APLICAÇÃO E TESTES DO MÉTODO APHA-4500-NO3-C PARA DETERMINAÇÃO DE NITRATOS EM ÁGUAS POR LEITURA EM UV COM SEGUNDA-DERIVADA

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1 APLICAÇÃO E TESTES DO MÉTODO APHA-5-NO-C PARA DETERMINAÇÃO DE NITRATOS EM ÁGUAS POR LEITURA EM UV COM SEGUNDA-DERIVADA Fernando Mota de Oliveira Correspondência Rua das Codornas,, ap-66, Imbuí, Salvador-BA, CEP Resumo Até a a. edição do manual de Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater o único método de Nitrato por UV (5-NO-B) era por leitura em um único comprimento de onda (nm) e considerado de Screening (teste de verificação da presença) por sofrer interferências facilmente, especialmente de matéria orgânica. Na a. edição o método por UV com segunda-derivada foi incluído como método proposto uma vez que diversas interferências do método por leitura direta já não ocorriam. Neste trabalho adaptamos o método para que possa ser usado em qualquer espectrofotômetro com capacidade de leitura na região UV, testamos as principais possíveis interferências e detalhamos a execução do método. Summary Until the th edition of the Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, the single Nitrate analytical method by UV (5-NO-B) was in single reading at nm an called Screening method with known interferences, specially from organic matter. In the st edition, a Nitrate analytical method by UV readings with second-derivative was found as a Proposed Method once many interferences of the direct reading at UV no more occurred. In this work we adapted this method in a way it may be used in any spectrophotometer that can read in the UV region, we tested the main possible interferences and the execution of the method was detailed. Introdução Os nitratos absorvem fortemente na região ultravioleta (UV), mas a leitura em único comprimento de onda não é viável porque a matéria orgânica natural e outros compostos solúveis também absorvem radiação nesta região do espectro. No entanto o espectro (Figura-) dos nitratos mostra uma curva com inflexão na região de nm, o que não ocorre com outros compostos. Desta forma, trabalhar com a segunda-derivada ao invés de absorbância é o que permite que se obtenha um método adequado. Figura. Curva de Absorbância de uma solução com mg/l de N-NO Os Nitritos também absorvem na região ultra-violeta, mas geralmente apresentam-se em teores bem mais baixos. Os bicarbonatos absorvem abaixo de nm, mas não afetam a segunda-derivada dos Nitratos. Os brometos interferem em teores típicos de água do mar (68mg/L, salinidade 5%o) de modo que o método não se aplica a águas do mar. Os testes que fizemos neste trabalho comprovam a amplitude desta

