Atividade antioxidante de três espécies de Eugenia (Myrtaceae)

Transcrição

1 Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm. 29 (3): (2010) Original Article Received: August 13, 2009 Accepted: October 9, 2009 Atividade antioxidante de três espécies de Eugenia (Myrtaceae) Michele A. MAGINA 1, Andressa GILIOLI 2, Henrique H. MORESCO 2, Guilherme COLLA 2, Moacir G. PIZZOLATTI 2 & Inês M.C. BRIGHENTE * 2 1 Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Regional de Blumenau, Rua Antônio da Veiga, 140, Blumenau - SC, Brasil. 2 Laboratório de Química de Produtos Naturais, Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Trindade, , Florianópolis - SC, Brasil. RESUMO. A atividade antioxidante dos extratos vegetais de Eugenia brasiliensis, E. beaurepaireana e E. umbelliflora foi avaliada usando diferentes métodos: Determinação da ação sequestrante de radicais livres usando DPPH, determinação do potencial redutor e determinação do potencial inibidor da peroxidação lipídica. Foi correlacionado também a o conteúdo de fenólicos totais e de flavonóides contidos nestes extratos e frações com a atividade antioxidante. As espécies E. brasiliensis e E. beaurepaireana mostraram maior capacidade antioxidante em relação a todos os métodos utilizados. Estas espécies exibiram também maior teor de compostos fenólicos. Uma significante relação entre a atividade antioxidante e o conteúdo de fenólicos foi observado, indicando que estes compostos são os principais contribuintes para as propriedades antioxidantes nestas plantas. SUMMARY. Antioxidant Activity of Three Species of Eugenia (Myrtaceae). Extracts of Eugenia brasiliensis, E. beaurepaireana and E. umbelliflora were investigated for their antioxidant activity using DPPH, reducing potential and β-carotene-linoleate system. Total phenolics and flavonoids contents were also determined. E. brasiliensis and E. beaurepaireana showed the highest antioxidant capacities in all methods used. These species exhibited too the highest phenolic contents. A significant relationship between antioxidant capacity and total phenolic content was found, indicating that phenolic compounds are the major contributors to the antioxidant properties of these plants. INTRODUÇÃO Os efeitos de espécies oxidantes sobre o organismo tornaram-se alvo de interesse e intensa investigação científica, uma vez que a causa de uma série de patologias, incluindo câncer, doenças hepáticas, aterosclerose e envelhecimento, têm sido relacionada a estas espécies 1-3. Estes efeitos são resultantes da oxidação de componentes celulares, especialmente os ácidos graxos poliinsaturados, mediados principalmente por espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN), produzidas como parte do processo metabólico (de 2 a 5% do oxigênio respirado, por exemplo), e conhecidas genericamente como radicais livres 4. Os radicais gerados a partir do oxigênio (ERO), de maior importância no organismo, incluem o ânion superóxido (O 2 -), os radicais hidroxila (OH ), alcoxila (RO ) e peroxila (ROO ). O peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), o oxigênio singlete ( 1 O 2 ) e o ozônio (O 3 ), apesar de não serem radicais livres, podem induzir reações radicalares no organismo e por isso são considerados também como espécies reativas 5. Os radicais livres abstraem átomos de hidrogênios de lipídeos das membranas das células, ricas em ácidos graxos susceptíveis ao processo oxidativo, especialmente o ácido linoléico e o ácido araquidônico, iniciando o processo de peroxidação lipídica 6, que é um dos principais fatores causadores do estresse oxidativo e conseqüente morte celular 7. Os antioxidantes são substâncias que, numa concentração menor que ao do substrato oxidável, retardam o processo oxidativo, diminuindo PALAVRAS CHAVE: Atividade antioxidante, Conteúdo de flavonóides, DPPH, Eugenia spp., Fenólicos totais. KEY WORDS: Antioxidant activity, DPPH, Eugenia spp., Flavonoids content, Total phenolics. * Autor a quem correpondência deve ser enviada: ines@qmc.ufsc.br 376 ISSN

