VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETERMINAÇÃO DE AMIDO EM SALSICHA VALIDATION OF ANALYTICAL METHODOLOGY FOR DETERMINATION OF STARCH IN SAUSAGE

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1 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETERMINAÇÃO DE AMIDO EM SALSICHA VALIDATION OF ANALYTICAL METHODOLOGY FOR DETERMINATION OF STARCH IN SAUSAGE RESUMO O objetivo deste trabalho consiste em validar a metodologia tradicional de determinação de amido pelo método de antrona em salsicha. No Brasil, esta metodologia é descrita pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Os testes realizados foram: linearidade e faixa de trabalho, limite de detecção e de quantificação, precisão e exatidão. A metodologia mostrou-se precisa, exata, linear na faixa de trabalho e apresentou limite de detecção e quantificação inferior ao limite máximo de % estabelecido no Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do MAPA. Pode-se considerar esta metodologia adequada para determinar a concentração de amido em salsicha. Leticia de Alencar Pereira Rodrigues * ; Gisele Vivas Tosta Aguiar Monteiro e Renata de Souza Guerreiro SENAI-CETIND *Correspondência: Palavras-chave: Amido. Validação. Salsicha. ABSTRACT The aim of this study was to validate the traditional methods of determining starch by the method of anthrone sausage. In Brazil, this methodology is described by the Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). The tests were performed: linearity and working range, detection limit and quantitation, precision and accuracy. The methodology proved to be accurate, precise, linear working range and the limit of detection and quantification below the maximum of % established in the Technical Regulation of Identity and Quality of MAPA. Considering the determination of the starch content in sausage was considered suitable. Keywords: Starch. Validation. Sausage. INTRODUÇÃO O amido é um importante polissacarídeo adicionado em produtos cárneos, havendo uma série de vantagens em sua utilização, como seu baixo custo, tecnologia conhecida e aceitabilidade por parte dos consumidores (NABESHIMA, 1998; WURLITZER; SILVA, 1995). O emprego industrial de amido se deve à sua característica única de poder ser usado diretamente na forma de grânulos, de grânulos intumescidos, na forma dispersa, como filme obtido da secagem de uma dispersão ou após extrusão, depois da conversão a uma mistura de oligossacarídeos ou a glucose, que pode ser isomerizada enzimaticamente para frutose. Dependendo do tipo, o amido pode, entre outras funções, facilitar o processamento, servir como espessante em sopas, caldos e molhos de carne, fornecer sólidos em suspensão e textura, ser ligante em embutidos de carne, estabilizante em molhos de salada ou ainda proteger os alimentos durante o processamento (CE- REDA, 00). O amido é obtido a partir de diversas fontes, principalmente cereais, raízes e tubérculos (PEDROSO e DE- MIATE, 008). A legislação brasileira permite, por meio da Instrução Normativa nº4 de 000 (BRASIL, 000), um teor máximo de % de amido em salsichas. O método de determinação de amido em produtos cárneos baseia-se na determinação espectrofotométrica a 60 nm do composto colorido formado pela reação entre a antrona e a glicose proveniente da hidrólise do amido (BRASIL, 1999).

