterior ao nosso) no qual a migração proteica é facilmente visível. Fig.11 - Mobilidade electroforética das diferentes proteínas da amostra: 1 - Padrão de pesos moleculares; 2 e 3 Proteínas totais de E. Coli; 4 - Proteína A, de massa molecular desconhecida; 5 Proteína B, de massa molecular desconhecida. 7

8 Log 10 do Peso Molecular (kda) O extracto 4 apresenta um espectro de bandas proteicas estando duas delas mais expressas, o que não acontece com o extracto 5 que exibe uma única banda o que indica que a amostra 4 não sofreu um processo de purificação tão rigoroso como a amostra 5. Relativamente às proteínas totais de Escherichia Coli (2) é de notar que, tal como previsto, estas formaram um largo espectro de bandas proteicas, visto que a amostra continha grande parte das proteínas constituintes da referida bactéria. No poço com a amostra de padrões de pesos moleculares (1) formou-se um espectro proteico onde se destacam as seis bandas que indicam as seis proteínas padrão purificadas (Tabela 1). A tabela que se segue apresenta os valores teóricos do peso molecular das proteínas padrão, do respectivo logaritmo, e da distância percorrida pelas proteínas, determinada experimentalmente e medida em pixéis. Proteína Padrão Peso Molecular do Padrão (kda) Distância Percorrida (Px) Fosforilase B Albumina de Soro Bovino Ovalbumina Anidrase Carbónica Inibidor da Tripsina da Soja Lisozima Tabela 1 - Peso molecular, logaritmo do peso molecular e distância percorrida pelas proteínas padrão utilizadas. Tratando a imagem (fig. 11) de modo a obter-se a distância das proteínas à origem (em pixéis) e, posteriormente, inserindo esses valores na folha de cálculo obteve-se o gráfico (Gráfico 1) que relaciona linearmente o logaritmo do peso molecular em função da distância medida em pixéis. 2,5 2,0 1,5 1,0 Logaritmo do peso molecular em função da distância migrada 34; 1, ; 1, ; 1, ; 1, ; 1, ; 1, ; 1, ; 1,1803 Proteínas Padrão Amostra A Amostra B 0,5 0, Distância migrada pela proteína (Px) Equação de ajuste: y = -0,0061x + 2,199 R² = 0,9849 Gráfico 1 Logaritmo do peso molecular em função da distância migrada. 8

9 Cálculos A partir da equação da recta de regressão linear recta que melhor correlaciona os valores da distância migrada com os valores de Log(peso molecular) efectuaram-se os cálculos para determinar o peso molecular das proteínas A e B, substituindo-se em x a distância migrada (em pixéis) e obtendo-se em y o logaritmo do peso molecular. Finalmente, inverteu-se o logaritmo para se obter, então, o peso molecular (kda). Tomando a equação de ajuste, resultou: Amostra A Substituindo os valores de x pela distância percorrida pela proteína A (4, Fig.11) em pixéis obtemos, E por isso, o Peso Molecular A = 10 1,8086 = 64,358 kda. Amostra B Procedendo os mesmo cálculos para a proteína B (5, Fig.11) obtemos, Concluindo que, o Peso Molecular B = 10 1,1803 = 15,146 kda. Discussão Tal como referido anteriormente, o gel preparado não permitiu efectuar a análise desejada uma vez que apresentava uma barra azulada e distorcida que impedia a visualização das diferentes bandas e, consequentemente, a medição da distância percorrida. Embora as causas exactas desta anomalia sejam desconhecidas pensa-se que podem dever-se a bolhas de ar, alguma deficiência/desgaste nos eléctrodos ou mesmo imperfeições no gel, proporcionadas aquando da sua preparação. Através dos padrões de pesos moleculares dados e da distância migrada por estes, medida no gel, chegou-se à equação da recta que relaciona o logaritmo do peso molecular com a distância migrada, a qual permitiu inferir os pesos moleculares das proteínas A e B. Deste modo, analisando quer a imagem do gel (Fig.11) quer o gráfico construído (Gráfico 1), conclui-se que resíduos proteicos de menor massa percorrem uma maior distância. De notar, ainda, que quanto mais visível a banda, ou seja, mais larga, maior é a quantidade/expressão da proteína em questão na amostra estudada. Mediante da realização da experiência conclui-se que a técnica de Electroforese em Gel de SDS- Poliacrilamida é relativamente eficaz na separação de misturas proteicas complexas, de acordo com o seu peso molecular, de fácil realização e pouco demorada. No entanto, o tratamento dos dados é pouco preciso dependendo dos instrumentos de medida que se usa, o que também condiciona a identificação inequívoca das proteínas das amostras. Ou seja, é uma técnica propícia a erros acidentais na medição de distâncias, não só devido ao método utilizado, como também pelo facto das bandas serem irregulares e largas, sendo a distância ao topo da banda diferente da distância à base da mesma. Por último, esta técnica também tem como desvantagem não ser auto-suficiente, necessitando de complementação de diversas Cromatografias antes da electroforese. 9

10 Bibliografia Protocolos das Aulas Laboratoriais de Bioquímica e Biologia Molecular, 1º Semestre, 2008/2009; Arsénio Fialho, Leonilde Moreira, Álvaro Tavares, Jorge Leitão, Marília Mateus, Isabel Sá-Correia; Instituto Superior Técnico, página 2 a 8; Entender a Bioquímica (5.ªed), CAMPOS, Luís S., 2009, Escolar Editora, Lisboa, página 75 a 122; The Cell, a molecular approach (4ª Ed), G. M. Copper, R. E. Hausman, 2007, ASM Press-Sinauer- Associates Inc., Washington, D.C., página 52 a 57; visitado pela última vez em 12 de Outubro de 2009; visitado pela última vez em 19 de Outubro de