2 Latin American Journal of Pharmacy - 29 (3) a velocidade da reação de oxidação 8. Estes agentes podem ter vários mecanismos de ação, como a captação de radicais livres e a capacidade de reduzir íons metálicos ou intermediários do processo de peroxidação lipídica através da doação de elétrons 9. O gênero Eugenia compreende cerca de 400 espécies, sendo um dos maiores da famíla Myrtaceae 10. Várias espécies de Eugenia foram estudadas com vistas à determinação do seu potencial antioxidante, como é o caso de E. Caryophyllata 11,12, E. Jambolana 13-15, E. uniflora 16-18, E. elliptica 19, E. orbiculata 19, E. tinifolia 19, E. caryophyllus 20, e de E. brasiliensis (frutos) 21. E. brasiliensis, E. beaurepaireana e E. umbelliflora são nativas, encontradas nos estados de Santa Catarina, Paraná e em partes do sudeste brasileiro, E. umbelliflora também é encontrada no estado do Rio Grande do Sul. Essas espécies são utilizadas na medicina popular para tratamento de doenças como artrite, reumatismo e diabetes, porém ainda são poucos os estudos biológicos que comprovam a eficácia dos seus extratos 22. Por isso, neste trabalho foi avaliada a atividade antioxidante de extratos hidroalcoólicos das folhas e caules dessas três espécies e de suas respectivas frações obtidas do particionamento liquido-líquido. A atividade antioxidante foi investigada através do ensaio de captura de radicais livres usando DPPH, do ensaio que avalia o potencial redutor e do teste que determina o potencial inibidor da peroxidação lipidica correlacionando posteriormente estes resultados com o conteúdo de fenólicos e flavonóides contidos nos extratos e frações das três espécies de Eugenia. MATERIAIS E MÉTODOS O material vegetal (partes aéreas) utilizado no trabalho foi coletado nos municípios de Santo Amaro da Imperatriz-SC (Eugenia brasiliensis e Eugenia beaurepaireana) e Florianópolis-SC (Eugenia umbelliflora), entre os meses de julho e outubro de As amostras foram identificadas pelo Prof. Dr. Daniel de Barcellos Falkenberg, Departamento de Botânica, UFSC. As exsicatas foram depositadas no herbário FLOR do Departamento de Botânica, UFSC, sob os números 34675, e 17890, respectivamente. Os galhos e folhas secos e moídos das espécies foram macerados separadamente em etanol 70 % a temperatura ambiente durante 7 dias. Após a extração, os extratos foram filtrados e o procedimento foi repetido mais duas vezes. Os extratos resultantes de três macerações foram então reunidos e concentrados em evaporador rotatório sob pressão reduzida, em banho-maria com temperatura controlada de 60 C durante todo o procedimento. Estes extratos foram ressuspendidos em água e fracionados através de partição líquido-líquido, por solventes de diferentes polaridades, como hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol, para dar origem a frações de polaridade crescente. Determinação do teor de compostos fenólicos totais O teor de compostos fenólicos totais foi determinado utilizando o reativo de Folin-Ciocalteau, de acordo com o método descrito por Anagnostopoulou et al. 23. A 0,5 ml de uma solução teste (extratos e frações na concentração de 1000 ppm, diluídos em metanol), foram adicionados 5,0 ml de água destilada e 0,25 ml do reativo de Folin-Ciocalteau. Após 3 min, foi adicionado 1,0 ml da solução saturada de Na 2 CO 3, agitou-se e a solução descansou por 1 hora. As absorvâncias das soluções foram determinadas em espectrofotômetro a 725 nm. Como branco utilizou-se uma solução preparada conforme descrito acima, porém, sem a presença da solução teste. Foi construída uma curva de calibração com soluções padrão de ácido gálico, nas concentrações de 25 a 500 mg/ml, diluídas em metanol, para comparação (y = 5,51x + 