2 É fundamental que os laboratórios disponham de meios e critérios objetivos para demonstrar, por meio da validação, que as metodologias de ensaio que executam conduzem a resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida (RIBANI et al, 004). A validação de métodos analíticos é o processo de estabelecimento de características de performance e limitações de um método bem como a identificação das influências que podem alterar estas características e em qual extensão (EU- RACHEM, 010). Segundo a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT NBR ISO/IEC 1705), a validação de métodos é dos requisitos técnicos para a garantia da qualidade de resultados analíticos. Um método analítico deve ser validado no momento seguinte ao seu desenvolvimento ou sempre que houver alterações na sua aplicação como, por exemplo, utilização do método para analisar matrizes diferentes (EURACHEM, 010). Os parâmetros analíticos normalmente encontrados para validação de métodos são: seletividade; linearidade e faixa de aplicação; precisão; exatidão; limite de detecção; limite de quantificação e robustez (RIBANI et al, 004). O laboratório, ao empregar métodos normalizados, necessita demonstrar que tem condições de operá-los de maneira adequada, dentro das condições específicas existentes nas suas instalações antes de implantá-los, não necessitando realizar os parâmetros referentes a seletividade, linearidade, faixa de trabalho e faixa linear e robustez (INMETRO, 010). Além do uso da validação e/ou das metodologias padronizadas, há outras medidas que devem ser seguidas, como: procedimentos eficazes de controle da qualidade interno (uso de materiais de referência, calibração de equipamentos, controle de documentos etc.); participação em testes de proficiência, e acreditação a um organismo internacional, normalmente NBR ISO/IEC 1705 (TAVERNIERS et al, 004). A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas através de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade está sendo cada vez mais reconhecida e exigida (RIBANI et al., 004). Assim, o objetivo deste trabalho foi validar uma metodologia oficial para quantificar o teor de amido em salsicha e determinar se o mesmo está adequado ao uso proposto. MATERIAL E MÉTODOS Material Para a determinação de amido foi utilizada uma amostra de salsicha adquirida em mercado local. O padrão utilizado foi amido p.a (SYNTH), pureza de 99,5%. O ensaio foi realizado em conformidade com os requisitos previstos na norma ABNT NBR ISO/IEC 1705 como, por exemplo, o uso de equipamentos, instrumentos e vidrarias calibrados na Rede Brasileira de Calibração RBC, controle rigoroso das condições ambientais e a validação de softwares para cálculo. Métodos A determinação de amido para produtos cárneos foi realizada em amostra de salsicha, segundo metodologia proposta por Brasil (1999). A amostra de salsicha foi previamente homogeneizada com o auxílio de um multiprocessador (Walita), em seguida foi transferido 0,5 g para tubo de centrífuga e efetuada a lavagem com três porções sucessivas de 5 ml de éter etílico seguidas de duas porções sucessivas de 5 ml de solução a 80 % (v/v) de álcool etílico à quente. Após a adição de cada alíquota de solvente, tudo foi agitado e centrifugado por 5 minutos a 1500 rpm. Após as lavagens, o resíduo foi seco em estufa a 105 C por 1 hora. Após este processo, adicionou-se 10 ml da solução de ácido sulfúrico 0,5 N e o tubo foi colocado em banho- -maria fervente, com o cuidado de manter o nível da solução contida no tubo abaixo do nível do banho. O aquecimento foi realizado durante 1 h. O nível da água do banho foi mantido na posição original e o conteúdo do tubo foi homogeneizado de maneira ocasional. Decorrido o tempo estabelecido, foi transferido quantitativamente o conteúdo do tubo para balão volumétrico de 500 ml e o volume foi completado com água. Após a homogeneização e decantação, ml do conteúdo do balão foram transferidos para tubo de ensaio previamente lavado com álcool etílico (a presença de sujeira ou poeira no tubo pode produzir resultados errôneos). Finalmente, adicionou-se 10 ml de solução de antrona e colocou-se em banho-maria fervente por 10 minutos. Em seguida, a cor desenvolvida foi lida em espectrofotômetro a 60 nm. A curva padrão foi realizada de maneira que as concentrações finais