IV Seminário de Iniciação Científica

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1 METODOLOGIA QUIMIOMÉTRICA PARA A DETERMINAÇÃO DIRETA DE PROPRANOLOL EM URINA POR ESPECTROFLUORIMETRIA Lucas C. Silva 1,3, Marcello G. Trevisan 4, Ronei J. Poppi 4, Marcelo M. Sena 2,3 1 Voluntário Iniciação Científica PVIC/UEG 2 Pesquisador - Orientador 3 Curso de Química Industrial, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, UEG 4 Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas/SP RESUMO Neste trabalho, uma metodologia quimiométrica, baseada na combinação do método PARAFAC com o método da adição padrão, permitiu a determinação direta do β- bloqueador propanolol (PRO) em amostras de urina por espectrofluorimetria, sem a necessidade de etapas de extração. Foram analisadas amostras de cinco indivíduos artificialmente contaminadas, na faixa de concentração de PRO entre 10,0 e 20,0 µg ml -1, e os erros de previsão variaram entre 0,8 e 14,3 %, em módulo. Palavras-Chave: PARAFAC; método da adição padrão; vantagem de segunda ordem. Introdução O propranolol (PRO, Parfitt, 1991) é um β- bloqueador não seletivo usado no tratamento de hipertensão e arritmias cardíacas. Sua estrutura molecular é mostrada na Figura 1. Ele também pode ser usado como redutor de freqüência cardíaca e força de contração em atividades esportivas, e por isso, está na lista de substâncias proibidas do Comitê Olímpico Internacional (COI). Daí, o interesse na determinação de PRO em urina. Figura 1. Estrutura molecular do PRO A determinação espectrofluorimétrica direta de PRO é impedida devido à presença de interferentes naturais fluorescentes na urina. Além disso, o efeito de supressão do sinal 492

2 (quenching) causado por esses interferentes (que varia de indivíduo para indivíduo) impede a construção de uma curva de calibração que possa ser generalizada para diferentes indivíduos. O objetivo deste trabalho é a determinação direta de PRO em urina usando a vantagem de segunda ordem, definida como a habilidade realizar uma determinação na presença de interferentes desconhecidos (Booksh & Kowalski, 1994), possibilitada pelo método quimiométrico de ordem superior (multidimensional) PARAFAC (Parallel Factor Analysis, Bro, 1997). Esta estratégia, que já foi aplicada na determinação de fármacos em plasma humano (Sena et al., 2005, 2006), combina o uso do PARAFAC, para a extração do sinal analítico puro, com o método da adição padrão, para a quantificação na presença de um forte efeito de matriz. Materiais e Métodos Cinco amostras de urina de homens saudáveis, em jejum e que não consumiram qualquer medicamento nas últimas duas semanas, foram obtidas durante o período da manhã. Essas amostras foram contaminadas artificialmente com uma solução padrão de PRO, resultando em concentrações de 10,0, 12,0, 13,0, 15,0 e 20 µg ml -1. Antes de cada medida, as amostras foram diluídas 100 vezes. Quatro adições de 30 µl de solução padrão de PRO 1,0 µg ml -1 foram realizadas em cada amostra, sequencialmente; após cada adição e homogeneização, a superfície espectral era obtida. Todas as análises foram feitas em triplicata. As superfícies espectrais foram obtidas em um espectrofluorímetro Perkin Elmer LS55, nas dependências do Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (IQ- UNICAMP), em uma faixa de excitação de 230 a 300 nm (passo 10 nm) e em uma faixa de emissão de 300 a 450 nm (passo 0,5 nm). Os dados foram tratados no programa MATLAB, versão 6.1 (The Mathworks, Natick: EUA), usando o pacote The N-way Toolbox for MATLAB (Andersson & Bro,2000), versão Resultados e Discussão A faixa de emissão abaixo de 330 nm foi eliminada devido à presença do espalhamento Rayleigh. O espalhamento Rayleigh é um fenômeno comum na espectrofluorimetria que ocorre quando o comprimento de onda de emissão é igual ao de excitação, levando a perda de trilinearidade dos dados e impossibilitando a modelagem pelo 493