1,77; r 2 = 0,999). Todos os testes foram realizados em triplicata. O teor de compostos fenólicos totais foi determinado em mg de ácido gálico (AG) por grama de extrato ou fração secos. Determinação do teor de flavonóides A determinação do teor de flavonóides foi realizado conforme método descrito por Woisky & Salatino 24. A 0,5 ml de uma solução teste (extratos e frações na concentração de 1000 ppm, diluídos em metanol), foram adicionados 2,5 ml de etanol e 0,5 ml de uma solução de AlCl 3 2 %. Após 1 h, as absorvâncias das soluções foram determinadas em espectrofotômetro a 415 nm. Como branco foi utilizado etanol. Foi construída uma curva de calibração com soluções padrão de quercetina nas concentrações de 1 a 100 µg/ml, diluídas em metanol, para comparação (y = 8,776x + 0,869; r 2 = 0,999). Todos os testes foram realizados em triplicata. O teor de flavonóides foi determinado em mg de quercetina (QE) por grama de extrato ou fração secos. Determinação da ação seqüestradora do radical livre DPPH O ensaio para a determinação da atividade 377

3 MAGINA M.A., GILIOLI A., MORESCO H.H., COLLA G., PIZZOLATTI M.G. & BRIGHENTE I.M.C. antioxidante utilizando o radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) baseia-se no método descrito por Cavin et al. 25, com algumas modificações. Uma solução de DPPH 0,004% foi adicionada à solução teste nas concentrações de 5 a 200 ppm. A absorvância das soluções foi observada em espectrofotômetro UV-VIS (517 nm) após 30 min. Através da leitura da absorvância de uma solução de DPPH (2 ml de solução 0,004%), acrescentado de 1 ml de MeOH, obteve-se a absorvância no tempo inicial. A cada uma das concentrações da solução teste em análise (1 ml) foram adicionados 2 ml de solução de DPPH, obtendo-se a absorvância de cada amostra nas diferentes concentrações. A absorvância de uma solução teste (1 ml) em metanol (2 ml), foi diminuida da absorvância das amostras analisadas, a fim de descontar a possível interferência do extrato nesse comprimento de onda. Os valores obtidos foram graficados na forma de % de decréscimo da absorbância de DPPH em função da concentração da solução teste, onde determinou-se a concentração necessária para diminuir a concentração do DPPH em 50% (concentração efetiva 50% - CE 50 ) para as soluções testadas. Determinação do potencial redutor O ensaio para a análise da atividade antioxidante através da determinação do potencial redutor baseia-se no método de Price & Butler, proposto por Waterman & Mole 26, com adaptações. A 100 µl das soluções teste (extratos brutos e frações, diluídos em metanol, na concentração de 1000 ppm) foram adicionados 8,5 ml de água deionizada. Adicionou-se então 1,0 ml da solução de FeCl 3 0,1 M, e após 3 min, 1,0 ml da solução de ferricianeto de potássio 0,08 M. Misturou-se. Após 15 min, foi realizada a leitura da absorvância da solução em espectrofotômetro a 720 nm. A análise foi feita em triplicata. Como branco, foi utilizada uma solução preparada conforme o procedimento acima, sem a adição da amostra. Foi realizada uma curva de calibração utilizando soluções padrões de ácido ascórbico nas concentrações de 100 a 1000 ppm (y = 0,0015x + 0,124; r 2 = 0,999). O potencial redutor das amostras foi expresso em mg de ácido ascórbico (AA) por g de amostra. Determinação do potencial inibidor da peroxidação lipídica A inibição da peroxidação lipídica foi avaliada através do modelo β-caroteno-ácido linoléico 27. Uma emulsão foi preparada com 3,0 mg de β-caroteno, 1,0 ml de CHCl 3, 45 mg de ácido linoléico e 215 mg de tween-80. O clorofórmio foi removido em evaporador rotatório, durante 4 min, sob temperatura de 45 C. À mistura resultante foram adicionadas 6,0 ml de água destilada, sob agitação, para fazer a emulsão. A emulsão foi então dissolvida para 100 ml com peróxido de hidrogênio 0,01 M. Alíquotas desta emulsão (4,0 ml) foram adicionadas à tubos