de glicose foi de 0, 50, 100, 150 e 00 µg de glicose/ ml. Execução experimental da validação Os métodos foram validados conforme descrito por Brasil (005), ABNT NBR ISO/IEC 1705 e EURACHEM (010). Os parâmetros avaliados foram: precisão (através do coeficiente de variação), exatidão (através da recuperação), limites de Detecção e Quantificação do Método LDM e LQM, linearidade e faixa de trabalho. Inicialmente a amostra de salsicha foi analisada em duplicata visando determinar o teor inicial do analito estudado. Exatidão A recuperação do analito foi estimada pela análise de amostras fortificadas com quantidades conhecidas do mesmo (adição de padrão ou spike); a concentração adicionada foi de 5 g/100 g. Foram preparadas 10 replicatas da mesma amostra e todas foram analisadas por um mesmo analista, em um curto espaço de tempo e utilizando os mesmos equipamentos. 3

3 O cálculo foi realizado conforme Equação 1: C1 C R(%) = 100 (1) C3 R = Recuperação C1 = Concentração do analito na amostra fortificada C = concentração do analito na amostra não fortificada C3 = concentração do analito adicionada à amostra fortificada Precisão Limite de repetitividade (r) Normalmente determinada para circunstâncias específicas de medição, as três formas mais comuns de expressá-la são: por meio da repetitividade, precisão intermediária e da reprodutibilidade, sendo usualmente expressas pelo desvio padrão e coeficiente de variação. A partir do desvio-padrão dos resultados dos ensaios sob condição de repetitividade, o limite de repetitividade (r) foi calculado conforme Equação, o que capacita o analista a decidir se a diferença entre análises realizadas é significante: r = t s s = Desvio-padrão da amostra t = Distribuição de Student, dependente do tamanho da amostra e do grau de confiança Limite de reprodutibilidade (R) Segundo o INMETRO (010), embora a reprodutibilidade não seja um componente de validação de método executado por um único laboratório, é considerada importante quando um laboratório busca a verificação do desempenho dos seus métodos em relação aos dados de validação obtidos por meio de comparação interlaboratorial. O parâmetro reprodutibilidade foi avaliado através da participação do laboratório em um Programa de Ensaios de Proficiência PEP (SENAI-SC) utilizando o método avaliado na execução da análise de amostra do programa. A amostra analisada nesta avaliação foi de matriz úmida a base de carne. O limite de reprodutibilidade foi calculado conforme Equação 3: r = t s (3) R t = Distribuição de Student, dependente do tamanho da amostra e do grau de confiança S R = Desvio-padrão associado aos resultados de todos os laboratórios () S lab = Média das variâncias dos resultados de cada laboratório. S r = Variância das médias dos laboratórios Limites de Detecção e Quantificação do Método LDM e LQM O LDM foi determinado pela análise do branco (todos os reagentes utilizados na análise sem a adição do analito) com 10 repetições ou replicatas, sendo calculados a média e o desvio padrão. No lugar da amostra adicionou-se água grau III conforme INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STAN- DARDIZATION (1987). O LDM foi calculado pela média dos brancos mais três vezes o desvio padrão. X = Média dos valores dos brancos da amostra s = Desvio-padrão amostral dos brancos da amostra Para a determinação do Limite de Quantificação (LQM) (Equação 5), foi calculado pela média dos brancos mais dez vezes o desvio padrão. Linearidade e faixa de trabalho A faixa de trabalho e a linearidade foram determinadas de acordo com especificações do INMETRO (010). Para o cálculo da faixa de trabalho foi construída uma curva utilizando- -se solução padrão de amido em quatro níveis de calibração (0, 50, 100, 150 e 00 µg de glicose/ ml). Estes níveis foram utilizados conforme definido no próprio método oficial. A linearidade do método foi determinada a partir da curva da faixa de trabalho e calculada a partir da equação da regressão linear (Equação 6). y = Resposta medida x = Concentração a = Inclinação da curva de calibração (sensibilidade) b = Interseção com o eixo y Tratamento estatístico R lab S = S + S Os dados relativos à exatidão, repetitividade, LDM e LQM foram lançados no software LABWIN-LIMS (LABWIN) para cálculo e obtenção dos resultados apresentados neste tra- r LDM = X + 3 s LQM = X + 10 s y = ax + b (4) (5) (6) 4