2 interferência. O método original descreve que Ferro e Cobre interferem seriamente na faixa de mg/l o que é algo extremamente raro de ocorrer. O método foi testado em águas potáveis e a viabilidade para o uso em efluentes e esgotos não foi testada. Os testes que fizemos em água de uma lagoa relativamente poluída mostraram viabilidade do método nesta matriz. A forma como fizemos o teste de interferência (Seletividade/Especificidade ) pode ser aplicado em outras matrizes. O método original requer que o espectrofotômetro possa calcular segunda-derivada através do software original ou através de uma interface computadorizada, o que não é viável para muitos laboratórios. Fizemos uma adequação do método realizando a leitura em comprimentos de onda e um cálculo simples de segunda derivada, da mesma forma que se encontra o ponto de inflexão em curva de titulação eletrométrica ao se utilizar aparelho não computadorizado. Os seguintes testes foram feitos: a) Calibração: Preparo de curva analítica em água ultra-pura. b) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água do mar diluída vezes. c) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água de lagoa. d) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água tratada. e) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água tratada com adição de Matéria orgânica. f) Especificidade/Seletividade : Adição de Padrão (Spike) em água tratada com adição de Bicarbonato g) Validação : Repetitividade e %Recuperação do método a mg/l. h) Validação : Limites de Detecção e Quantificação do método. Os testes preliminares foram feitos em um espectrofotômetro FEMTO 7 Plus sem interface computadorizada, com bons resultados, e concluídos em um espectrofotômetro VARIAN Cary 5E, que embora seja computadorizado, com capacidade de cálculos de segunda-derivada e com feixe duplo foi utilizado com leituras simples em feixe simples. O uso de equipamentos diferentes ocorreu apenas em função de disponibilidade dos equipamentos e também serviu para mostrar a viabilidade do método em instrumentos bem diferentes. Descrição do Método Analítico Reagentes a) Solução estoque de Nitrato a mg/l de N-NO (a) b) Água destilada, ultra-pura ou isenta de nitratos. (a) Atenção: O comum é que o padrão e as amostras sejam calculados como N-NO (Nitrogênio) ao invés de NO (Nitrato). Aparelhagem a) Espectrofotômetro capaz de fazer leituras em nm, nm e nm. b) cubetas casadas, ou de mesma origem, de quartzo com mm de caminho ótico. Opcionalmente usar somente uma (b) c) Aparelhagem para filtração de amostras. (b) Cubetas de vidro causam interferência na região UV, sendo inviável o uso. Normalmente as cubetas de Quartzo são marcadas como QS e as de vidro como GS. O uso de apenas uma cubeta aumenta o trabalho das leituras. Procedimento a) As amostras podem ser preservadas por adição de ácido sulfúrico ou de ácido clorídrico caso não venham a ser lidas dentro de 8 horas. Para mais detalhes de preservação para diversos parâmetros ver o capítulo do manual Standard Methods a este respeito. b) Amostras que apresentem turbidez devem ser previamente filtradas. c) Encha uma cubeta com água destilada e uma com Amostra ou Padrão (c). d) Ajuste o espectrofotômetro a nm, zere com água e anote a absorbância da amostra ou padrão. d) Repita o item anterior a nm e nm sempre zerando com a cubeta com água antes de cada leitura. e) Tabele os resultados e calcule a segunda-derivada como (Abs - Abs) - (Abs - Abs) f) Para as amostras, calcule os teores com base na equação da curva analítica. (c) Tendo-se uma única cubeta

3 a) Encha a cubeta de água, ajuste a nm e zere o instrumento. b) Leia (sem zerar) as absorbâncias da água a nm e nm anotando. c) Ainda sem zerar leia as absorbâncias das amostras ou padrões a nm, nm e nm subtraindo das leituras da prova em branco as leituras a nm e nm. Curva Analítica A curva analítica deve ser feita por leitura de padrões de N-NO a,5mg/l;,mg/l;,mg/l e, mg/l obtidos por diluição da solução estoque a mg/l de N-NO. Os pontos de calibração podem ser modificados se o aparelho em uso apresentar linearidade apenas até, mg/l, que é o recomendado no método original. Considerando concentração no eixo Y e a. derivada no eixo X (d) obtenha a curva: mg/l N-NO = a. derivada X Inclinação + Intercepto (d) Embora a estatística recomende a concentração no eixo X, o químico analista perceberá facilmente várias vantagens de se plotar a concentração no eixo Y, especialmente ao tratar coisas como limite de detecção e incerteza da curva analítica. Exemplo de Curva Analítica A Tabela mostra um exemplo de preparo de curva analítica. Abs Abs Abs a. Derivada Concentração,89,6,9,96,5,5778,67,597,,,6,56,5,6,,968,,55,65, Inclinação 8,7 Intercepto, correlação,9999 Tabela. Exemplo de Dados para curva analítica mg/l N-NO = a. derivada X 8,7 +, Os valores foram tratados em Excel, considerando a concentração como Y e a segunda derivada como X. Foram usadas as funções do Excel Inclinação, Intercepção e Correl, respectivamente. Validação do Método Repetitividade e % Recuperação Uma água tratada contendo,mg/l de Nitratos teve adição de mais mg/l, totalizando,mg/l de N- NO. A mesma foi analisada por um mesmo analista no mesmo instrumento. A Tabela mostra os resultados. Resultado,8 Resultado, Resultado, Resultado,7 Resultado 5, Resultado 6, Resultado 7,6 Resultado 8,6 Resultado 9, Resultado,5 Média,5 Desvio Padrão, Repetitividade (D. Padrão x,77),6