contendo 0,2 ml das soluções teste (extratos e frações na concentração de 1000 ppm, dissolvidas em metanol). Como controle positivo foi utilizado uma solução de BHT (2,6-diterc-butil- 4-hidroxitolueno) na concentração de 1000 ppm. Um controle negativo, contendo 0,2 ml de metanol e 4,0 ml da emulsão acima também foi preparado. Todos os tubos foram colocados em banho-maria, a 50 C, e as absorvâncias das soluções foram determinadas no tempo zero, e a cada 30 min, em espectrofotômetro a 470 nm, até a descoloração do tubo contendo o controle negativo (180 min). Como branco, foi utilizada uma emulsão preparada como descrito acima, porém sem a presença de β-caroteno. A atividade antioxidante (potencial inibidor da peroxidação lipídica, em porcentagem IPL %) foi calculada através da seguinte fórmula IPL: (%) = 100 [1 (A 0 A t ) / (A 0 0 A 0 t)]; Onde: A 0 e A t são as absorvância da amostra no tempo zero e após 180 min, respectivamente e A 0 0 e A 0 t são as absorvância do controle negativo no tempo zero e após 180 min. RESULTADOS E DISCUSSÃO A atividade antioxidante está geralmente relacionada à quantidade de compostos fenólicos nas plantas, desta forma o teor destes compostos foi determinado nos extratos e frações estudadas. Numerosos estudos demonstram que os fenólicos possuem alta capacidade antioxidante, especialmente os catecóis 28. Estudos mostraram que classes destes compostos em vegetais, como por exemplo, os taninos, exibem ainda potencial redutor sobre íons metálicos. A inibição da peroxidação lipídica também foi colocada como uma das mais importantes atividades exibidas por estes compostos 29. A avaliação do conteúdo de compostos fenólicos totais utiliza o reagente de Folin-Ciocalteau que forma complexos de coloração azul na presença de agentes redutores 26,30. Os flavonóides são uma classe de metabólitos secundários vegetais, de natureza fenólica, que possuem notável capacidade antioxidante. Para a determinação do teor de flavonóides nos extratos e frações vegetais utilizou-se a complexação com cloreto de alumínio (AlCl 3 ). Este rea- 378

4 Latin American Journal of Pharmacy - 29 (3) gente forma um quelato com as hidroxilas fenólicas e com o grupo cetônico nos flavonóides, proporcionando um deslocamento batocrômico das bandas de absorvâncias do espectro de UV/VIS para uma região característica 31. O teor de fenólicos e de flavonóides nos extratos e frações das três espécies de Eugenia pode ser observado na Tabela 1. Quando maior a quantidade de ácido gálico encontrada em equivalente por g de extrato ou fração, maior a Material Fenólicos a Flavonóides b P. redutor c DPPH d IPL e mg AG/g mg QE/g mg AA/g CE50 g/ml (%) E. brasiliensis folhas Extrato bruto 162,6 ± 3,3 14,4 ± 1,1 318,3 ± 0,7 27,60 57,7 ± 0,3 Fr. hexano 48,5 ± 0,9 35,2 ± 1,5 12,7 ± 0,1 459,31 61,0 ± 0,4 Fr. DCM 85,9 ± 1,8 24,7 ± 0,1 153,3 ± 1,5 136,90 42,9 ± 0,1 Fr. AcOEt 494,5 ± 1,2 54,1 ± 0,1 835,0 ± 0,4 14,70 52,0 ± 0,2 Fr. BuOH 461,6 ± 2,1 12,4 ± 0,2 790,7 ± 0,7 6,20 54,3 ± 0,3 Fr. Aquosa 205,8 ± 0,5 2,9 ± 0,1 553,7 ± 0,9 21,60 60,8 ± 0,4 E. brasiliensis caules Extrato bruto 174,4 ± 1,6 5,8 ± 0,1 544,3 ± 1,8 19,90 46,4 ± 0,2 Fr. hexano 51,3 ± 1,4 25,4 ± 1,8 0,0 613,21 47,7 ± 0,3 Fr. DCM 116,3 ± 1,2 9,1 ± 0,1 286,7 ± 1,3 186,62 57,5 ± 0,1 Fr. AcOEt 328,1 ± 2,1 33,9 ± 0,8 1119,7 ± 3,3 8,80 59,2 ± 0,3 Fr. BuOH 286,0 ± 1,9 18,9 ± 0,3 756,7 ± 0,4 15,61 57,1 ± 0,5 Fr. Aquosa 249,4 ± 2,8 16,6 ± 0,6 1595,7 ± 3,9 14,60 59,7 ± 0,4 E. beaurepaireana folhas Extrato bruto 138,0 ± 2,7 31,2 ± 1,7 473,3 ± 1,7 18,00 67,2 ± 0,1 Fr. hexano 40,9 ± 0,8 21,1 ± 0,4 0,0 841,22 38,4 ± 0,3 Fr. DCM 127,0 ± 1,5 63,5 ± 0,6 309,3 ± 1,6 27,31 66,1 ± 0,2 Fr. AcOEt 321,0 ± 5,6 114,6 ± 0,8 1293,0 ± 1,4 10,30 87,1 ± 0,4 Fr. BuOH 166,2 ± 3,1 18,8 ± 0,1 571,7 ± 0,9 22,20 91,1 ± 0,2 Fr. Aquosa 288,0 ± 2,4 24,0 ± 0,1 954,0 ± 0,7 12,41 97,8 ± 0,3 E. beaurepaireana caules Extrato