4 balho. O software em questão utiliza as equações e métodos de cálculo descritos por EURACHEM (010) e pelo INMETRO (010). O tratamento estatístico realizado por este software inclui o teste de Dixon, que tem como objetivo a eliminação de valores aberrantes. RESULTADOS E DISCUSSÃO Linearidade e faixa de trabalho Os resultados da faixa de trabalho estão indicados na Figura 1. A equação da reta obtida foi y = 0,0044x + 0,0059. O método demonstrou uma boa linearidade, R = 0,9987, na medida em que, segundo a FDA (007), o critério mínimo aceitável para o coeficiente de correlação linear deve ser maior ou igual a 0,995. Brasil (003) recomenda um coeficiente de correlação mínimo igual a 0,99. Absorbância 1 y= 0,0044x + 0,0059 0,9 R = 0,9987 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, 0, Concentração de amido (µg/ml) Figura 1. Linearidade e faixa de trabalho para o método de determinação de amido trico para quantificação do aminoácido hidroxiprolina em conservas de carnes e encontrou coeficientes de correlação de 0,9991. Nestas pesquisas, evidenciou-se uma linearidade compatível dos métodos espectrofotométricos com os critérios do FDA (007) e Brasil (003), assim como o presente trabalho de quantificação de amido. Pinho et al. (000), na quantificação de antioxidantes sintéticos em patês de fígado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando-se uma curva de calibração com 5 níveis de concentração, obtiveram uma linearidade superior a 0,99. Precisão, Exatidão, LDM e LQM A precisão na faixa de trabalho é apresentada na forma de repetitividade e reprodutibilidade (Tabela 1) sendo avaliado o desvio padrão dos resultados obtidos. Não foram encontrados valores de referência para a repetitividade e a reprodutibilidade deste método, no entanto, o conhecimento destes valores permite que a incerteza do método seja estimada sempre que for necessário, garantindo assim maior segurança na tomada de decisões, sejam elas legais ou destinadas ao controle de processo. Os resultados da recuperação do analito em amostra fortificada com solução padrão de amido estão apresentados na Tabela 1. Foi obtida uma recuperação de 109,3%, resultado de acordo com o FDA (007), que define como limites para recuperação do analito de 80% a 10%. Segundo GARP (1999), os intervalos aceitáveis de recuperação para análise de resíduos geralmente estão entre 70% e 10%, com precisão de até ± 0%. Porém, dependendo da complexidade analítica e da amostra, este valor pode ser de 50% a 10%, com precisão de até ± 15%. Tabela 1. Resultados da exatidão e precisão do método, expressos em limite de repetitividade, limite de reprodutibilidade, recuperação, LDM e LQM A estimativa desse coeficiente assegura a qualidade da curva obtida, pois valores próximos a um indicam uma menor dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor incerteza dos coeficientes de regressão estimados (RIBANI et al., 004). Vale ressaltar que, a linearidade dos resultados da metodologia na faixa de trabalho não depende apenas da sensibilidade do equipamento utilizado, mas também de outros fatores como reagentes utilizados, etapa de extração do analito, condições do equipamento e vidrarias utilizadas e capacitação do analista. Pereira et al. (008), na quantificação de glicose em amostras de batata utilizando um método enzimático com determinação espectrofotométrica, encontraram coeficientes de correlação das curvas de adição de padrão contendo ou não a matriz da amostra de 0,9981 e 0,9944, respectivamente, com 7 níveis de concentração. Della Torre et al. (004) efetuaram a validação do método espectrofotomé- Parâmetros de validação Limite de repetitividade (g/100 g) Limite de reprodutibilidade (g/100g) Recuperação Média (%) LDM (g/100g) LQM (g/100g) Resultados 1,60 0,7 109,3 0,39 1,1 O método avaliado apresenta limite de detecção e quantificação inferior ao limite máximo estabelecido no Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do MAPA para salsicha (Brasil, 000), estando assim de acordo com o propósito de aplicação do mesmo. A exatidão do método está de acordo também com o estabelecido na Comunidade Europeia (00), mesmo considerando o rigor desta norma, que é voltada à detecção e quantificação de contaminantes em alimentos. A mesma estabelece uma recuperação na faixa de 90% a 110% para que o método seja considerado exato. 5