4 Coeficiente de Variância (%CV), %Recuperação 96 Tabela. Resultados dos testes de Repetitividade Limites de Detecção e Quantificação Observando que a curva analítica tem grande influência neste método analítico escolhemos o método Houbax & Vox para determinação do Limite de Detecção. A leitura de provas em branco poderia ser uma boa alternativa também. Foram preparados padrões de,mg/l, padrões de,mg/l e padrões de,mg/l com os quais se preparou uma curva analítica com dados próximos do limite de detecção esperado (,mg/l). A curva foi obtida com ajuda do Excel (plotando concentração como Y) como mostra a Figura. Os valores de intercepto, inclinação e correlação também foram obtidos diretamente com funções do Excel. O cálculo de RSD (Residues Standard Deviation ou Desvio Padrão dos Resíduos) foi obtido comparando os valores de concentrações calculadas contra concentrações reais. A Tabela mostra os dados usados para o cálculo de RSD e LD. Observar que o RSD representa a incerteza da curva analítica. Abs Abs Abs a. Deriv. Conc. (ycalc-yrreal),7,9,7,,,7,78,8,79,,,,66,7,6,,,,7,6,,59,,89,,65,5,5,,5,,67,9,6,,8,659,6,69,6,,9,67,,88,7,,,6,,6,9,, Soma D =Soma de (ycalc-yrreal) Soma D =>,8 Conc. = a. Deriv. * 5,9 +,7 RSD =Raiz (Soma D / (n-)) RSD,7 LD = *,7 +,7 LD,9 LQ = *,7 +,7 LQ, Tabela. Dados para cálculo de RSD e LD,5 N-NO: Determinação LD via Houbax/Vox - mg/l N-NO e a Derivada,,5,,5,,5,5,,5,,5,,5,,5,5 Figura. Curva analítica dos dados para cálculo de LD e LQ Seletividade/Especificidade

5 Uma das formas mais utilizadas para caracterizar interferências é pela comparação da curva analítica obtida na padronização, normalmente por adição de padrão em água ultra-pura ou destilada, com curvas obtidas por adição de padrão em matrizes possivelmente interferentes. O manual de Standard Methods define que se houver uma variação superior a % no valor de inclinação da curva preparada com a matriz em teste deve-se considerar que a matriz causa interferência. Não acreditamos que estes testes possam garantir absolutamente ocorrência ou não de interferência em todos os casos, uma vez que interferência costuma ser algo imprevisível algumas vezes. Mas é um teste bastante válido para a maioria dos casos. Uma rotina de Controle da Qualidade Analítica com uma certa freqüência com adição de padrão em matrizes suspeitas complementa a garantia dos resultados. Fizemos os testes para validação do método em algumas matrizes suspeitas por comparativo das respectivas curvas analíticas com a curva analítica da padronização do instrumento, preparada com água ultra-purificada. As Figuras a 8, que seguem são auto-instrutivas. Observar que todos os testes, inclusive a calibração, foram feitos por adição,5mg/l; mg/l, mg/l, mg/l e mg/l. Os teores originais obtidos pelas análises das respectivas matrizes foram somados a estes valores para lançamento nos gráficos.,5 Curva Analítica: mg/l N-NO e a. Derivada y = 8,5x +,8 R =,999,5,5,5,,5,,5,,5,,5,5 Figura. Curva analítica preparada em água ultra-pura,5 Adição de Padrão em água do mar: mg/l N-NO e a. Derivada y = 7,5x -,5 R =,99,5,5,,,,,,5,6,7,8 Figura. Curva obtida por adição de padrão em água do mar diluída vezes.