bruto 225,4 ± 2,6 10,5 ± 0,4 625,7 ± 1,2 12,61 61,7 ± 0,2 Fr. hexano 32,2 ± 2,6 68,4 ± 0,3 0,0 225,11 23,3 ± 0,1 Fr. DCM 136,3 ± 2,6 25,7 ± 0,4 435,7 ± 2,3 25,40 46,4 ± 0,3 Fr. AcOEt 306,5 ± 2,5 27,6 ± 0,8 791,0 ± 4,3 12,00 56,4 ± 0,4 Fr. BuOH 226,5 ± 2,2 18,3 ± 0,6 681,0 ± 3,4 12,50 49,9 ± 0,3 Fr. Aquosa 111,9 ± 2,8 15,0 ± 0,3 268,0 ± 3,9 45,60 34,0 ± 0,1 E. umbelliflora folhas Extrato bruto 128,1 ± 2,9 10,4 ± 1,1 154,7 ± 0,5 39,70 32,8 ± 0,1 Fr. hexano 77,7± 0,4 0,2 ± 0,0 0,0 361,11 53,6 ± 0,1 Fr. DCM 62,9 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,0 199,30 39,3 ± 0,2 Fr. AcOEt 115,7 ± 3,6 32,8 ± 0,8 301,7 ± 0,6 31,10 55,3 ± 0,3 Fr. BuOH 363,6 ± 0,3 61,2 ± 0,7 654,7 ± 0,9 15,20 23,1 ± 0,1 Fr. Aquosa 181,1 ± 1,4 24,6 ± 0,2 431,2 ± 1,1 29,00 25,2 ± 0,1 E. umbelliflora caules Extrato bruto 105,8 ± 2,6 1,3 ± 0,2 124,3 ± 1,1 52,20 17,5 ± 0,1 Fr. hexano 41,8 ± 0,7 0,9 ± 0,0 0,0 167,70 21,5 ± 0,2 Fr. DCM 57,8 ± 3,9 0,2 ± 0,0 0,0 201,70 13,7 ± 0,1 Fr. AcOEt 78,0 ± 0,5 1,9 ± 0,1 284,0 ± 2,3 51,10 21,7 ± 0,2 Fr. BuOH 262,3 ± 1,3 8,5 ± 0,2 624,0 ± 1,4 23,20 25,2 ± 0,1 Fr. Aquosa 80,5 ± 0,6 9,7 ± 0,4 372,7 ± 2,9 123,70 23,9 ± 0,2 Tabela 1. Avaliação quantitativa do teor de fenólicos e de flavonóides e atividade antioxidante dos extratos brutos e frações de folhas e caules de E. brasiliensis, E. beaurepaireana e E. umbelliflora. a Fenólicos totais (mg AG/g) mg de ácido gálico/g de amostra; b Teor de flavonóides (mg QE/g) mg de quercetina/g de amostra; c Potencial redutor (mg AA/g) mg de ácido ascórbico/g de amostra; d CE 50 : Concentração efetiva 50%; e Inibição da peroxidação lipídica; DCM = diclorometano; AcOEt = Acetato de etila; BuOH = butanol. 379

5 MAGINA M.A., GILIOLI A., MORESCO H.H., COLLA G., PIZZOLATTI M.G. & BRIGHENTE I.M.C. porcentagem de compostos fenólicos presentes. É importante esclarecer que, apesar do resultado ser expresso em equivalentes de ácido gálico, um composto fenólico simples, a metodologia não apresenta seletividade para subtipos de compostos fenólicos vegetais, e podem ser detectados no teste, além de flavonóides, catequinas, compostos fenólicos simples e seus polímeros, como os taninos hidrolisáveis, dentre outras substâncias. Para este teste, pode-se verificar que o extrato bruto do caule de Eugenia brasiliensis e E. beaurepaireana apresentou maior conteúdo de compostos fenólicos quando comparado ao extrato das folhas, porém, de uma maneira geral, as frações obtidas das folhas apresentam a maior quantidade de compostos fenólicos, especialmente a fração acetato de etila. Já para a E. umbelliflora, o extrato bruto das folhas apresentou maior conteúdo de compostos fenólicos em relação ao extrato bruto do caule, sendo a fração butanólica a mais concentrada em compostos fenólicos, tanto nas folhas quanto nos caules, o que pode indicar o aumento da polaridade dos compostos fenólicos desta espécie em relação às duas anteriores. Observam-se, em todos os extratos estudados, que as frações mais concentradas em compostos fenólicos são as frações acetato de etila e butanólica, o que é esperado quando se realiza o fracionamento líquido-líquido com solventes de polaridade crescente. A Tabela 1 mostra os resultados para a determinação do teor de flavonóides nas amostras vegetais. Quanto maior o equivalente em quercetina (mg QE/g) encontrado nos extratos e frações testados, maior a porcentagem de flavonóides. A espécie Eugenia beaurepaireana possui um maior teor de flavonóides, especialmente na fração acetato de etila das folhas. As espécies E. brasiliensis e E. umbelliflora apresentaram teores menores de flavonóides, os quais estão concentrados na fração acetato de etila das folhas para E. brasiliensis e na fração butanólica das folhas para E. umbelliflora. Pode-se observar ainda que os teores de flavonóides são maiores nas frações das folhas, em relação às frações obtidas com o extrato dos caules. Este