5 CONCLUSÕES O método avaliado está adequado à análise de salsicha, pois apresenta exatidão, linearidade na faixa de trabalho, capacidade de detecção, quantificação satisfatória e adequação ao uso proposto. Além disso, o conhecimento da dimensão dos parâmetros associados à precisão e à exatidão agrega confiabilidade aos resultados emitidos a partir do uso do método analítico. R e f e r ê n c i a s Associação Brasileira de Normas Técnicas. ABNT NBR ISO/IEC 1705: Requisitos Gerais para competência de laboratórios de ensaio e calibração. Rio de Janeiro, 005. Associação Grupo de Analistas de Resíduos de Pesticidas (GARP); Manual de Resíduos de Pesticidas em Alimentos (apostila), BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução nº 899, de 9 de maio de 003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, 0 de junho de 003. BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade de Carne Mecanicamente Separada, de Mortadela, de Lingüiça e de Salsicha. Diário Oficial da União, Brasília, 05 de abril de 000. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa nº 4, de 08 de set. de 005. Aprova o Manual Operacional de Bebidas e Vinagres. Diário Oficial da Republica Federativa do Brasil. Diário Oficial da União. Brasília, DF, 9 set Seção 1, p.11. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa nº 0, de 1 de jul. de Oficializa os Métodos Analíticos Físico-Químicos, para Controle de Produtos Cárneos e seus Ingredientes - Sal e Salmoura. Diário Oficial da União. Brasília, DF, 7 jul Seção 1, p.10. CEREDA, M. P. Propriedades gerais do amido. São Paulo, Fundação Cargill, 1 p. (Série: Culturas de Tuberosas Amiláceas Latino-americanas, v. 1), 00. COMUNIDADES EUROPEIAS. Comissão das Comunidades Europeias. Conselho. Directiva 657, de 00. Da execução ao disposto na Directiva 96/3/CE do Conselho relativamente ao desempenho de métodos analíticos e à interpretação de resultados. Jornal Oficial das Comunidades Europeias. Bruxelas, 17 ago. 00. L1. p DELLA TORRE, J. C. M; LICHTIG, J.; BERAQUET, N. J. Validação do método espectrofotométrico para quantificação do aminoácido hidroxiprolina em conservas de carnes. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v. 63, n. 1, p.35-4, 004. EURACHEM. The fitness for purpose of analytical methods: A laboratory guide to method validation and related topics. Teddington Disponível em: <http:// Acesso em: 3 out FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. Ora Laboratory Procedure. Methods, method verification. Rockville, 003. Disponível em: <http://web.ora.fda.gov/dfs/policies/manuals/default.html>. Acesso em: 0 de out FREITAS, S. T. Otimização e validação de um método enzimático para a determinação de glicose em tubérculos de batata. Ciência Rural, v.38, n.5, ago, 008. INMETRO. Orientação sobre validação de métodos analíticos. DOQ-CGCRE-008 Revisão 03. Fev Disponível em: <http://www.inmetro.gov.br/sidoq/arquivos/cgcre/doq/doq-cgcre-8_03.pdf > Acesso em: 31 julho 010. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. ISO/DIN 3696: International Organization for Standardization specification for water for laboratory use. Suíça, NABESHIMA, H. E. Amidos modificados em produtos cárneos de baixo teor de gordura. Higiene Alimentar, São Paulo, v. 1, n. 54, p , PEDROSO, R. A.; DEMIATE, I. M. Avaliação da influência de amido e carragena nas características físico-químicas e sensoriais de presunto cozido de peru. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 8, n. 1, p. 4-31, 008. PEREIRA, E. I. P.; EMANUELLI, T.; BISOGNIN, D. A.; RIBANI, M. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, v. 7, n. 5, p , 004. PINHO, O. et al. Quantification of synthetic phenolic antioxidants in liver pates. Food Chemistry, v. 68, n. 1, p , 000. RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, V. 7, N. 5, p , 004. TAVERNIERS, I.; LOOSE, M. D.; BOCKSTAELE, E. V. Trends in quality in the analytical laboratory, II. Analitical method validation and quality assurance. Trends in Analytical Chemistry, v. 3, n. 8, p , 004. WURLITZER, N. J.; SILVA, A. T. Uso de farinhas de arroz como substituto de féculas de mandioca em apresuntado. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 15, n., p ,

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