3 PARAFAC, um modelo trilinear (Andersson & Bro, 2003). O exemplo de uma das superfícies espectrais obtidas é apresentado na Figura 2. Figura 2. Superfície de excitação-emissão de uma amostra de urina dopada com 10,0 µg ml -1 de PRO Um modelo PARAFAC específico foi construído para cada amostra, a partir de arranjos de dados tridimensionais formados por 240 comprimentos de onda de emissão, oito comprimentos de onda de excitação e cinco medidas (amostra sem adição mais quatro adições). Os melhores modelos foram selecionados com três fatores e restrição de não negatividade nas dimensões dos dados correspondentes aos espectros de emissão e de excitação. Esses modelos explicaram, no mínimo, 99,87 % da variância total dos dados. Os pesos (loadings) obtidos na deconvolução espectral usando o modelo PARAFAC foram atribuídos ao PRO e a dois padrões de interferentes (background). Os espectros de excitação e de emissão obtidos na deconvolução são mostrados nas Figuras 3 e 4, respectivamente. 494

4 Figura 3. Espectros de excitação, deconvoluídos através dos pesos de um modelo PARAFAC, para uma das amostras de urina analisadas. [PRO] = 10,0 µg ml -1 Figura 4. Espectros de emissão, deconvoluídos através dos pesos de um modelo PARAFAC, para uma das amostras de urina analisadas. [PRO] = 10,0 µg ml -1 Os escores obtidos com o PARAFAC são proporcionais à composição das espécies fluorescentes nas amostras. Os escores relativos ao PRO foram usados no método da adição padrão, em uma regressão linear univariada. As determinações foram feitas em uma situação de volume total variável em função da adição do padrão e os cálculos foram feitos de acordo com Bader (1980). Um aspecto a ser destacado na metodologia proposta é que os pesos do modelo PARAFAC equivalem ao sinal filtrado da espécie de interesse, livre do sinal dos interferentes. 495

5 Todas as curvas de adição padrão apresentaram coeficientes de correlação superiores a 0,9985. Uma das curvas de adição padrão obtidas é mostrada na Figura 5. Os resultados para a determinação de cada amostra apresentaram erros de previsão entre 0,8 e 14,3 %, em módulo. Esses resultados são mostrados na Tabela 1. Figura 5. Reta de adição padrão para uma das amostras de urina 10,0 µg ml -1 em PRO Tabela 1. Resultados para a determinação de PRO em urina usando PARAFAC e adição padrão Quantidade adicionada (µg/ml) Quantidade prevista (µg/ml) a Erro de previsão (%) 10,00 10,18 ± 0,57 0,8 12,00 11,17 ± 0,81-6,9 13,00 13,25 ± 0,31 1,9 15,00 15,84 ± 1,30 5,6 20,00 17,14 ± 3,41-14,3 a Valores médios e desvios padrão de três determinações Conclusões Os resultados demonstraram que o método proposto foi capaz de determinar PRO em urina, sem a necessidade do uso de etapas de separação, ou seja, com um mínimo de 496

6 manipulação da amostra. As potenciais vantagens dessa determinação, tais como rapidez e baixo custo, poderiam ser ainda ampliadas, considerando a possibilidade de automação do método proposto. A determinação poderia ser realizada em menor escala, os erros de manipulação poderiam ser diminuídos e o tempo de análise otimizado. Este trabalho representou um exemplo interessante de aplicação da vantagem de segunda ordem. Mais do que a determinação específica de PRO em urina, este tipo de metodologia pode ser aplicado na determinação de espécies fluorescentes em matrizes complexas de interesse clínico, tais como soro e plasma. Além disso, esta alternativa poderia ser aplicada também a outros tipos de matrizes, tais como alimentos, plantas, solos, etc. Agradecimentos Aos voluntários que cederam as amostras de urina. Referências - Andersson, C. A.; Bro, R Chemom. Intell. Lab. Syst. 52: 1. - Andersson, C. A.; Bro, R J. Chemom. 17: Bader, M J. Chem. Educ. 57: Booksh, K. S.; Kowalski, B. R Anal. Chem. 66: 782A. - Bro, R Chemom. Intell. Lab. Syst. 38: Parfitt, K. (Ed.) Martindale: The Complete Drug Reference, Pharmaceutical Press, Londres. - Sena, M. M.; Trevisan, M. G.; Poppi, R. J Quim. Nova 28: Sena, M. M.; Trevisan, M. G.; Poppi, R. J Talanta 68:

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