fato é esperado, pois uma das principais funções deste grupo de compostos é proteger os vegetais contra os raios ultravioleta. Como as folhas constituem as partes aéreas dos vegetais são, portanto, alvo mais fácil deste tipo de radiação, quando comparadas ao caule 31. O ensaio utilizando DPPH avalia a capacidade seqüestrante de radicais livres da amostra analisada. O radical livre DPPH é relativamente estável e sua ação sequestrante deve-se à abstração de um radical hidrogênio de compostos presentes nos extratos e frações, geralmente fenólicos. O DPPH possui forte coloração arroxeada, e ao se reduzir, modifica sua coloração para amarelo, sendo esta mudança de cor monitorada pelo espectrofotômetro UV-VIS a 517 nm. A modificação da coloração permite avaliar o desaparecimento do radical livre DPPH em solução devido á formação de espécies mais estáveis 32. A capacidade de reduzir íons metálicos ou intermediários do processo de peroxidação lipídica, através da doação de elétrons, é caracterizada como potencial redutor de uma amostra 33. O ensaio para a avaliação do potencial redutor baseia-se no fato de que, quando o íon fenolato, presente nos compostos e extratos vegetais é oxidado, os íons férricos, adicionados à solução na forma de FeCl 3, são reduzidos para íons ferrosos, e detectados a partir da formação de um complexo azul (Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 ) com o reagente ferricianeto de potássio 26. Os resultados dos testes para detectar atividade antioxidante em extratos e frações das três espécies de Eugenia estão demonstrados na Tabela 1. De acordo com os resultados obtidos, pode-se verificar que os extratos e frações das espécies testadas apresentam um grande potencial antioxidante. Observa-se que a fração butanólica das folhas de E. brasiliensis apresenta a maior capacidade de captação de radicais livres, seguida da fração acetato de etila do caule da mesma espécie. Os valores obtidos equiparamse ao valor de CE 50 do ácido ascórbico. Nas outras espécies, as frações com maior capacidade antioxidante foram as frações acetato de etila de E. beaurepaireana e a fração butanólica de E. umbelliflora. A Tabela 1 apresenta os resultados do ensaio para a determinação do potencial redutor. Valores maiores significam maior capacidade redutora, quando comparado ao ácido ascórbico. Observa-se que a espécie E. beaurepaireana apresentou maior capacidade redutora, sendo a fração mais ativa, tanto nas folhas quanto no caule, a acetato de etila. Para E. brasiliensis as frações mais ativas foram a acetato de etila das folhas e a fração aquosa do caule. E. umbelliflora mostrou a menor atividade das plantas em estudo, resultado também apresentado quando avaliada em relação a capacidade sequestrante do radical livre DPPH. 380

6 Latin American Journal of Pharmacy - 29 (3) Ao comparar os resultados obtidos no ensaio com DPPH com a quantidade de fenóis e flavonóides, percebe-se que existe uma maior correlação entre os valores de CE 50 para a atividade seqüestradora de radicais livres com o conteúdo de compostos fenólicos do que com o conteúdo de flavonóides presentes nas amostras vegetais. A correlação linear entre a quantidade de compostos fenólicos e os valores de CE 50 apresentou coeficientes da ordem de 64,5, 65,3 e 57,7% para os extratos e frações das folhas de E. brasiliensis, E. beaurepaireana e E. umbelliflora, respectivamente. Esta correlação, quando feita com os extratos e frações dos caules das três espécies de Eugenia, apresentou coeficientes de 88,5, 62,0 e 70,5% para os extratos e frações citados acima, respectivamente. De fato, a literatura atribui aos compostos fenólicos a atividade antioxidante de extratos vegetais. Porém, a mesma relação não se mantém quando se correlacionam a capacidade sequestrante do DPPH com a quantidade de flavonóides presentes no extrato e frações. Da mesma maneira