6 Adição de Padrão em água de lagoa: mg/l N-NO e a. Derivada,5 y = 8,55x -,86 R =,995,5,5,,,,,,5,6 Figura 5. Curva obtida por adição de padrão em água de lagoa Adição de Padrão em Água Tratada: mg/l N-NO e a. Derivada,5 y = 7,978x +, R =,995,5,5,,,,,,5,6 Figura 6. Curva obtida por adição de padrão em água tratada

7 Adição de mg/l M.O. em água tratada: N-NO mg/l e a. derivada 5 y = 8,5x +,9 R =,999,5,5,5,,,,,,5,6 Figura 7. Curva obtida por adição de padrão em água tratada que sofreu adição de mg/l de Matéria Orgânica proveniente de Leite de vaca (gordura, proteínas, carbohidratos, etc.) Adição de mg/l Bicarbonato em água tratada: N-NO mg/l e a. derivada 5 y = 9,6x +,77 R =,999,5,5,5,,5,,5,,5,,5,,5,5 Figura 8. Curva obtida por adição de padrão em água tratada que sofreu adição de mais mg/l de Bicarbonato de Sódio

8 Resultados da validação Desvio Padrão da Repetitividade a mg/l em água, mg/l tratada Coeficiente de Variância a mg/l, % (*) Repetitividade a mg/l (k=,77),6 mg/l %Recuperação a mg/l 96 % Linearidade e faixa de trabalho Testado até mg/l com um bom valor de r (,999). O manual de Standard Methods recomenda valores de pelo menos,995, se não for definido um valor no método. Limite de Detecção,9 mg/l Limite de Quantificação, mg/l Sensibilidade Inclinação da curva analítica 8,5 Interferências em água do mar diluída vezes Inclinação da curva 7,5. Variação de %, que indica interferência, apesar da diluição. O intercepto muito negativo (-,5) também indica problemas. Interferências em água de lagoa Inclinação da curva 8,6. Variação de,6% que indica ausência de interferência. Interferências em água tratada Inclinação da curva 7,98. Variação de 5,6% que indica ausência de interferência. Interferências em água tratada com mg/l de Matéria Inclinação da curva 8,5. Variação de,7% que Orgânica (de leite de vaca) indica ausência de interferência. Interferências em água tratada com adição de mais Inclinação da curva 9,6. Variação de 9,6% que mg/l de Bicarbonato de Sódio indica ausência de interferência, apesar do elevado teor adicionado de Bicarbonato. (*) O método cita em precision and bias que a diferença entre o método por Cromatografia a líquido e este método foi de,5mg/l na faixa de concentração de mg/l, ou seja %. Consideramos os valores obtidos compatíveis com o citado no método original. Infelizmente o método não cita valores de repetitividade nem de %Recuperação, LD, LQ, etc. Conclusões O método de Nitrato por UV com Segunda derivada mostrou-se um método de fácil aplicação, de execução fácil, sem qualquer gasto de reagentes e aplicável às matrizes mais comuns (água tratada e água bruta) para análises em laboratórios prestadores de serviços. Comparando-o com o método da coluna de Cádmio percebe-se uma grande vantagem de custos de materiais e de tempo de ocupação dos Analistas. Comparando-o com métodos de kits as principais vantagens são o fato de ser um método oficial e não ter gastos de reagentes. O principal requisito para a sua aplicação é ter um espectrofotômetro com capacidade de leitura na região UV. Com as adaptações que aqui fizemos fica dispensado que o instrumento tenha uma interface computadorizada. ) APHA / AWWA / WEF: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, st. Ed., USA, APHA, 6. ) APHA / AWWA / WEF: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, th. Ed., USA, APHA, 998. ) Hubaux, A. and Vox, G.: Decision and detection limits for linear calibration curves, Analytical Chemistry, (97). ) EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical Methods; A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM, First Internet version, December 998, First English Edition. 998; 5) Miller, J. C. and Miller, J. N.: Statistics for Analytical Chemistry, second edition, Ellis Horwood Ltd, London, 99, pp ) Oliveira, Fernando M.: Guia do Usuário do Software LABWIN-CQA. Labwin Ltda, Revisão de /6/.

9 Agradecimentos a) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia, FAPESB b) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química c) Nossa estagiária Ivanice Ferreira dos Santos

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