que a capacidade sequestrante do radical livre DPPH, o potencial redutor dos extratos e frações aumenta proporcionalmente conforme o conteúdo de fenólicos aumenta. Uma análise por regressão linear mostra que os coeficientes de correlação ficaram entre 85,2 e 97,3% para extratos e frações das folhas e entre 64,6 e 96,1% para os extratos e frações dos caules das três espécies testadas. Mas assim como descrito anteriormente para o ensaio do DPPH, esta relação não se observa quando se correlacionam os resultados do ensaio de potencial redutor destas mesmas amostras com o seu conteúdo de flavonóides. A exceção para este caso é a correlação entre o teor de flavonóides e o potencial redutor dos extratos e frações de Eugenia umbelliflora, que mostraram coeficientes de correlação de 91,7 e 73,1% para extratos e frações das folhas e caules, respectivamente. A mesma correlação, quando realizada com E. beaurepaireana apresenta coeficientes bem menores, enquanto que para E. brasiliensis não foi observada qualquer correlação. Ao observar estes resultados, conclui-se que o conteúdo de compostos fenólicos está diretamente relacionado aos resultados positivos de atividade antioxidante demonstrados nestes dois ensaios, enquanto o teor de flavonóides contribui em alguns casos. Outro método usado para a determinação da atividade antioxidante é a utilização do sistema β-caroteno ácido linoléico. Este ensaio é baseado em reações de oxi-redução, onde agentes oxidantes como o peróxido de hidrogênio, que ao atacarem substratos lipídicos, ácido linoléico neste caso, dão origem á produtos de oxidação que induzem a descoloração do β-caroteno, que pode ser avaliada através da determinação da absorvância da solução em espectrofotômetro UV-VIS em 470 nm. A adição de agentes antioxidantes inibe estas reações, mantendo a cor do β-caroteno, conseqüentemente a absorvância da solução estável. Soluções com a presença de antioxidantes, como o BHT (controle positivo) e ausência de antioxidantes (controle negativo), bem como soluções contendo as amostras a serem testadas são incubadas e suas absorvâncias são determinadas a cada 30 min, até 180 min, onde é avaliado o desaparecimento ou não da coloração do β-caroteno, em relação ao controle negativo. O método é amplamente usado para a avaliação da capacidade antioxidante de extratos vegetais 34. A Tabela 1 apresenta os dados da inibição do processo de peroxidação lipídica por parte dos extratos e frações estudados. Os resultados estão expressos em porcentagem de inibição da peroxidação lipídica (descoloração do β-caroteno) em relação à solução sem a presença de antioxidantes, calculados a partir dos dados de absorvância no tempo de 180 min. Maiores valores significam maiores potenciais inibidores da reação de peroxidação lipídica e conseqüentemente inibição da descoloração do β-caroteno. Os resultados deste ensaio mostram de uma maneira geral que as substâncias antioxidantes dos extratos estão localizadas em maiores quantidades nas folhas do que no caule das espécies estudadas. Dentre os extratos brutos das espécies testadas, o extrato das folhas de Eugenia beaurepaireana demonstrou maior poder antioxidante, seguido pelo extrato das folhas de E. brasiliensis e pelo extrato das folhas de E. umbelliflora. Dentre as frações mais ativas, encontra-se a fração aquosa e butanólica das folhas de E. beaurepaireana, mostrando atividade antioxidante comparável ao controle positivo utilizado no ensaio, o butilhidroxitolueno (BHT). Para E. brasiliensis, as frações hexânica e aquosa das folhas foram as mais ativas. A espécie E. umbelliflora foi novamente a menos ativa nos ensaios antioxidantes, mostrando resultados concordantes com os outros testes anteriormente realizados. Suas frações mais ativas foram a acetato de etila e hexânica das folhas. Verificou-se que a maior atividade antioxidante não se concentrou apenas nas frações de maior polaridade, como nos outros ensaios, mas sim distribuiu-se em frações de polaridades diferentes. 381

7 MAGINA M.A., GILIOLI A., MORESCO H.H., COLLA G., PIZZOLATTI M.G. & BRIGHENTE I.M.C. CONCLUSÃO A atividade antioxidante dos extratos e frações das três espécies foi avaliada, juntamente com o seu conteúdo de fenólicos e flavonóides. Nos testes de avaliação da captação do radical livre DPPH e de avaliação do potencial redutor foi observada uma tendência no aumento da atividade diretamente relacionada ao aumento do conteúdo de fenóis nos extratos e frações. Para o teste de inibição da peroxidação lipídica, os resultados foram mais bem distribuídos entre as frações, sendo mais ativas as frações mais polares das folhas de E. beaurepaireana. Portanto, através destes ensaios pode-se verificar que os extratos e frações, principalmente das folhas, das espécies de Eugenia testadas apresentam uma atividade antioxidante bastante interessante, diretamente relacionada com substâncias fenólicas produzidas a partir do seu metabolismo secundário. Agradecimentos. Ao Prof. Daniel de Barcellos Falkenberg, do Departamento de Botânica UFSC, pela identificação botânica das espécies. REFERÊNCIAS 1. Chisolm, GM & D. Steinberg (2000) Free Radical Bio. Med. 28: Halliwell, B. (2006) J. Neurochem. 97: Halliwell, B. (2007) Biochem. J. 401: Urso, ML & PM Clarkson (2003) Toxicology 189: Patel, RP, J. McAndrew, H. Sellak, CR White, H. Jo, BA Freeman & VM Darley-Usmar (1999) Bioquim. Biophys. Acta 1411: Gao, J., K. Igarashi & M. Nukina (2000) Chem. Pharm. Bull. 48: Lima, ES & DSP Abdalla (2001) Rev. Bras. Ciênc. Farm. 37: Halliwell, B., R. Aeschbach, J. Löliger & OI Aruoma (1995) Food Chem. Toxicol. 33: Yen, GC & HY Chen (1995) J. Agric. Food Chem. 43: Fontenelle, GB, CG Costa & RD Machado (1994) Bot. J. Linn. Soc. 115: Hong, NH (2003) Crop Prot. 22: Gülçin, I., GSS Beydemir, M. Elmasta & Ö. Küfrevioglu (2004) Food Chem. 87: Ravi, K., B. Ramachandran & S. Subramanian (2004) Life Sci. 75: Sultana, B., F. Anwar & R. Przybylski (2007) Food Chem. 104: Sharma, B., G. Viswanath, R. Salunke & P. Roy (2008) Food Chem. 110: Schmeda-Hirschman, G., C. Theoduloz, L. Franco, E. Ferro & AR De Arias (1987) J. Ethnopharmacol. 21: Velázquez, E., HA Tournier, P. Mordujovich, G. Saavedra & GR Schinella (2003) Fitoterapia 74: Einbond, LS, KA Reynertson, X-D Luo, MJ Basile & EJ Kennelly (2004) Food Chem. 84: Neergheen, VS, MA Soobrattee, T. Bahorun & OI Aruoma (2006) J. Plant Physiol. 163: Dudonné, S., X. Vitrac, P. Coutiére, M. Woillez & J-M Mérillon (2009) J. Agric. Food Chem. 57: Reynertson, KA, H. Yang, B. Jiang, MJ Basile & EJ Kennelly (2008) Food Chem. 109: Revilla, J. Plantas úteis da bacia amazônica (2002) Rio de Janeiro: Inpa, v. 44 p. 23. Anagnostopoulou, M., P. Kefalas, VP Papageorgiou, AN Assimopoulou & D. Boskou (2006) Food Chem. 94: Woisky, RG & A. Salatino (1998) J. Apic. Res. 37: Cavin, A., K. Hostettmann, W. Dyatmyko & O. Potterat (1998) Planta Med. 64: Waterman, P.G. & S. Mole (1994) Analysis of phenolic plant metabolites. Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp Mokbel, MS & F. Hashinaga (2006) Food Chem. 94: Tuck, KL & PJ Hayball (2002) J. Nutr. Biochem. 13: Okuda, T., T. Yoshida, T. Hatano, K. Yakazi & M. Ashida (1982) Phytochemistry 21: Sousa, CMM, HR Silva, GM Vieira-Jr, MCC Ayres, CLS Costa, DS Araújo, LCD Cavalcante, EDS Barros, PBM Araújo, MS Brandão & MH Chaves (2007) Quím. Nova 30: Zuanazzi, J.A.S. & J.A. Montanha (2003) Flavonóides em Farmacognosia: da planta ao medicamento, (C.M.O. Simões, E.P. Schenkel, G. Gosmann, J.C.P. Mello, L.A. Mentz, P.R. Petrovick, eds.) Ed. UFRGS/Ed. UFSC: Porto Alegre/Florianópolis, 5 a ed. pp Lugasi, A., E. Dworschak, A. Blazovics & A. Kery (1998) Phytother. Res. 12: Yen, GC & HYJ Chen (2005) J. Agric. Food Chem. 53: Silva, FAM, MFM Borges & MA Ferreira (1999) Quím. Nova 22: